專利名稱：聚合物鍵合的紫杉醇衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的聚合物鍵合的紫杉醇與聚合物鍵合的紫杉醇衍生物及它們的制備方法，并涉及含這類物質(zhì)的藥物組合物。
紫杉醇是二萜類紫杉烷(taxane)族中的一員，可從短葉紫杉樹皮的提取物中分離并鑒定，紫杉醇的其它類似物也是已知的，可由漿果紫杉的針狀體中提取的10-脫乙?；仙纪あ鬄樵辖?jīng)半合成方法制備，(見Wain等，JACS，93，2325，(1971)和Lovelle等，Proc.Am.Assoc.CancerRes.，31P.417，(1990)。)這些化合物已顯示出強(qiáng)效的抗腫瘤活性，但它們?cè)谒腥芙鈽O微并在以CremophorEL(商品名)為載體經(jīng)注射或靜脈滴注給藥時(shí)會(huì)產(chǎn)生某些毒副作用。
本發(fā)明提供一種主要含有下述組成的式Ⅰ聚合物軛合物，其中90-99.9mol%由下式代表的單元構(gòu)成
0.1-5mol%由下式代表的單元構(gòu)成
其中R1和R2之一是下式共聚物殘基
另一個(gè)是氫原子;
0-9.9mol%由下式所代表的單元構(gòu)成
其中R是苯基或叔丁氧基，R3是氫或乙酰基，A和A1可以是相同的或不相同的，它們代表化學(xué)單鍵、氨基酸殘基或肽間隔基團(tuán)，該肽間隔基團(tuán)可選自βAla，Gly，Phe-Gly，Phe-Phe-，Leu-Gly，Val-Ala，Phe-Ala，Leu-Phe，Leu-Ala，Phe-Leu-Gly，Phe-Phe-Leu，Leu-Leu-Gly，Phe-Tyr-Ala，Phe-Gly-Phe，Phe-Phe-Gly，Phe-Leu-Gly-Phe，Gly-Phe-Leu-Gly-Phe，Gly-βAla，Phe-Gly-βAla，Phe-Phe-βAla，Leu-Gly-βAla，Val-Ala-βAla，Phe-Ala-βAla，Leu-Phe-βAla，Leu-Gly-βAla，Phe-Leu-Gly-βAla，Phe-Phe-Leu-βAla，Leu-Leu-Gly-βAla，Phe-Tyr-Ala-βAla，Phe-Gly-Phe-βAla，Phe-Phe-Gly-βAla，Phe-Leu-Gly-Phe-βAla或Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-βAla.
更為特別的是本發(fā)明提供的紫杉醇及紫杉醇衍生物的聚合物軛合物具有較好的水溶性和降低的毒性。
含紫杉醇和紫杉醇衍生物單元的mol%優(yōu)選為0.5-2%，在聚合物中紫杉醇的更優(yōu)選含量為2-10%(w/w)，最優(yōu)選的化合物的特征在于含4-7%(w/w)。波浪線表示連接在紫杉醇結(jié)構(gòu)的7位上的氧可以是兩種構(gòu)型即β型(天然的)或α型。
優(yōu)選的R代表苯基，R3是乙酰基，A是苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸或苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-β丙氨酸的殘基。所有氨基酸殘基都具有天然的L構(gòu)型。根據(jù)優(yōu)選的具體化實(shí)施例，聚合物軛合物是一種由1-甲基丙烯?；被?2-羥基丙烷，(甲基丙烯酰甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰甘氨?；?3-氨基-2-羥基丙烷和2′-(甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰-β丙氨酰基)紫杉醇組成的共聚物。
w/w百分含量是經(jīng)酶水解后用HPLC法測(cè)定的，該方法與CancerTreatmentRep.71(1)，(1987)P.53-59中所述相類似。
