專利名稱：一種蘇丹紅i號衍生物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種蘇丹紅I號衍生物及其制備方法和應用。背景技術：
蘇丹紅I號為親脂性偶氮化合物，是一種人工合成的染料，其化學名稱為1-苯基偶氮-2-萘酚，分子式為C16H12N2O15作為一種常用的紅色工業(yè)染料，它被廣泛用于溶劑的增色以及紡織品的增光等方面。蘇丹紅I號在人體還原酶的作用下在體內(nèi)生成苯胺和1-氨基-2-萘酚。研究表明:蘇丹紅I號的致毒性與代謝生成的胺類及萘酚類物質(zhì)密切相關。肝臟是蘇丹紅I產(chǎn)生致癌性的主要靶器官，當人體誤食或接觸含有蘇丹紅I號的食品后，一方面，其代謝產(chǎn)物苯胺可直接作用于肝細胞，引起中毒性肝臟疾病，同時還有可能誘發(fā)肝臟基因變異，增加了人體癌變的幾率；另一方面，苯胺進入人體后的代謝產(chǎn)物可以將與血紅蛋白結合的Fe2+氧化為Fe3+，使得血紅蛋白無法結合氧從而導致患上高鐵血紅蛋白癥。蘇丹紅I號的另一種代謝產(chǎn)物1-氨基-2-萘酚具有致癌、致畸 、致敏、致突變的潛在毒性。國際癌癥研究機構(InternationalAgency for Research on Cancer, IARC)將蘇丹紅I號歸為三類致癌物，即動物致癌物。1995年歐盟等國家禁止蘇丹紅作為食品添加齊U，中國也在1996年的《食品添加劑衛(wèi)生標 準》中明令禁止使用蘇丹紅。但是由于其價廉易得，色澤鮮亮持久等特點，仍然有一些不法食品生產(chǎn)商、違規(guī)加工、違法使用蘇丹紅染料。這一方面給國家的食品安全帶來了很大的隱患；另一方面，也給消費者的身心健康帶來嚴重威脅。目前，國內(nèi)外對食品中蘇丹紅I號的常用檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、化學發(fā)光法等。最近，極譜法、分子印跡技術(MIT)以及表面等離子共振技術(SPR)都被應用在蘇丹紅I號的測定中。盡管目前有很多種方法和手段可以檢測蘇丹紅I號，但是，這些方法的樣品前處理比較復雜繁瑣，需要精密昂貴的儀器設備，同時還要有專門的儀器操作人員等，很難達到快速、簡便的現(xiàn)場檢測要求，因此限制了其在基層檢測部門的大
規(guī)模推廣使用。酶聯(lián)免疫檢測分析(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)由于具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，近年來備受人們的關注。免疫分析是以抗體作為生物檢測器的分析技術，而蘇丹紅I號作為小分子物質(zhì)，分子量為248，是半抗原，本身不具有誘導產(chǎn)生抗體的能力，不能直接通過它免疫動物而得到檢測所必須的抗體，因此，合成蘇丹紅I號的人工抗原便成為建立其ELISA分析方法的首要步驟和關鍵所在。
發(fā)明內(nèi)容
蘇丹紅I號分子結構本身沒有可以直接和載體蛋白偶聯(lián)的氨基或羧基，因此需要引入。本發(fā)明根據(jù)威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號中酚羥基變?yōu)榉逾淃}，然后與含有溴的溴酸乙酯反應成酯，用堿水解酯鍵，后酸化得含有羧基的蘇丹紅I號衍生物，將此衍生物以碳二亞胺為偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)從而得到蘇丹紅I號的人工抗原。本發(fā)明要解決的技術問題是是利用新的合成路線，為蘇丹紅I號提供了一種全新的人工抗原及其制備方法和應用。本發(fā)明的技術方案是:
本發(fā)明所述的蘇丹紅1號衍生物(半抗原-3)的結構如圖1所示，其中n=3，4，5。由于蘇丹紅1號分子結構本身沒有可以直接和載體蛋白偶聯(lián)的氨基或羧基，因此需要引入。本發(fā)明根據(jù)威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號中酚羥基變?yōu)榉逾淃}，然后與含有溴的溴酸乙酯反應成酯，用堿水解酯鍵，后酸化得含有羧基的蘇丹紅I號衍生物，將此衍生物以碳二亞胺為偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)從而得到蘇丹紅I號的人工抗原。1.蘇丹紅1號衍生物的合成
(1)將蘇丹紅1 號(20mmol,4.96g)、6_ 溴己酸乙酯(40mmol, 7.2ml)、碳酸鉀(140mmol,19.32g)溶解于無水丙酮中，攪拌加熱回流2天,薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)鑒定蘇丹紅I號是否反應完全。TLC條件:石油醚:乙酸乙酯(v/v) =1:50 ；
