Na2C03、2. 93mg/ml NaHCO3的 PH 為 9. 6 的 0· 05M 磷酸 鹽緩沖液；
[0054] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0055] 終止液為：將21. 7ml的2M H2SO4定容至200ml的ddH 20中；
[0056] 洗脫液為含l_2mg/ml木瓜蛋白酶的PH為8. O的0. lmol/L Tris-HCL緩沖液；
[0057] 酸化劑為硝酸；
[0058] 上樣緩沖液為含有 IM Tris-HCl (pH 6. 8) 15. 5mL、l%溴酚藍(lán) 2. 5mL、ddH20 7mL、甘 氨酸 25mL 的 Sample buffer (5X);
[0059] 電泳緩沖液為含Tris 3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH為6· 8的ddH20溶液。
[0060] 本發(fā)明還提供一種鎘-IgM螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0061] Α)鎘與IgM的螯合反應(yīng)：在人源的IgM或按照生物學(xué)方法重組的IgM中加入鎘離 子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0062] Β)純化鎘-IgM螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgM以及多余的鎘離子，即得鎘-IgM螯合物，具體步驟如下：
[0063] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟Α)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使鎘-IgM螯合物 復(fù)溶
[0064] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0065] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgM與 填料特異性結(jié)合；
[0066] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0067] (5)收集：收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0068] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0069] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎘特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0070] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0071] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0072] (10)收集：收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0073] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鎘-IgM螯合物；
[0074] C)對鎘-IgM螯合物的鑒定，具體步驟如下：
[0075] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0076] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎘-IgM螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0077] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0078] (4)檢測：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法檢測是否含有鎘以及檢測鎘的含量。
[0079] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎘-IgM螯合物作為對照品的試劑盒。
[0080] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgM的蛋白或可捕獲金 屬鎘的物質(zhì)。
[0081] 在本發(fā)明中，能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可以列出以下幾種，但并不限于此。
[0082] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲IgM的蛋白的包被液、 封閉液、洗滌液、作為二抗的可捕獲鎘的物質(zhì)、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋緩沖液、上樣緩 沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0083] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲IgM的蛋白的包被液、 封閉液、洗滌液、洗脫液、上樣緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0084] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲IgM的蛋白的包被液、 封閉液、洗滌液、洗脫液、上樣緩沖液、酸化劑、過氧化氫、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照等。
[0085] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：作為提純?nèi)蠭gM所需提取試 劑、復(fù)溶液、含有可捕獲鎘的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋 緩沖液、上樣緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0086] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：作為提純?nèi)蠭gM所需提取試 劑、復(fù)溶液、上樣緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0087] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：作為提純?nèi)蠭gM所需提取試 劑、上樣緩沖液、復(fù)溶液、酸化劑、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0088] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲IgM的蛋白的包被液、 膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含鎘的蛋白條帶所需液體、含有可捕獲鎘的物 質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0089] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：作為提純?nèi)蠭gM所需提取試 劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含鎘的蛋白條帶所需液體、陽性對照、陰性 對照等。
[0090] -種檢測血樣中鎘-IgM螯合物的試劑盒，包括：作為提純?nèi)蠭gM所需提取試 劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含鎘的蛋白條帶所需液體、酸化劑、過氧化 氫、陽性對照、陰性對照等。
[0091] 上述幾種試劑盒中，所述陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)品，即螯合有重金屬鎘的IgM螯合物或 螯合有重金屬鎘的BSA螯合物；所述陰性對照為稀釋緩沖液。
[0092] 上述試劑盒用于檢測螯合鎘的IgM，以提高檢測的準(zhǔn)確性，重復(fù)性，并使之在臨床 中得到推廣。
[0093] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鎘-IgM螯合物的方法，以已知含量的上述的鎘-IgM 螯合物作為對照品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純鎘-IgM螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鎘-IgM螯合物與電感耦合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。在本發(fā)明 中，用檢測鎘螯合型免疫復(fù)合物的方法可以列出的有以下幾種，但并不限于以下幾種。
[0094] 其中，上述定量檢測鎘-IgM螯合物的方法中采用的試劑如下：
[0095] 方法一：酶聯(lián)免疫法(ELISA法）檢測鎘-IgM螯合物，按照如下步驟檢測：
[0096] 1)將能夠捕獲IgM的物質(zhì)，如人IgM抗體包被于固相載體上：用稀釋緩沖液稀釋 抗IgM Ab至500-4000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小 時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0097] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，1000 rmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀；
[0098] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗 滌，洗滌完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時(shí)；
[0099] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎘-IgM螯合 物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋待檢樣品稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，即稀釋10-40倍，加入微孔中， 37°C作用1-2小時(shí)；
[0100] 5)加入可以捕獲鎘的物質(zhì)，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗 滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋與可以捕獲鎘的物質(zhì)或能與鎘反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物 的抗Cd Ab，37°C作用1-2小時(shí)，使抗Cd Ab與IgM上的金屬鎘反應(yīng)；
[0101] 6)酶結(jié)合物溫育：移去抗鎘抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體，使稀釋的酶標(biāo)抗體的濃度為2 μ g/ml，37°C作用1-2小時(shí)，使其 與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0102] 7)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0103] 8)終止反應(yīng)：滴加終止液至每一微孔；
[0104] 9)取波長405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標(biāo)儀上分別讀取待檢樣品和標(biāo) 準(zhǔn)品的OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待檢樣品的含量（也可不使用酶標(biāo)儀，直接通過染色 情況進(jìn)行定性檢測）。
[0105] 該方法利用ELISA原理，可以將全血中的特異性IgM提取出來，提取出來的IgM上 部分螯合有重金屬鎘，而這部分IgM上的鎘可以被抗鎘的特異性抗體所捕獲，之后可以再 被辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲（該抗體不識(shí)別包被蛋白），捕獲上 的抗體在顯色劑及終止液的作用下，可以在儀器下讀出OD值，而不含有螯合金屬鎘的IgM， 則不會(huì)被抗鎘的特異性抗體所捕獲，也不會(huì)與辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗 體所捕獲，而所用試劑中也不含有金屬鎘（陰性對照組結(jié)果為陰性），因而當(dāng)所讀取的OD值 結(jié)果顯示為陽性時(shí)，即可證明檢測出IgM上螯合的金屬鎘。
[0106] 方法二：酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法(ELISA法+AAS法）檢測鎘-IgM螯合物 按照如下步驟檢測：
[0107] 1)將能夠捕獲IgM的物質(zhì)，如人IgM抗體包被于固相載體上：用稀釋緩沖液稀釋 抗IgM Ab至500-4000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小 時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0108] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，1000 rpm離心5-8分鐘，離心棄去沉淀；
[0109] 3)封閉：移去包被液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入以1% -5%牛血 清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，洗 滌完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時(shí)；
[0110] 4)加