專利名稱：從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卵巨球蛋白的提取方法，具體為一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。
背景技術(shù)：
雞蛋清來源廣泛，價(jià)格低廉，干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量超過80%，是最理想的蛋白質(zhì)資源之一。卵巨球蛋白是雞蛋清中一種具有重要生物活性的蛋白質(zhì)，其含量?jī)H為蛋清蛋白質(zhì)的0.5%，因其具有抑制蛋白酶的生物活性，表現(xiàn)出抗炎、促進(jìn)傷口愈合、抑制敗血癥等功能活性，在醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。但是由于卵巨球蛋白在雞蛋清中含量低，且不恰當(dāng)?shù)闹苽浞椒▽⑹蛊鋯适Щ钚?，因此如何純化獲得純蛋白成為其研究的難題之一。目前，卵巨球蛋白的分離純化均通過多步層析的方法獲得，步驟繁多、耗時(shí)漫長(zhǎng)，且多種填料的使用大大增加了生產(chǎn)成本。此外，在分離過程中，每一步驟的操作都將不可避免地導(dǎo)致目標(biāo)蛋白不同程度的損失，由于操作步驟繁多，導(dǎo)致產(chǎn)品得率很低，僅為20%左右。因此，開發(fā)出一種操作簡(jiǎn)單、純化周期短、得率高的卵巨球蛋白分離純化方法，將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服上述缺陷，提供一種簡(jiǎn)單、快速和高效的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:( 1)雞蛋清溶液的制備采用新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入0.6 3倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續(xù)攪拌2 3h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離準(zhǔn)確稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入3 5%的聚乙二醇8000，攪拌2 3h，然后在8000 12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8 15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到8 10%，攪拌2 3h，然后在8000 12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8 15min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.3 0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/8 1/5，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，將第3步獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。優(yōu)選地，步驟(I)中所述蒸餾水的加入量是雞蛋清體積的I倍。優(yōu)選地，步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質(zhì)量的3.2
4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度為8.4 9.2%。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質(zhì)量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度為8.8%。優(yōu)選地,步驟(4)中的洗脫流速為0.5 0.8mL/min。進(jìn)一步優(yōu)選地,步驟(4)中的洗脫流速為0.65 0.75mL/min。本發(fā)明的有益效果在于:(I)根據(jù)雞蛋清蛋白質(zhì)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)卵巨球蛋白的提取方案:首先根據(jù)卵黏蛋白溶解度差的特點(diǎn)，采用聚乙二醇沉淀法將其除去，再利用卵巨球蛋白與其它蛋清蛋白質(zhì)分子量上的巨大差異采用凝膠過濾層析將其純化。過程中僅使用了一步層析，大大簡(jiǎn)化了操作，同時(shí)也降低了購買層析填料的成本。(2)整個(gè)方法過程僅需10 12小時(shí)即可完成，與現(xiàn)有方法2 3天的周期相比，大大縮短了時(shí)間，提高了效率，降低了人工和時(shí)間成本。(3)所得卵巨球蛋白樣品純度達(dá)到95.98%，在保持高純度的同時(shí)，回收率也大幅提高，回收率從現(xiàn)有方法的約20%提高至61.4%，充分利用了蛋清蛋白質(zhì)資源。


圖1為卵巨球蛋白分離純化流程圖；圖2為凝膠過濾層析圖譜；圖3為卵巨球蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖4為卵巨球蛋白高相液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。實(shí)施例1一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取當(dāng)天產(chǎn)出的新鮮雞蛋，人工打蛋，使用分離器將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊磁力攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入等體積的純水，加入完成后，繼續(xù)磁力攪拌3h，得雞蛋清溶液。(2)聚乙二醇分離準(zhǔn)確稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入4%的聚乙二醇8000，充分?jǐn)嚢?h，然后在10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到8.8%，如前再次攪拌、離心，收集沉淀。(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.4M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/7，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待進(jìn)一步純化。
(4)凝膠過濾層析純化使用Sephacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料,層析柱(16 X 600mm)裝填后使用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡。取步驟(3)中獲得的上清液3mL注入到層析柱中，使用PBS緩沖液以0.65 0.75mL/min的流速進(jìn)行洗脫，層析圖譜如圖2所示，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。實(shí)施例2一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入0.6倍體積的蒸餾水，加入完成后， 繼續(xù)攪拌2h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入3%的聚乙二醇8000，攪拌2h，然后在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到8%，攪拌2h，然后在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.3M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/8，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液以0.5 0.8mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。實(shí)施例3一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:( I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入3倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續(xù)攪拌2h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入5%的聚乙二醇8000，攪拌2h，然后在8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到10%，攪拌2h，然后在8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/5，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。