(2)反應液抽濾以除去未反應的碳酸鉀，然后旋蒸以除去丙酮；
(3)過柱:先用完全 石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚:乙酸乙酯=30:1的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產(chǎn)物；
(4)產(chǎn)物用乙醇溶解后，加入過量的30%氫氧化鈉，攪拌過夜使其充分水解；
(5)旋蒸除去水解液中的乙醇，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH〈7.0，此時有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號衍生物。2.蘇丹紅1與蛋白偶聯(lián)物的合成
(1)將蘇丹紅I號衍生物(72.4mg, 200uM)、二環(huán)己基碳二亞胺(41.2mg, 200uM)、N_羥基琥珀酰亞胺(23mg，200uM)混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜；
(2)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167.5mg/ml的BSA溶液中，4°C攪拌反應過
夜；
(3)將反應液轉(zhuǎn)移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的雜質(zhì)；
(4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號的人工抗原，其結構如圖2所示。蘇丹紅1號人工抗原的合成路線見圖3。本發(fā)明與已有技術相比其有益效果是:
目前所報道的蘇丹紅I號人工抗原的制備方法中，其衍生物主要是通過丁二酸酐法直接在酚羥基上引入羧基，連接臂很短，在和載體蛋白相偶聯(lián)時容易被載體蛋白包裹，抗原在其表面的展示能力大幅度下降。本發(fā)明的優(yōu)勢在于提供了一種4-6個碳長度的連接臂，可以將蘇丹紅I號的整個結構充分展示在載體蛋白的表面，避免了被載體蛋白包被在其結構內(nèi)部的情況，因此大大增強了蘇丹紅I號被免疫細胞識別的機會，有助于提高抗體的質(zhì)量。四

圖1蘇丹紅I號衍生物結構圖 圖2蘇丹紅I號與蛋白偶聯(lián)物結構圖 圖3蘇丹紅I號人工抗原的合成路線圖 圖4蘇丹紅I號衍生物的核磁共振圖 圖5A蘇丹紅I號與載體蛋白BSA偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜 圖5B蘇丹紅I號與載體蛋白OVA偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜 圖6蘇丹紅I號單克隆抗體的純化 圖7蘇丹紅I號單克隆抗體特異性驗證 五具體實施例方式 實施例1 蘇丹紅I號-BSA偶聯(lián)物
(1)將蘇丹紅I號4.96g,6-溴己酸乙酯7.2ml,碳酸鉀19.32g溶解于無水丙酮中，攪拌加熱回流2天，TLC鑒定蘇丹紅I號是否反應完全。TLC條件:石油醚:乙酸乙酯(v/v) =1:50 ；
(2)反應液抽濾以除去未反應的碳酸鉀，然后旋蒸以除去丙酮；
(3)過柱:先用完全石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚:乙酸乙酯=30:1的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產(chǎn)物；
(4)產(chǎn)物用乙醇溶解后，加入過量的30%氫氧化鈉，攪拌過夜使其充分水解；
(5)旋蒸除去水解液中的乙醇，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH〈7.0，此時有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號衍生物； (6)將蘇丹紅I號衍生物72.4mg, 二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg,N-輕基琥拍酰亞胺23mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜；
(7)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167.5mg/ml的BSA溶液中，4°C攪拌反應過