酶水解作用向1ml小鼠或人的血漿中加入不同濃度的聚合物鍵合紫杉醇并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(24、48、72、96小時(shí))收集100μl，貯藏在-70℃的環(huán)境中直到作進(jìn)一步的處理。
萃取方法向試樣加入75μl 0.5M磷酸四丁基銨(TBAP)，1250μlCH3CN和150μl 5M NaCl并在4℃下強(qiáng)烈振蕩20分鐘進(jìn)行樣品抽提。然后將試樣在離心機(jī)15000×g下離心10分鐘，收集上清液并高真空蒸發(fā)。加入500μl MeOH∶H2O(75∶25v/v)回收樣品，注入HPLC中測(cè)定總的紫杉醇的百分含量。
HPLC系統(tǒng)色譜柱Nova Pak C18(Waters)3.9×300mm流速1.5ml/m檢測(cè)器UV231nm注樣量20μl流動(dòng)相57.5%pH為2的水，42.5%CH3CN本發(fā)明還提供一種供制備聚合物軛合物的方法，該法包括式Ⅱ化合物與一種活化的聚合物的反應(yīng)
其中A2和A3中之一是化學(xué)鍵，另一個(gè)是A，且A、R和R3如前所限定的，該活化的聚合物主要由90-99.9mol%由下式所代表的單元構(gòu)成
10-0.1mol%由下式所代表的單元所組成，
其中A1如前所規(guī)定的。然后用2-羥基丙胺處理生成的聚合物軛合物。式Ⅱ化合物與活化的聚合物之間的反應(yīng)優(yōu)選是在無水的極性有機(jī)溶劑(如二甲亞砜或二甲基甲酰胺)中并任選的在有機(jī)堿或無機(jī)堿(如堿金屬碳酸鹽、二甲基氨基吡啶或三乙胺)存在下進(jìn)行。通常，反應(yīng)完成需1-24小時(shí)。
反應(yīng)通常在15-40℃下進(jìn)行，優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。堿性碳酸鹽例如是堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽。
某些式Ⅱ原料化合物是已知的一些化合物，即紫杉醇或紫杉醇的類似物或是由已知化合物制備的。例如7-表衍生物可以在堿存在下(Na2CO3或二氮雜雙環(huán)十一碳烯)在甲苯中回流紫杉醇或它的類似物的方法制備。
式Ⅱ的另外一些化合物是新的，特別是那些A3是β丙氨酸殘基及那些A2或A3代表如上述對(duì)A所規(guī)定的二、三或四肽間隔基團(tuán)也是本發(fā)明的范圍。
式Ⅱ化合物(其中A2不是化學(xué)單鍵)可通過由紫杉醇或紫杉醇類似物在縮合劑存在下并在有或沒有外加催化劑的條件下與經(jīng)保護(hù)了的氨基酸或肽反應(yīng)來制備，優(yōu)選在室溫下反應(yīng)，然后用已知的方法除去保護(hù)基團(tuán)。
也可用活化了的酯(如肽或氨基酸的對(duì)硝基苯基酯)進(jìn)行縮合反應(yīng)。適宜的縮合劑包括碳化二亞胺如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。
適宜的催化劑包括4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、吡啶或三乙胺。
各種已知的保護(hù)氨基的基團(tuán)可被采用，市售的已保護(hù)的氨基酸或肽可作為原料。用t-BOC、三苯甲游基、FMOC或芐氧羰基(CBZ)保護(hù)的氨基酸或肽可被采用。用t-BOC、三苯甲游基或FMOC基團(tuán)保護(hù)的氨基酸或肽是優(yōu)選的。
式Ⅱ化合物(其中A3不是化學(xué)單鍵)可通過下述方法制備，先保護(hù)或封閉2′位羥基，接著酯化7位羥基，然后除去2′位的保護(hù)或封閉基團(tuán)。
更優(yōu)選的是，式Ⅱ化合物(其中A3是甘氨酸或β丙氨酸殘基)可通過紫杉醇與2-3當(dāng)量的N-保護(hù)的氨基酸反應(yīng)生成2′，7二取代紫杉醇，將2′位氨基酸裂解然后將7位氨基酸脫保護(hù)。
