M030)
[0165] 5)透析袋（截留分子量 14000) (Bioshop Inc)
[0166] 制備步驟具體為：
[0167] 1)透析袋的處理：將透析袋放入500ml (根據(jù)燒杯體積可變換用量）體積的 5mmol/L EDTA+200mmol/L NaHCO3溶液中，煮沸 IOmin ;傾棄 EDTA/NaHC03液，用超純水輕輕 漂洗，再用500ml 5mmol/L EDTA煮沸IOmin ;棄掉煮沸液，徹底用超純水清洗，加入大量的 超純水浸泡透析袋4°C過夜。使用時，戴上手套，取出透析袋，用大量的超純水徹底沖洗其內(nèi) 外表面；
[0168] 2)取 2. Omg ITCBE 溶于 2ml DMSO 中；
[0169] 3)取4. Omg IgM溶于4. Oml硼酸鹽緩沖溶液中（0· OlM ρΗ9· 0)中；
[0170] 4)緩慢將步驟2制備的液體加入IgM溶液中，邊滴加邊震蕩，于25°C，lOOr/min的 搖床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未與IgM結(jié)合的ITCBE ;
[0171] 5)將透析所得的液體用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 0,然后緩慢逐漸滴加80 μ 1 lmmol/L鎘離子溶液，邊滴加邊振蕩，以免鎘離子使蛋白變性沉淀；
[0172] 6)將加好的溶液在25°C，lOOr/min的搖床中反應(yīng)2h，用處理好的透析袋進行透析 24h ；
[0173] 7)將透析后的液體于-20°C分裝保存。
[0174] B)純化鎘-IgM螯合物的提取：采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液（即步驟A中 7)的透析后的液體）中未反應(yīng)的IgM以及多余的鎘離子，即得鎘-IgM螯合物，具體步驟如 下：
[0175] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使鎘-IgM螯合物 復(fù)溶；
[0176] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0177] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgM與 填料特異性結(jié)合；
[0178] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫；
[0179] (5)收集：收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0180] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0181] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎘特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0182] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0183] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫；
[0184] (10)收集：收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0185] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鎘-IgM螯合物；
[0186] C)對鎘-IgM螯合物的鑒定，具體步驟如下：
[0187] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)制備膠床；
[0188] (2)加樣：取步驟B)中8 μ L提取純化得到的鎘-IgM螯合物，加入2 μ L上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0189] (3)電泳：連接電泳板，加入電泳緩沖液進行電泳；電泳過程中，電流為22mA恒流， 環(huán)境溫度為4度；至溴酚藍移至膠底部時停止電泳；
[0190] (4)檢測：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用AAS法檢測是否含有鎘以及檢測鎘的含量。
[0191] D)檢測結(jié)果
[0192] (1)電泳結(jié)果：
[0193] 其中，圖1為本發(fā)明所述的鎘-IgM螯合物的非變性電泳條帶圖。
[0194] (2)同步輻射X熒光分析：
[0195] 蛋白條帶內(nèi)微量元素含量的SRXRF分析在北京正負電子對撞機（BEPC)的4W1〃 同步輻射束線上完成。儲存環(huán)中電子束流能量為2. 2GeV，束流強度100mA。樣品移動臺 (TSA200型，北京卓立漢光公司）可在計算機控制的步進馬達驅(qū)動下沿X、Y二維方向上移 動以改變?nèi)肷涔獍呶恢?，移動步長為〇. 〇〇25_。從樣品發(fā)射出的X射線由Si (Li)探測器 (PGT Inc. LS 30143-DS)探測，探頭與入射SR線共平面且相互垂直，距樣品照射點20mm，信 號用PGT多道分析儀（MCA4000)獲取輸出。用11. 5keV的單色同步輻射光激發(fā)樣品，調(diào)節(jié) 入射光斑（lmmx3mm)位置使之處于條帶一端，在300s的測定時間內(nèi)，光斑一直沿條帶均勾 緩慢移動，計數(shù)結(jié)束時光斑移到該條帶另一端。沿電泳方向每Imm取一個譜。采用AX IL 軟件處理數(shù)據(jù)，并用來源于空氣且含量恒定的Ar信號峰對其它元素峰進行歸一處理，以抵 消束流強度變化對信號強弱產(chǎn)生的影響。在相同的條件下以同樣的方式測量定量標準干膠 膜的熒光譜。