夜；
(8)將反應液轉(zhuǎn)移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的雜質(zhì)；
(9)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號的人工抗原。實施例2 蘇丹紅I號-OVA偶聯(lián)物
(1)將蘇丹紅I號衍生物72.4mg, 二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg,N-輕基琥拍酰亞胺23mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜；
(2)將混合液緩慢加入到4ml冰浴的112.5mg/ml的OVA溶液中，4°C攪拌反應過夜；
(3)將反應液轉(zhuǎn)移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的雜質(zhì)；
(4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號-OVA偶聯(lián)物。實施例3 蘇丹紅I號衍生物及其偶聯(lián)物的鑒定
首先，采用核磁共振的方法對蘇丹紅I號衍生物的結構進行鑒定，根據(jù)圖譜所反映出的H的位置和數(shù)量顯示其修飾成功；同時，使用紫外分光光度掃描的方法對蘇丹紅I號與載體蛋白偶聯(lián)物進行鑒定，根據(jù)其特征吸收峰的變化及其峰形鑒定是否偶聯(lián)成功。蘇丹紅I號標準品在480nm處有一強的吸收峰，而BSA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶聯(lián)物在這兩個波長下均有吸收，是兩個物質(zhì)吸收峰疊加的結果，表明兩者偶聯(lián)成功，計算得出偶聯(lián)比約為1:10 (圖5A和圖5B)。實施例4 蘇丹紅I號單克隆抗體的制備
取免疫后抗血清效價較高的小鼠脾臟和骨髓瘤細胞SP2/0做細胞融合，篩選雜交瘤細胞并多次梯度稀釋后，取只長有單克隆的微孔中的上清，純化后得單克隆抗體，并用ELISA鑒定抗體特異性。具體操作如下:
(1)猝死小鼠，用70%酒精消毒，超靜臺內(nèi)取脾臟。將取出的脾臟放入預先放有IOml1640培養(yǎng)液的小培養(yǎng)皿內(nèi)；
(2)收集脾細胞。先用手術剪將脾臟剪碎，再用無菌載玻片輕壓研磨。然后將研磨液過細胞篩，將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，充分混勻，離心，IOOOrpm, 5min ；
(3)裂解紅細胞。取出離心管，吸去上清，用手彈散脾細胞，加Iml紅細胞裂解液裂解Imin后離心，IOOOrpm, 5min ;吸去上清,加培養(yǎng)液20ml,沉降Imin后吸上清移于另一離心管中，以除去裂解細胞后產(chǎn)生的蛋白及結締組織塊；
(4)準備SP2/0細胞。用移液槍吹打SP2/0細胞制成單細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，充分混勻并離心，IOOOrpm, 5min ；
(5)細胞計數(shù)及混合。分別計數(shù)，根據(jù)計數(shù)情況，將兩種細胞混合，SP2/0細胞:脾細胞=1:10,充分混勻，離心 IOOOrpm, 5min ；
(6)融合。吸去上清，將細胞團彈開，在水浴條件下加Iml聚乙二醇1500，逐滴加入，邊加邊輕晃，然后加20ml 1640小心吹打；離心800rpm, 5min ；
(7)鋪板。以計數(shù)多的細胞 計算，將其稀釋為3xl05個/ml的濃度，并在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(8)雜交瘤細胞株篩選。融合后7-10天仍用HAT培養(yǎng)液換液。培養(yǎng)3-5天即可見小克隆，雜交細胞較大，呈圓形且透明，其余細胞透光性差并逐漸死亡。當克隆長至孔底面積1/4左右時，可以取培養(yǎng)上清，進行ELISA抗體檢測；將檢測到的分泌預定抗體的克隆，轉(zhuǎn)移至24孔中培養(yǎng)，再經(jīng)過有限稀釋法進行多次克隆后，取上清純化，并將細胞凍存保種。實施例5 蘇丹紅I號單克隆抗體的純化與特異性驗證