紫杉醇與經(jīng)保護(hù)的氨基酸的反應(yīng)，如上所述的是在有縮合劑及催化劑存在下進(jìn)行的。
2′-氨基酸的裂解是通過調(diào)節(jié)2′-7-(氨基酸)紫杉醇溶液的pH至7-7.4來實(shí)現(xiàn)的，例如2′-7-二(氨基酸)紫杉醇與pH為7-7.4的磷酸鹽緩沖液混合或用稍過量的NaHCO3調(diào)節(jié)pH。
氨基酸的脫保護(hù)作用是以已知的氨基酸脫保護(hù)方法進(jìn)行的，例如用溫合的酸(如乙酸)處理或用還原法。
因此，例如，紫杉醇能與2-3摩爾等當(dāng)量的N-保護(hù)的氨基酸(用t-BOC、CBZ或FMOC保護(hù)的)在二氯甲烷中有DCC和催化量的4-二甲氨基吡啶存在下反應(yīng)。在此方法中，經(jīng)保護(hù)的氨基酸被引入到2′及7位置上。紫杉醇的2′、7-雙氨基酸衍生物可在NaHCO3存在下于H2O/MeOH中放置2-5小時(shí)，從而在2′位置上發(fā)生選擇性脫保護(hù)并生成紫杉醇的7位取代衍生物?？捎眠m當(dāng)?shù)拿摫Ｗo(hù)劑(如酸、弱堿或氫解)除去保護(hù)基團(tuán)。
如US-A-4062831和US-A-4097470中所描述的活化的聚合物是一種合成的、水溶性聚合物，它是由N′-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺與N-甲基丙烯?；央牡膶?duì)硝基苯基酯共聚而制備的。
式Ⅰ與式Ⅱ新的紫杉醇衍生物的聚合物軛合物具有良好的水溶性，生物兼容性，并能在血漿中釋放紫杉醇或紫杉醇衍生物，或者通過寡肽間隔基團(tuán)的裂解內(nèi)在化后將紫杉醇或紫杉醇的衍生物釋放到細(xì)胞中。
生物活性微管聚集和解聚試驗(yàn)小牛微腦管蛋白用聚集一解聚雙循環(huán)法(Shelanski M.L.，Gaskin F.and Cantor C.R.Proc，Natl，Acad Sci.U.S.A.70，765-768，1973)制備，并于MAB中(0.1M MES.2.5mM EGTA，0.5mM MgSO4、0.1mM ED-TA、0.1mM DTT pH6.4)保存于液氮中。
所有實(shí)驗(yàn)用的蛋白質(zhì)的貯存期少于4周。
每次實(shí)驗(yàn)前，微管蛋白在4℃下保持30分鐘。
聚集是用Gaskin等提出的方法測(cè)定(GaskinF.CantorC.R.ShelanskiM.L，J.Molec.Biol89，737-758，(1974)。含微管蛋白(1mg/ml)和1mMGTP的樣品池(光徑長(zhǎng)1cm)調(diào)整至37℃，并在配置有自動(dòng)記錄儀和恒溫控制樣品室裝置的Perkin-Elmer557雙波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)上連續(xù)測(cè)定在340nm處的濁度。
30分鐘后加入4mM CaCl2并以10分鐘濁度的降低來量度其解聚作用。每隔15分鐘加入所試驗(yàn)化合物的分級(jí)劑量并測(cè)定其濁度的變化。所得數(shù)據(jù)用由于加入所試化合物引起的再聚合百分率來表示，結(jié)果列于表1。
離體的藥物敏感性試驗(yàn)將指數(shù)增殖的B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞(2×104/ml)接種在添加有10%熱失活胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中置于24個(gè)井形培養(yǎng)板中(Costar)。接種后立即加入分級(jí)濃度的所試驗(yàn)化合物，72小時(shí)溫育后用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞來評(píng)價(jià)化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。對(duì)每一濃度的受試化合物進(jìn)行三次重復(fù)培養(yǎng)。所試化合物的抗增殖活性由劑量-效應(yīng)曲線來計(jì)算和以IC50(受處理的培養(yǎng)物相對(duì)于未處理對(duì)照組，使50%細(xì)胞增長(zhǎng)受到抑制的劑量)來表示，結(jié)果列于表1。
