一種鎘-IgM螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種鎘-IgM螯合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清中IgM是由5個(gè)單體通過(guò)一個(gè)J鏈和二硫鍵連接成五聚體，分子量最大，為 970kD，沉降系數(shù)為19S，稱為巨球蛋白（macroglobulin)。在分子結(jié)構(gòu)上IgM無(wú)鉸鏈區(qū)，C μ 2 可能替代了鉸鏈區(qū)的功能。在生物進(jìn)化過(guò)程中IgM是最早出現(xiàn)的免疫球蛋白。在個(gè)體發(fā)育 過(guò)程中，無(wú)論是B細(xì)胞膜表面Ig(SmIg)，還是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出現(xiàn)的 Ig，在胚胎發(fā)育晚期的胎兒即有能力產(chǎn)生IgM。在抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答過(guò)程中，一般 IgM也最先產(chǎn)生。IgM占血清總Ig的5%~10%。由于IgM在免疫應(yīng)答早期產(chǎn)生，并在補(bǔ)體 參與下的溶血作用比IgM強(qiáng)500倍以上，而且活化補(bǔ)體后通過(guò)C3b、C4b等片段發(fā)揮調(diào)理作 用，因此IgM在機(jī)體的早期免疫防護(hù)中占有重要地位。天然的血型抗體（凝集素）為IgM， 血型不符的輸血，易發(fā)生嚴(yán)重的溶血反應(yīng)。IgM不能過(guò)胎盤，臍血中如出現(xiàn)針對(duì)某種病原微 生物的IgM，表示胚胎期有相應(yīng)病原微生物如梅毒螺旋體、風(fēng)疹或巨細(xì)胞毒等感染，稱為胚 胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有產(chǎn)量單體IgM。
[0003] 鎘是一種常見(jiàn)的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括電鍍、 制造工業(yè)顏料、塑料穩(wěn)定劑、鎳鎘電池等，與人們生活息息相關(guān)。對(duì)于普通人群，主要是通過(guò) 吸入鎘污染的空氣，及食用含鎘污水灌溉農(nóng)田生產(chǎn)的農(nóng)作物（如含鎘大米）等方式攝入鎘。 當(dāng)然，吸煙也是慢性鎘吸入的另一重要來(lái)源。
[0004] 越來(lái)越多的研究證明鎘具有分子毒性作用，可引起人和動(dòng)物的肺、肝、腎等多種器 官以及心血管、免疫、神經(jīng)等多系統(tǒng)功能損傷，還具有較強(qiáng)的致癌作用。1993年國(guó)際腫瘤研 究機(jī)構(gòu)（IARC)已將鎘及其化合物列為第1類人致癌物。各國(guó)學(xué)者進(jìn)行的流行病學(xué)、動(dòng)物 及人的實(shí)驗(yàn)中，皆認(rèn)為鎘與肺癌、前列腺癌、腎癌、乳腺癌、消化系腫瘤等多系統(tǒng)腫瘤發(fā)生相 關(guān)。之后各國(guó)學(xué)者就鎘致癌的分子機(jī)制又進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)鎘可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、抑制 DNA修復(fù)、促使DNA異常甲基化、干擾多種基因表達(dá)、影響細(xì)胞周期調(diào)控、抑制細(xì)胞凋亡、促 進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生等多種方式致機(jī)體損傷，甚至造成腫瘤的發(fā)生。鎘致機(jī)體損傷的機(jī)制及其 復(fù)雜，但在這些眾多的致機(jī)體損傷的方式中，大部分是由于鎘與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合，影響相關(guān) 蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)，以及其功能的實(shí)現(xiàn)，因而研究鎘與蛋白質(zhì)的結(jié)合對(duì)于理解鎘的毒性、 其對(duì)機(jī)體損傷的機(jī)制以及鎘致腫瘤的機(jī)制具有重要意義。
[0005] 雖然目前可以運(yùn)用多種方法檢測(cè)出血鎘含量，但是關(guān)于鎘中毒的評(píng)價(jià)，僅能通過(guò) 檢測(cè)血錦、尿錦、發(fā)錦含量等方式，間接反應(yīng)人體內(nèi)的循環(huán)錦含量、機(jī)體錦負(fù)荷等，無(wú)法進(jìn)一 步評(píng)估鎘對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，鎘與人體的關(guān)系也日益 緊密，因而尋找一種可以從機(jī)體功能角度評(píng)價(jià)鎘中毒，特別是慢性鎘中毒對(duì)于機(jī)體的損害 程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。
[0006] 綜合以上，關(guān)于鎘中毒，特別是慢性鎘中毒的評(píng)價(jià)，僅能通過(guò)檢測(cè)血鎘含量，間接 反應(yīng)人體內(nèi)的循環(huán)鎘含量，無(wú)法進(jìn)一步評(píng)估鎘對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù) 的飛速發(fā)展，鎘與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可以從機(jī)體功能角度評(píng)價(jià)鎘中毒， 特別是慢性鎘中毒對(duì)于機(jī)體的損害程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)鎘污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鎘-IgM螯合物及其制備方 法，并建立鎘-IgM螯合物的定性、定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鎘-IgM螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè) 地區(qū)鎘污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鎘-IgM螯合物可以間接反映 這個(gè)地區(qū)人群受鎘污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鎘污染程度。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鎘-IgM螯合物，鎘離子與 IgM通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的鎘-IgM螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0010] A)鎘與IgM的螯合反應(yīng)：在人源的IgM中加入鎘離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶 液；
[0011] B)純化鎘-IgM螯合物的提取：采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgM以及多余的鎘離子，即得鎘-IgM螯合物。
