專利名稱：用于蘇丹紅Ⅰ和對(duì)位紅檢測(cè)的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能識(shí)別蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的單克隆抗體和一種用于動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)與試劑盒。
背景技術(shù)：
蘇丹紅染料和對(duì)位紅均屬于偶氮類染料，是常見的紅色染料，由于這類染料含有芳香族結(jié)構(gòu)，進(jìn)人人體后可被分解還原成芳香胺，形成致癌的芳香胺化合物，嚴(yán)重危害到人類健康。研究表明，蘇丹紅I蘇丹紅I是一種潛在的致癌劑，可引發(fā)鼠肝臟、膀胱和脾臟等臟器的腫瘤，因此，國(guó)際癌癥研究中心將其列為三類致癌物。對(duì)位紅也被懷疑具有致癌性， 自1995年起，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家均頒布了法律禁止這類物質(zhì)作為食品添加劑使用。因此，建立分析方法以監(jiān)控蘇丹紅和對(duì)位紅的違法使用尤顯重要。目前HPLC是最常用的方法，但是需要配備昂貴的儀器和專業(yè)性強(qiáng)的操作人員，樣品的前處理復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不利于大批量樣品的篩選，不能在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速的檢測(cè)。相對(duì)于儀器分析法，免疫學(xué)分析法具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量樣品的初篩，目前對(duì)于蘇丹紅和對(duì)位紅的免疫學(xué)檢測(cè)方法較少。申請(qǐng)?zhí)枮?00810201463.9的中國(guó)專利公開了一種單克隆抗體的制備及其用途，該專利以羧基蘇丹紅為半抗原，分別以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)為載體蛋白與半抗原偶聯(lián)制備免疫原和包被原；經(jīng)動(dòng)物免疫和細(xì)胞篩選，獲得了保藏編號(hào)為CCTCC NO C200813的單克隆細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的交叉反應(yīng)率分別為100%和20%，可用于番茄醬等食品中蘇丹紅I蘇丹紅I的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種能識(shí)別蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，建立一種能檢測(cè)動(dòng)物原性食品中蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種能檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅 I蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種能識(shí)別蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCCN0 C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7所分泌的。
上述雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC NO :C201185。所用的免疫原是由半抗原I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備的。進(jìn)一步，本發(fā)明提出了一種適用于蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法，具體步驟如下(I)將半抗原1-(4-羧基苯偶氮基)-2_萘酚與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原I-(4-羧基苯偶氮基)-2_萘酚與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCC NO C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCC NO C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7制備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體(如酶標(biāo)板)；(6)稱取均質(zhì)后的動(dòng)物組織樣品，用乙腈提取后，取乙腈層用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)煤?O. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待測(cè)物；(7)取待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。步驟(6)含O. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法為準(zhǔn)確稱取三羥甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水?dāng)嚢枞芙馔耆?50mL，攪拌條件下用濃鹽酸調(diào)pH值至7. 4，再加O. 5mL吐溫20溶解， 定容至1000mL。本發(fā)明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規(guī)的其他試劑組合，制成了能檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)合上述酶聯(lián)免疫方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果是I、本發(fā)明制備的單克隆抗體能識(shí)別蘇丹紅I蘇丹紅I和對(duì)位紅，專屬性強(qiáng)，靈敏度高。2、本發(fā)明設(shè)計(jì)的半抗原合成工藝簡(jiǎn)便，合成效率高，所用的主要有機(jī)試劑避免了聞毒性，對(duì)操作者身體健康危害較小。3.本發(fā)明涉及的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法以含O. 05體積％吐溫-20的IOmM PH為7. 4 的Tris-HCl溶液為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和樣品稀釋液，對(duì)待測(cè)物的溶解性好，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度好。