表1
以實(shí)施例6制備的共聚物-紫杉醇與紫杉醇比較對(duì)B16-F10小鼠黑色素瘤的在體試驗(yàn)小鼠C57B16雌性小鼠來自意大利CharlesRiver。
開始實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物為8-10周齡。
藥物由于有限的水溶解性，將紫杉醇溶解于由50%聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEl)和50%乙醇組成的載體中，然后用5%葡萄糖溶液稀釋至所需濃度。溶液稍有混濁，短時(shí)間后可觀察到沉淀形成。實(shí)施例6的化合物易溶于5%葡萄糖溶液中，所得溶液能長(zhǎng)時(shí)間(超過2小時(shí))保持澄明。最終濃度是指化合物的紫杉醇含量(總量的4%)。
腫瘤采用B16-F10小鼠黑色素瘤，105個(gè)腫瘤細(xì)胞懸浮液0.2ml皮下注入鼠的肋腹內(nèi)。
用測(cè)經(jīng)器測(cè)量腫瘤的大小，以下式計(jì)算腫瘤的重量(a2+b)/2給藥由于紫杉醇不良的溶解性和載體的毒性，紫杉醇是以腹腔給藥。
實(shí)施例6化合物是以靜脈注入的。在接種腫瘤后于1、5、9天分別給兩種化合物。
列于表2的數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的化合物比紫杉醇有更大的活性。
聚合物-軛合物的劑量是以紫杉醇的含量計(jì)。
表2
毒性死于毒性的小鼠數(shù)。
毒性是以與對(duì)照組比較小鼠死亡數(shù)或觀察到體重顯著降低和/或脾和/或肝體積縮小來量度的。
由上述數(shù)據(jù)可以看到本發(fā)明聚合物軛合物顯示出良好的抗腫瘤活性。因此，這些化合物與紫杉醇或紫杉醇衍生物相比較由于其較低的毒性和較好的水溶解性是有效的抗腫瘤劑。能治療的腫瘤的實(shí)例，如肉瘤、癌、淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、Wilms腫瘤、白血病以及腺癌。
本發(fā)明的聚合物軛合物由于其溶解性的提高和毒性的降低，意味著適宜于靜脈注射或滴注，劑量決定于病人的年齡、體重和身體狀況，可從1mg/kg體重到1g/kg體重，優(yōu)選4-800mg/kg體重。有代表性的配方中聚合物鍵合紫杉醇或聚合物鍵合紫杉醇衍生物的含量相當(dāng)于0.5、1.5、10、20、25或50mg活性紫杉醇或紫杉醇衍生物。
聚合物軛合物可與藥用載體或稀釋劑配制成藥物組合物，任何適宜的載體或稀釋劑都可采用。供靜脈注射或輸注的溶液可含有的載體或稀釋劑，例如滅菌水或優(yōu)選的可以是無菌的、含水的或等滲的鹽溶液。
以下述實(shí)施例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1
1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、1-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)氨基-2-羥基丙烷與2′(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)紫杉醇的共聚物。