[0196] 圖2為本發(fā)明所述的鎘-IgM螯合物的同步輻射X線電泳條帶的熒光分析圖，圖中 橫坐標為蛋白條帶位置，縱坐標為該蛋白條帶中鎘金屬能量（含量）值。
[0197] (3)采用石墨爐原子吸收光譜法（AAS)初步測定本實施例得到的鎘-IgG螯合物中 的鎘含量，其含量為ill. Oll μ g/L。
[0198] 本發(fā)明一種宙量檢測鎘-IgM罄合物的方法的檢測條件的確宙：
[0199] 1.補體蛋白最佳工作濃度以及血衆(zhòng)的最佳稀釋倍數(shù)的確定
[0200] 步驟如下：
[0201] (1)將抗IsM Ab用稀釋緩沖液按照以下質(zhì)量體積比（稀釋度）1:500、1:1000、 1:2000、1:4000進行稀釋，加入ELISA板微孔中，將抗Mi Ab包被于固相載體上，每個濃度 包被三排，4°C過夜18小時；
[0202] (2)移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，用2%牛血清白蛋白 作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌；
[0203] (3)待檢樣品用稀釋緩沖液按照以下質(zhì)量體積比（稀釋度）1:20、1:40、1:80進行 稀釋，加入微孔中，桉照上述包被的抗IgM Ab濃度，同一個濃度的抗IgM Ab的分別加入不 同稀釋度血漿，37°C作用1小時；
[0204] (4)移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入抗Cd Ab，抗Cd Ab 用稀釋緩沖液按照以下質(zhì)量體積比（稀釋度）1:12500、1:125000、1:50000、1:100000進行 稀釋，按照每一個相同抗IgM Ab、血清稀釋濃度，不同濃度抗Cd Ab各加2孔，37°C作用1小 時，使抗Cd Ab與IgM上的金屬鎘反應(yīng)；
[0205] (5)酶標抗體選擇最適工作濃度，即2ng/ml，移去抗Cd抗體，并用洗滌液進行洗 滌，待洗滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋HRP酶標抗體，37°C作用1小時，使HRP酶標抗體 與鎘-IgM螯合物反應(yīng)；
[0206] (6)移去酶標抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入底物，37°C避光作用 30分鐘；
[0207] (7)以與加底物液相同的速度和順序滴加終止液至每一微孔；
[0208] (8)取波長405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標儀上分別讀取各孔OD值。 根據(jù)各孔OD值數(shù)值，選擇抗IgM Ab、抗Cd-Ab的最佳工作濃度以及血漿的最佳稀釋倍數(shù)。
[0209] 試驗中同時以所制對照品作為陽性對照，選擇IgM抗體+封閉+Cd抗+酶標+底 物（即不加檢測樣本）作為陰性對照1、IgM抗體+封閉+血漿+酶標+底物（即不加 Cd 抗）作為陰性對照2、IgM抗體+封閉+酶標+底物（即不加檢測樣本和Cd抗）作為陰性 對照3、IgM抗體+封閉+血漿+Cd抗+底物（即不加酶標）作為陰性對照4,封閉+血漿 +Cd抗+酶標+底物（即不加 IgM抗體）作為空白對照1，只加底物及PBS作為空白對照2 ; 檢測結(jié)果見表1-2。
[0210] 表1 :抗IgM Ab和cd抗體最佳工作濃度以及血漿稀釋倍數(shù)的確定
[0211]
[0215] 由表1-2數(shù)據(jù)顯示，我們可以看出當人IgM抗體的稀釋度為1:500、全血稀釋度為 1:10、Cd抗稀釋度為1:12500時，OD值最大，雖然OD值小于0. 8,但是其所對應(yīng)的陰性對照 組OD值全部小于0. 1，并且其所對應(yīng)的陽性對照組，OD值大于0. 8,所以選此值所對應(yīng)的濃 度作為最佳工作濃度（即人IgM抗體濃度為1:500,全血稀釋度為1:10, Cd抗稀釋濃度為 1:12500)〇
[0216] 2. ELISA洗脫液最佳工作濃度及時間確定
[0217] 步驟如下：（1)將人IgM抗體用稀釋緩沖液稀釋至500倍（質(zhì)量體積比），加入 ELISA板微孔中，37°C水浴3小時，儲存冰箱；
[0218] (2)移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，用2%牛血清白蛋白 作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌；
[0219] (3)移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋的 HRP酶標抗體，37°C作用2小時，使其與人IgM抗體反應(yīng)；
[0220] (4)準備洗脫液：將木瓜蛋白酶用pH 8. 0, 0· lmol/L Tris-HCI緩沖液配制成 l-2mg/ml，再加入 lmmol/L 二硫蘇糖醇（DTT)37°C孵育 30min ;
[0221] (5)移去酶標抗體，用稀釋緩沖液對洗脫液進行稀釋，使洗脫液中的木瓜蛋白酶濃 度：酶標抗體濃度比=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，其中，每個濃度作3個復(fù)孔，分別放置于 37°C溫度下洗脫lh、2h、3h ;
[0222] (6)移去洗脫液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入底物，37°C避光作用 30分鐘；
[0223] (7)以與加底物液相同的速度和順序滴加終止液至每一微孔；
[0224] (8)取405nm波長，加完終止液后，將ELISA板置