[0012] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0013] (1)溶解樣品：向經(jīng)過(guò)步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使鎘-IgM螯合物 復(fù)溶；
[0014] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgM與 填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0017] (5)收集：收集經(jīng)過(guò)步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0018] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎘特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0022] (10)收集：收集經(jīng)過(guò)步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0023] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本，即得鎘-IgM螯合物。
[0024] 其中，上述鎘-IgM螯合物的制備方法，還包括步驟C):對(duì)鎘-IgM螯合物的鑒定；
[0025] 其中，步驟C)中具體如下：
[0026] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎘-IgM螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0028] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0029] (4)檢測(cè)：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法檢測(cè)是否含有鎘以及檢測(cè)鎘的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的鎘-IgM螯合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鎘-IgM螯合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎘-IgM螯合物作為對(duì)照品的試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgM的蛋白或捕獲金屬 鎘的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鎘-IgM螯合物的方法，以已知含量的上述的鎘-IgM 螯合物作為對(duì)照品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純鎘-IgM螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與電感耦合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 實(shí)施本發(fā)明的鎘-IgM螯合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0035] 1.本發(fā)明首次體外合成鎘-IgM螯合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出鎘-IgM螯合物可用于制備檢測(cè)血樣中鎘-IgM螯合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0037] 3.本發(fā)明建立了鎘-IgM螯合物的定性定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鎘-IgM螯合 物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鎘污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鎘-IgM螯合物 可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鎘污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鎘污染程度。本發(fā)明 建立的鎘-IgM螯合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提 尚。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為本發(fā)明所述的鎘-IgM螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的鎘-IgM螯合物的同步輻射X線電泳條帶的熒光分析圖；
[0040] 其中，圖1中，M為Marker，2為鎘-IgM螯合物；圖2中，橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置， 縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中鎘金屬能量。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0042] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒(méi)有列舉出來(lái)的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可以通過(guò)市購(gòu)方式 獲得：
[0043] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0045] 本發(fā)明中的所述能與IgM特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲IgM的蛋白的硅 膠或樹(shù)脂；
[0046] 本發(fā)明中的能捕獲IgM的蛋白（抗IgM抗體），包括但不限于兔Anti-人類IgM H&L，其品牌為Abeam、型號(hào)為ab8505 ;
[0047] 本發(fā)明中的能與鎘特異性結(jié)合的填料，為表面附有有能捕獲鎘的物質(zhì)的硅膠或樹(shù) 脂；
[0048] 本發(fā)明中的能捕獲鎘的物質(zhì)，包括但不限于鼠抗Cd mAb，購(gòu)買自巴傲德生物技術(shù) 公司（BioWorld Inc)、貨號(hào)為 AP7015;
[0049] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0050] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0051] 洗滌液為含有 KH2PO4 0· 2mg/ml、Na2HPO4 · 12H20 2. 90mg/ml、NaC18. Omg/ml、KCl 0· 2mg/ml、0. 5% Tween-20 的 pH 為 7. 4 的 0· 15M PBS 溶液；
[0052] 封閉液為1% -5%牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0053] 稀釋緩沖液為含 I. 5mg/mL