向根據(jù)J.Kopecek等在MakromolClem177，P2833，(1976)提出的方法制備的1.4g1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷與N-(亞甲基羰基-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸4-硝基苯氧基)甲基丙烯酰胺的共聚物在15ml無水二甲基甲酰胺溶液中加入100mg紫杉醇及15mg二甲基氨基吡啶。
在無水、室溫條件下攪拌該黃色溶液8小時(shí)，然后將2-羥基丙胺(0.2ml)滴入反應(yīng)瓶中并攪拌反應(yīng)物30分鐘。
向反應(yīng)溶液中加入0.3ml冰乙酸以使反應(yīng)中止，在真空下濃縮至較小的體積，然后將其傾入200ml丙酮中。
混和30分鐘后，濾集沉淀并用丙酮洗滌沉淀，得到1.25g標(biāo)題化合物。
紫杉醇含量為4.5%(用酶水解法及HPLC分析法測(cè)算的)。
未反應(yīng)的紫杉醇從丙酮溶液中回收。
實(shí)施例22′(N-三苯甲游基-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)紫杉醇。
向170mg紫杉醇在16ml乙腈的溶液中加入24mg二甲氨基吡啶和150mgN-三苯甲游基-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酸4-硝基苯酯。在室溫下攪拌該黃色溶液20小時(shí)然后在真空下蒸發(fā)至干。殘留物用硅膠進(jìn)行色層分離以35∶25的乙酸乙酯-己烷作為洗脫液，得到380mg標(biāo)題化合物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.82(d，J＝6.4Hz，3H，δ-Leu)0.85(d，J＝6.7Hz，3H，δ-Leu)1.15(s，3H，16)1.26(s，3H，17)1.2-1.6(m.3H，β+β+γ-Leu)1.69(s，3H，19)1.85(s，1H，OH-1)1.89(m，1H，6β)1.96(d，J＝1.2Hz，3H，18)2.14(dd，J＝5.9Hz，J＝13.5Hz，1H，β-Phe)2.24(s，3H，CH3CO-10)2.2-2.7(m，5H，CH2-14+OH-7+6α+βPhe+NH-Phe)2.47(s，3H，CH3CO-4)3.50(m，1H，α-Phe)3.74(dd，J＝4.7Hz，J＝18.2Hz，1H，α-Gly)3.80(m，1H，α-Leu)3.83(d，J＝7.0Hz，1H，3)4.17(dd，J＝7.0Hz，J＝18.2Hz，1H，α′-Gly)4.22，4.33(two-d，J＝8.5Hz，2H，CH2-20)4.46(m，1H，7)4.97(dd，J＝2.2Hz，J＝9.9Hz，1H，5)
5.44(d，J＝2.3Hz，1H，2′)5.71(d，J＝7.0Hz，1H，2)5.97(dd，J＝4.7Hz，J＝7.0Hz，1H，NH-Gly)6.07(dd，J＝2.3Hz，J＝9.4Hz，1H，3′)6.2-6.3(m.2H，13+10)6.8-9.2(m，30H，6-Ph)6.95(d，J＝6.7Hz，1H，NH-Leu)8.00(d，J＝9.4Hz，1H，NH-4′)實(shí)施例32′(苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)紫杉醇。
將250mg2′(N-三甲苯游基-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸)紫杉醇溶解在冰乙酸(22ml)與水(6ml)的混合物中，在室溫下攪拌1小時(shí)。
在真空下蒸去溶劑至干，殘留物于1∶1乙醚-己烷中攪拌30分鐘，過濾，得到160mg標(biāo)題化合物。
FAB-MSm/z 1171，M+H
+;1112，M-CH3COOH+2H;1051，1024，911，603，569，509.