實(shí)施例4一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入2倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續(xù)攪拌2.5h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入3.2%的聚乙二醇8000，攪拌2.5h，然后在8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到8.4%，攪拌2.5h，然后在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/6，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。實(shí)施例5—種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入I倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續(xù)攪拌2.5h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入4.4%的聚乙二醇8000，攪拌2h，然后在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到9.2%，攪拌3h，然后在8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8min，收
集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.3M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/6，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。實(shí)施例6方法鑒定

( I)聚丙酰胺凝膠電泳鑒定取層析獲得的卵巨球蛋白樣品溶液80微升，加入20微升的蛋白上樣緩沖液(5倍濃度)，混勻后沸水浴加熱約5分鐘，冷卻后取5微升進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為8%,恒定電壓100V。電泳結(jié)果如圖3所示(泳道I為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，2 4為卵巨球蛋白)，樣品在凝膠上顯示為單一條帶，說明其純度較高，使用軟件計(jì)算其分子量，約為175kDa，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。(2)純度測(cè)定采用高相液相色譜法測(cè)定，使用G2000SWXl分子排阻色譜柱(7.8x300mm)進(jìn)行分析，液相系統(tǒng)為Waters2695，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH7.0，含0.lmol/L Na2SO4),流速為0.8ml/min。層析圖譜如圖4所示，由軟件對(duì)峰面積進(jìn)行積分，根據(jù)峰面積對(duì)樣品純度進(jìn)行定量，計(jì)算實(shí)施例1 5的純度分別為96.32%,95.84%,96.01%、96.20%,95.55%，平均為 95.98%。(3)回收率計(jì)算根據(jù)從雞蛋清中純化所得卵巨球蛋白的質(zhì)量、蛋白含量和純度，使用以下公式計(jì)算所得的各個(gè)蛋白質(zhì)的回收率。
權(quán)利要求
1.一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)雞蛋清溶液的制備 取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入0.6^3倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續(xù)攪拌2 3h，得雞蛋清溶液； (2)聚乙二醇分離 稱取上述雞蛋清溶液，按質(zhì)量加入:Γ5%的聚乙二醇8000，攪拌2 3h，然后在8000^12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速 下離心8 15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度達(dá)到8 10%，攪拌2 3h，然后在8000 12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心8 15min，收集沉淀； (3)沉淀溶解與處理 將所得沉淀置于含有0.3^0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/8 1/5，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化； (4)凝膠過濾層析純化 使用Sephacryl S-200 HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)層析峰，即得卵巨球蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(I)中所述蒸餾水的加入量是雞蛋清體積的I倍。
3.如權(quán)利要求1或2所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質(zhì)量的3.2^4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度為8.4 9.2%。
4.如權(quán)利要求3所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質(zhì)量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質(zhì)量濃度為8.8%。
5.如權(quán)利要求1所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(4)中的洗脫流速為0.5^0.8mL/min。
6.如權(quán)利要求5所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(4)中的洗脫流速為0.65 0.75mL/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括雞蛋清溶液的制備、聚乙二醇分離、沉淀溶解與處理、凝膠過濾層析純化四個(gè)步驟。本發(fā)明解決了卵巨球蛋白分離純化操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、得率低等問題，建立了一種簡(jiǎn)單、快速和高效的卵巨球蛋白提取方法，所得卵巨球蛋白純度達(dá)到95.98%，在保持高純度的同時(shí)，回收率大幅提高，達(dá)到61.4%，該方法整個(gè)過程僅需10~12小時(shí)即可完成，大大簡(jiǎn)化了操作，降低了成本，提高了效率。
文檔編號(hào)C07K1/36GK103172724SQ20131007345
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者馬美湖, 耿放, 黃茜 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)