于酶標儀上分別讀取每組OD值， 通過與PBS緩沖液組比較，比較出洗脫液的最適濃度及洗脫時間，具體結(jié)果參見表3。
[0225] 表3 :ELISA洗脫液最佳工作濃度及洗脫時間確定
[0226]
[0227] 從表4中我們可以發(fā)現(xiàn)，洗脫液中的木瓜蛋白酶的濃度與酶標抗體的濃度之比= 1:20時，即木瓜蛋白酶的濃度100ng/ml時，各組OD值均低于其他幾組，說明該濃度洗脫液 洗脫效果最優(yōu)（即將ELISA孔壁上結(jié)合的人IgM抗體-酶標復合物洗脫程度達到最大，因 而OD值最低）；而作用時間不管是lh、2h、3h，各組OD值變化均不大，可見隨著時間的延長， 酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的情況下，延長消化時間并不能提高消化率，所以本實驗中 洗脫液的作用時間為l_3h皆可。
[0228] 應用實施例1
[0229] 取采用ELISA法檢測100份標本血漿中的鎘-IgM螯合物，按照以下步驟進行檢 測：酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測鎘-IgM螯合物，按照如下步驟檢測：
[0230] 1)將抗IgM Ab包被于固相載體上：用稀釋緩沖液稀釋抗IgM Ab至500倍，加入 ELISA板微孔中，37°C水浴1小時，儲存冰箱；
[0231] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，再加入甲苯，溶解細胞膜；
[0232] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加2%牛血清白 蛋白作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌，洗滌完成后，ELISA 板于37°C放置1小時；
[0233] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎘-IgM螯合 物作標準品；用稀釋緩沖液稀釋待檢樣品稀釋至相應倍數(shù)，即稀釋10倍，加入微孔中，37°C 作用1小時；
[0234] 5)加入可以捕獲鎘的物質(zhì)，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗 滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋12500倍，37°C作用1小時，使抗Cd Ab與IgM上的金屬 鎘反應；
[0235] 6)酶結(jié)合物溫育：移去抗鎘抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的HRP酶標抗體，37°C作用1小時，使其與酶標抗體反應；
[0236] 7)底物溫育：移去酶標抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0237] 8)終止反應：滴加終止液至每一微孔；
[0238] 9)取波長405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標儀上分別讀取待檢樣品和標 準品的OD值（也可不使用酶標儀，直接通過染色情況進行定性檢測），檢測結(jié)果如表4所 不。
[0239] 表4 :100份血樣標本中鎘-IgM螯合物的ELISA檢測結(jié)果

[0242] 應用實施例2
[0243] 采用酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法（ELISA法+AAS法）檢測100分標本血樣中 的鎘-IgM螯合物，按照如下步驟檢測：
[0244] 1)將能夠捕獲IgM的物質(zhì)，如抗IgM抗體（抗IgM Ab)包被于固相載體上：用稀 釋緩沖液稀釋抗IgM Ab至500倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜18小時；
[0245] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，再加入甲苯，溶解細胞膜；
[0246] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入2%牛血清 白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌，洗滌 完成后，ELISA板于37°C放置1小時；
[0247] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎘-IgM螯合 物作標準品；用稀釋緩沖液稀釋待檢樣品稀釋至10倍，加入微孔中，37°c作用1小時；
[0248] 5)洗脫：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入以木瓜蛋白酶 的濃度為l〇〇ng/ml的洗脫液，洗脫3小時；
[0249] 6)檢測：從ELISA微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測螯合于IgM上的鎘，檢測值 如表5所示。
[0250] 表5 :100份血樣標本中鎘-IgM螯合物的AAS檢測結(jié)果
[0251]

[0252] 應用實施例3
[0253] 采用酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法（ELISA法+ICP-MS法）檢測100 分標本血樣中的鎘-IgM螯合物含量，按照如下步驟檢測：
[0254] 1)將能夠捕獲IgM的物質(zhì)，如抗IgM抗體（抗IgM Ab)包被于固相載體上：用稀 釋緩沖液稀釋抗IgM Ab至500倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜18小時；
[0255] 2)取100份標準血樣作為待檢樣品，再加入甲苯，溶解細胞膜；
[0256] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入2%牛血 清白蛋白作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌，洗滌完成后， ELISA板于37°C放置1小時；
[0257] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎘-IgM螯合 物作標準品；用稀釋緩沖液稀釋待檢樣品稀釋至10倍，加入微孔中，37°c作用1小時；
[0258] 5)洗脫：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入以木瓜蛋白酶 的濃度為l〇〇ng/ml的洗脫液，洗脫3小時；
[0259] 6)酸化：在步驟5)中的溶液中加入硝酸對溶液進行酸化，封口過夜，徹底酸化；
[0260] 7)檢測：加入過氧化氫，并且加熱趕酸，并從相應溶液中取樣，于電感耦合等離子 體質(zhì)譜儀下檢測螯合于IgM的鎘，檢測值如表6所示。
[0261] 表6 100份標本血樣鎘-IgM螯合物的ICP-MS檢測結(jié)果
[0262]

[0264] 對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種 相應的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種鎘-IgM螯合物，其特征在于，鎘離子與IgM通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合 而成。2. -種如權(quán)利要求1所述的鎘-IgM螯合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A) 鎘與IgM的螯合反應：在人源的的IgM或按照生物學方法重組的IgM中加入鎘離子 進行螯合反應，得到反應溶液； B) 純化鎘-IgM螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應溶液中未反應的IgM以 及多余的鎘離子，即得鎘-IgM螯合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于， 所述步驟B)具體如下： (1) 溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水，使鎘-IgM螯合物復 溶； (2) 平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特異性 結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱； (3) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgM與填料 特異性結(jié)合； (4) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷酸鹽 溶液進行洗脫； (5) 收集：收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性； (6) 透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后， 4 °C透析過夜，收集樣本； (7) 平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鎘 特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； (8) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱； (9) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷酸鹽 溶液進行洗脫； (10) 收集：收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性； (11) 透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后， 4°C透析過夜，收集樣本，即得鎘-IgM螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鎘-IgM螯合物的制備方法，其特征在于，還包括步驟C):對 鎘-IgM螯合物的鑒定； 其中，步驟C)中具體如下： (1) 制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床； (2) 加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎘-IgM螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻，然后 加樣于樣品槽中； (3) 電泳：連接電泳板，進行電泳； (4) 檢測：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復溶，然后 再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法檢測是否含有鎘以及檢測鎘的含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的鎘-IgM螯合物在制備檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑或 試劑盒中的應用。6. -種至少包括如權(quán)利要求1所述的鎘-IgM螯合物作為標準品的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有可捕獲 IgM的蛋白或可捕獲金屬鎘的物質(zhì)。8. -種定量檢測鎘-IgM螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要求1所述的 鎘-IgM螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與 原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與酶 聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與電感耦合 等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鎘-IgM螯合物及其制備方法和應用，該鎘-IgM螯合物是鎘離子與IgM通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。本發(fā)明建立了鎘-IgM螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測鎘-IgM螯合物在評價一個地區(qū)鎘污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鎘-IgM螯合物可以間接反映這個地區(qū)人群受鎘污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鎘污染程度。本發(fā)明建立的鎘-IgM螯合物定量檢測方法其準確度大大提高，并且使檢測的重復性得到大大提高。
【IPC分類】G01N27/447, G01N21/31, G01N1/28, G01N27/62, G01N33/53
【公開號】CN105044007
【申請?zhí)枴緾N201510413237
【發(fā)明人】張積仁, 陽帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年7月14日