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.88(d，J＝6.4Hz，3H，δLeu)0.92(d，J＝6.4Hz，3H，δ′Leu)1.13(s，3H，16)1.16(s，3H，17)1.4-2.0(m，4H，β+β′+γLeu+6β)1.69(s，3H，19)1.91(d，J＝1.2Hz，3H，18)2.16(dd，J＝6.0Hz，J＝13.8Hz，1H，14)2.23(s，3H，COCH3-10)2.4-2.6(m，3H，6α+14+βPhe)2.53(s，3H，COCH3-4)2.90(dd，J＝4.1Hz，J＝13.5Hz，1H，β′-Phe)3.49(dd，J＝4.1Hz，J＝9.1Hz，1H，αPhe)3.82(d，J＝7.3Hz，1H，3)3.9-4.1(m，2H，α+α′Gly)4.22，4.33(two-d，J＝8.7Hz，2H，CH2-20)4.27(m，1H，α-Leu)4.44(dd，J＝6.4Hz，J＝10.8Hz，7)
4.98(dd，J＝2.4Hz，J＝9.7Hz，5)5.61(d，J＝3.2Hz，1H，2′)5.70(d，J＝7.3Hz，1H，2)6.12(dd，J＝3.2Hz，J＝9.4Hz，1H，3′)6.21(m，1H，13)6.28(s，1H，10)6.8-8.2(m，21H，4-Ph+NHLeu)7.87(d，J＝9.4Hz，1H，NH-4′)實(shí)施例41-甲基丙烯酰氨基-2-羥丙烷、1-(甲基丙烯酰-甘氨酰)氨基-2-羥丙烷與2′-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)紫杉醇的共聚物。
向根據(jù)P.Rejmanova等，Makromol.Chem.178，P2159-2168所提出的方法制備的1g1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷與N-(亞甲基羰基-4-硝基-苯氧基)甲基丙烯酰胺共聚物在10ml無水二甲基甲酰胺的溶液中加入100mg2′苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-紫杉醇和10mg二甲基氨基吡啶。在無水、室溫條件下攪拌該黃色溶液2小時(shí)。然后將2-羥基丙胺(0.15ml)加入反應(yīng)溶液中并攪拌30分鐘。向反應(yīng)溶液加入0.2ml冰乙酸使反應(yīng)中止，在真空條件下濃縮溶液至較小的體積，然后將其傾入200ml丙酮中。
攪拌混合物1小時(shí)，濾集沉淀并用丙酮洗滌沉淀，得到960mg標(biāo)題化合物。
紫杉醇含量為6%(用酶水解法和HPLC分析法測(cè)算的)。
實(shí)施例51-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、1(甲基丙烯酰-甘氨酰)氨基-2-羥基丙烷與2′(甲基丙烯酰-甘氨酰)紫杉醇共聚物。
向1.6g1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷和N-(亞甲基羰基-4-硝基苯氧基)甲基丙烯酰胺共聚物在16ml無水二甲基甲酰胺的溶液中加入100mg紫杉醇及20mg二甲基氨基吡啶。在室溫下攪拌該黃色溶液20小時(shí)，然后加入2-羥基丙胺(0.2ml)攪拌30分鐘。加入0.3ml冰乙酸中止反應(yīng)，在真空條件下濃縮溶液至較小的體積，然后將其傾入200ml丙酮中。攪拌混合物1小時(shí)，濾集沉淀并用丙酮洗滌沉淀，得到1440mg標(biāo)題化合物。
紫杉醇含量為2.75%(w/w)。
實(shí)施例61-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、1-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)氨基-2-羥基丙烷與2′-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰-β丙氨酰)紫杉醇共聚物。
向根據(jù)N.F.Magri等，在JNat.Products，51，298-306，(1988)提出的方法制備的620mg1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷與N-(亞甲基羰基-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-4-硝基-苯氧基)甲基丙烯酰胺共聚物在6ml無水二甲基甲酰胺的溶液中加入62mg2′-(β丙氨酰)紫杉醇和10mg二甲氨基吡啶。在室溫及無水條件下攪拌該黃色溶液5小時(shí)。