用經(jīng)典的硫酸銨-辛酸法純化單克隆抗體，純化結果見圖6 (圖中:M為蛋白Marker，Abl為單抗經(jīng)硫酸銨-辛酸純化，Ab2為雜交瘤細胞上清，F(xiàn)BS為血清對照，1640為培養(yǎng)基對照)。并用ELISA法鑒定抗體特異性。鑒定的具體操作步驟如下:在酶標孔中分別包被與半抗原-3-0VA結構相似的包被原:半抗原-1-0VA和半抗原-2-0VA，以及半抗原-3-0VA，0VA,BSA。每種包被原IOOul/孔，濃度均為lug/ml，4°C過夜；PBST洗滌3次，并拍干；用封閉液封閉后，PBST洗滌3次，拍干；加入純化的單克隆抗體，IOOul/孔；洗滌4次；拍干，加入I:3000稀釋的酶標二抗，IOOul/孔，37°C溫育Ih,洗滌3次，拍干；加TMB底物，IOOul/孔，避光靜置15min ;加終止液50ul/孔；最后用酶標儀測定在450nm處的吸光值0D45(I。ELISA結果顯示單克隆抗體具有很強的特異性(圖7)，這為蘇丹紅I號的免疫檢測方法的建立奠定了很好的基礎。
權利要求
1.一種蘇丹紅I號衍生物，其結構為:
2.根據(jù)權利要求1所述一種蘇丹紅I號衍生物，其特征是連接臂為3-溴丙酸乙酯Ethyl3_bromopropionate 或 4-溴丁酸乙酯 Ethyl4_bromobutyrate 或 5-溴戍酸乙酯Ethyl5-bromopentanoate 或 6_ 溴己酸乙酉旨 Ethyl6_bromocapronate0
3.根據(jù)權利要求1所述一種蘇丹紅I號衍生物的制備方法，其特征在于合成步驟為: (O將蘇丹紅I號4.96g,6-溴己酸乙酯7.2ml,碳酸鉀19.32g溶解于無水丙酮中，攪拌加熱回流2天，薄層色譜TLC鑒定蘇丹紅I號是否反應完全，TLC條件:石油醚:乙酸乙酯(v/v) =1:50 ； (2)反應液抽濾除去未反應的碳酸鉀，然后旋蒸除去丙酮； (3)過柱:先用石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚:乙酸乙酯(v/v) =30:1的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產(chǎn)物； (4)產(chǎn)物用乙醇完全溶解后，加入3倍量的30%氫氧化鈉，攪拌過夜使其充分水解； (5)旋蒸除去水解液中的乙醇，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH〈7.0，此時有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號衍生物。
4.根據(jù)權利要求1所述一種蘇丹紅I號衍生物與蛋白的偶聯(lián)物，其結構為:
5.根據(jù)權利要求4所述一種蘇丹紅I號衍生物與蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于合成步驟為: (1)將蘇丹紅I號衍生物72.4mg,N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg,N-輕基琥拍酰亞胺23mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜； (2)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167.5mg/ml的BSA溶液中，4°C攪拌反應過夜； (3)將反應液轉(zhuǎn)移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，除去未反應的雜質(zhì)； (4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號的人工抗原。
6.根據(jù)權利要求4所述一種 蘇丹紅I號衍生物與蛋白的偶聯(lián)物在制備蘇丹紅I號特異性單克隆抗體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種蘇丹紅I號衍生物及其制備方法和應用。該方法根據(jù)威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號中酚羥基變?yōu)榉逾淃}，然后與含有溴的溴酸乙酯反應成酯，用堿水解酯鍵，再酸化得含有羧基的中間修飾物。將此中間修飾物以碳二亞胺為偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)從而得到蘇丹紅I號的人工抗原，并運用此抗原免疫小鼠后，可制備特異性強的單克隆抗體。整個方法簡單易行，操作簡便，人工抗原得率和純度高。
文檔編號C07C245/10GK103113258SQ20131007254
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權日2013年3月7日
發(fā)明者沈萍萍, 徐加發(fā) 申請人:南京大學