然后加入2-羥基丙胺(0.1ml)，攪拌30分鐘。
加入0.15ml冰乙酸中止反應(yīng)，在真空條件下濃縮溶液至較小的體積并將其傾入150ml丙酮中。攪拌混合物1小時(shí)，濾集沉淀并用丙酮洗滌沉淀，得到5.85mg標(biāo)題化合物。
紫杉醇含量為4%(w/w)。
實(shí)施例72′，7-二(芐氧羰基-β-丙氨酰)紫杉醇。
向200mg紫杉醇在15ml乙腈的溶液中加入400mgN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺、200mg芐氧羰基-β-丙氨酸及60mg二甲基氨基吡啶。攪拌該反應(yīng)混合物20小時(shí)，濾集沉淀，在真空下將溶劑蒸干。
殘留物用硅膠作色層分離，用1∶1乙酸乙酯-己烷作為洗脫液，得到300mg標(biāo)題化合物。
FAB-MSM/Z1264M+H
+，1204，1130，1070
實(shí)施例87-(芐氧羰基-β丙氨酰)紫杉醇向171mg2′7-二(芐氧羰基-β丙氨酰)紫杉醇在60ml甲醇溶液中加入30mg碳酸氫鈉和7ml水，在室溫下攪拌3小時(shí)。蒸去甲醇，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物。
在真空下將溶劑蒸干，得到134mg標(biāo)題化合物。
實(shí)施例97-(β丙氨酰)紫杉醇向135mg7-(芐氧羰基-β丙氨酰)紫杉醇20ml甲醇和13ml甲酸溶液中加入200mg5%Pd/C。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，濾去催化劑并用甲醇洗滌，在真空下蒸發(fā)溶劑至干，殘留物溶解于8ml甲醇中，用150ml乙醚沉淀，得到85mg標(biāo)題化合物。
FAB-MSM/z 925，M+H
+;947，M+Na
+1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.14(s，3H，CH3-16)1.20(s，3H，CH3-17)1.79(s，3H，CH3-19)1.85(s，3H，CH3-18)2.17(s，3H，CH3CO-10)2.2-2.6(m，6H，CH2-14+CH2-6+OCOCH2CH2NH2)2.42(s，3H，CH3CO-4)3.0-3.2(m，2H，OCOCH2CH2NH2)3.90(d，J＝6.8Hz，1H，3)4.18，4.31(two d，J＝8.2Hz，2H，CH2-20)4.80(d，J＝3.2Hz，1H，2′)4.91(d，J＝8.5Hz，1H，5)5.62(dd，J＝10.2Hz，J＝7.0Hz，1H，7)5.66(d，J＝6.8Hz，1H，2)5.81(dd，J＝2.9Hz，J＝9.1Hz，1H，3′)6.17(m，1H，13)6.19(s，1H，10)7.3-8.2(m，16H，NH-4′+3-Ph)
實(shí)施例101-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、1-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)氨基-2-羥基丙烷與7-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰-β丙氨酰)紫杉醇共聚物。
向1500mg1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷與N-(亞甲基羰基-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-4硝基苯氧基)甲基丙烯酰胺共聚物在13ml無水二甲基甲酰胺的溶液中加入135mg7-(β丙氨酰)紫杉醇和20mg二甲基氨基吡啶。
在室溫、無水條件下攪拌該黃色溶液5小時(shí)。
加入2-羥基丙胺(0.2ml)并攪拌30分鐘。
用0.3ml冰乙酸使溶液中止反應(yīng)，真空濃縮至較小的體積并傾入250ml丙酮中。攪拌混合物1小時(shí)，濾集沉淀并用丙酮洗滌沉淀，得到1520mg標(biāo)題化合物。
紫杉醇含量為7.8%(w/w)。
權(quán)利要求
1.一種聚合物軛合物，主要含有90-99.9mol%由下式所代表的單元
0.1-5mol%由下式所代表的單元
其中R1和R2之一是下式的共聚物殘基
另一個(gè)是氫原子；和0-9.9mol%由下式所代表的單元
其中R是苯基或叔丁氧基，R3是氫或乙酰基，A和A1可以是相同的或不相同的，它們代表化學(xué)單鍵、氨基酸殘基或肽間隔基團(tuán)，該肽間隔基團(tuán)可選自βAla，Gly，Phe-Gly，Phe-Phe-，Leu-Gly，Val-Ala，Phe-Ala，Leu-Phe，Leu-Ala，Phe-Leu-Gly，Phe-Phe-Leu，Leu-Leu-Gly，Phe-Tyr-Ala，Phe-Gly-Phe，Phe-Phe-Gly，Phe-Leu-Gly-Phe，Gly-Phe-Leu-Gly-Phe，Gly-βAla，Phe-Gly-βAla，Phe-Phe-βAla，Leu-Gly-βAla，Val-Ala-βAla，Phe-Ala-βAla，Leu-Phe-βAla，Leu-Gly-βAla，Phe-Leu-Gly-βAla，Phe-Phe-Leu-βAla，Leu-Leu-Gly-βAla，Phe-Tyr-Ala-βAla，Phe-Gly-Phe-βAla，Phe-Phe-Gly-βAla，Phe-Leu-Gly-Phe-βAla或Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-βAla。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合物軛合物，其特征是，R代表苯基、R3是乙?；癆是Phe-Leu-Gly或Phe-Leu-Gly-βAla殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的聚合物軛合物，其特征是，1-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、1-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)3-氨基-2-羥基丙烷與2′-(甲基丙烯酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰-β丙氨酰)紫杉醇的共聚物。
4.制備權(quán)利要求1的聚合物軛合物的方法，其特征是，式Ⅱ化
其中A2和A3之一是化學(xué)鍵，另一個(gè)是A，且A、R和R3如權(quán)利要求1所限定的，與活化的聚合物反應(yīng)，該活化的聚合物主要由90-99.9mol%由下式代表的單元及
由10-0.1mol%由下式代表的單元所組成，
其中A1如權(quán)利要求1所限定，然后用2-羥基丙胺處理所生成的聚合物軛合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征是，反應(yīng)是在有機(jī)堿或無機(jī)堿存在下，在無水極性溶劑中進(jìn)行的，反應(yīng)溫度為15-40℃，反應(yīng)時(shí)間為1-24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征是，A2如同權(quán)利要求1所限定的A，代表二、三或四肽間隔基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征是，紫杉醇或紫杉醇類似物與經(jīng)保護(hù)的氨基酸或肽在縮合劑存在下或采用活化了的酯以及在有或沒有外加催化劑存在下進(jìn)行反應(yīng)，然后除去保護(hù)基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征是，A3如權(quán)利要求1所限定的A，代表β丙氨酸或二、三或四肽間隔基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征是，包括或者(ⅰ)保護(hù)或封閉紫杉醇的2′羥基，酯化7位羥基然后除去2′位保護(hù)或封閉基團(tuán)，或者(ⅱ)使紫杉醇與所需要的N-保護(hù)的氨基酸反應(yīng)生成2′，7二取代紫杉醇，裂解2′位氨基酸，然后脫去7位氨基酸的保護(hù)基團(tuán)。
10.一種藥物組合物，包括作為活性成分由權(quán)利要求1所限定的聚合物軛合物以及藥用稀釋劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的聚合物鍵合的紫杉醇，其衍生物，及它們的制備方法，并涉及含這類物質(zhì)的藥物組合物，其中90—99.9mol％由上式代表的單元構(gòu)成。
文檔編號(hào)C07K5/065GK1079971SQ9310719
公開日1993年12月29日 申請(qǐng)日期1993年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年6月19日
發(fā)明者N·蒙戈利, F·庵戈魯西, E·佩森蒂, A·蘇拉托, G·比索利 申請(qǐng)人:法米塔利亞·卡洛·埃巴責(zé)任有限公司