圖I為本發(fā)明的單克隆抗體與蘇丹紅I蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)曲線，X軸為蘇丹紅I蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值，Y軸為蘇丹紅I蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光密度值除以“O”孔光密度值(B/Bd。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例I半抗原、免疫原和包被原的制備半抗原的制備準(zhǔn)確稱取2-萘酹3. 5g,磁力攪拌條件下加入60mL O. 02mol/L的氫氧化鈉溶液溶解備用，此為A液。準(zhǔn)確稱取對(duì)氨基苯甲酸3. 24g,磁力攪拌條件下加入8ml 2mol/L HCl溶解,攪拌狀態(tài)下加入20% NaN029 . 6ml，此為B液。攪拌條件下將B液滴加到A液中，5小時(shí)后，用鹽酸調(diào)pH值至5. 4，繼續(xù)攪拌30分鐘，用布氏漏斗過濾，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定為半抗原I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚。免疫原的制備準(zhǔn)確稱取1-(4-羧基苯偶氮基)-2_萘酚29. 2mg，加入已干燥好的 N’ N-二甲基甲酰胺2ml，待完全溶解后加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 21. 5mg和1，3_ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 10. 6mg，反應(yīng)16小時(shí)，將其加入到35ml含IOOmg BSA的緩沖溶液中， 反應(yīng)過夜，SOOOr/分鐘離心10分鐘，取上清液放入處理過的透析袋中，對(duì)生理鹽水充分透析；以SOOOr/分鐘離心10分鐘，取上清冷凍干燥，即得偶聯(lián)物I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚-BSA，用作免疫原。包被原的制備依據(jù)上述免疫原的制備方法，將BSA換成OVA即可制得偶聯(lián)物 I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酌· -OVA,此為包被原。實(shí)施例2單克隆抗體的制備雜交瘤細(xì)胞的制備參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版中的方法以實(shí)施例2制備的偶聯(lián)物1-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚-BSA為免疫原免疫 Balb/C小鼠，免疫程序?yàn)榛A(chǔ)免疫將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，以后每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，換用不完全佐劑乳化，最后于融合前三天腹腔注射，強(qiáng)化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。融合時(shí)，取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5分鐘消毒。將3-5X 107SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠脾臟細(xì)胞懸液加入到50mL離心管中，混勻，1500r/分鐘離心5分鐘。棄上清，控干水分。輕輕敲擊管底，使管底細(xì)胞松動(dòng)。將離心管置于37°C水浴中，I分鐘內(nèi)緩慢加入預(yù)溫至37°C的50% PEGO. 8mL，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，加完后繼續(xù)攪拌30秒，靜置I分鐘。緩慢加入37°C預(yù)溫的RPMI-1640基礎(chǔ)液10mL。具體方法為第I分鐘逐滴加lmL， 第2分鐘加2mL，之后緩慢加入剩余的RPMI-1640基礎(chǔ)液，邊加邊輕搖離心管。緩慢加入 40mL RPMI-1640基礎(chǔ)液，加完后，緩慢上下顛倒混勻，1500r/分鐘離心5分鐘，棄上清，IOmL 滴管吸取含飼養(yǎng)細(xì)胞HAT培養(yǎng)基，沿管壁緩慢滴加，用滴管緩慢機(jī)械攪拌，緩慢吸取融合細(xì)胞，接近飼養(yǎng)細(xì)胞液面滴加，機(jī)械攪拌混勻。接種于6塊96孔培養(yǎng)板中，約150 μ L/孔，置于37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從融合當(dāng)天起計(jì)為O天，3天后每個(gè)培養(yǎng)孔滴加I滴HAT培養(yǎng)基，5天后有規(guī)律地每隔2天吸去1/2體積的培養(yǎng)基，換入等量HT培養(yǎng)基。在融合后4天，開始對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行跟蹤觀察，標(biāo)記和記錄有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，并計(jì)算融合率。在融合后6-7天，待孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至孔底1/10-1/5時(shí)，取培養(yǎng)上清，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選陽性細(xì)胞孔。包被原濃度為10mg/L。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔設(shè)置O孔和200 μ g/L藥物孔，每孔中加入50 μ L培養(yǎng)上清進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。選擇4-6個(gè)上清檢測(cè)呈強(qiáng)陽性且只有1-2個(gè)形態(tài)良好集落生長(zhǎng)的孔，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過3 4次克隆，最終篩選出分泌蘇丹紅I蘇丹紅I特異性抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞。申請(qǐng)人將該雜交瘤細(xì)胞命名為SU I/1H7，并于2011年9月8日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :C201185。腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射
O.5ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理。用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮由保藏號(hào)為CCTCC NO C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至I X IO6個(gè)/mL，每只小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)采集腹水。按照文獻(xiàn)方法 (朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京人民軍醫(yī)出版社，2000)，純化獲得單克隆抗體。采用購(gòu)自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgG2b亞型。實(shí)施例3蘇丹紅I蘇丹紅I間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立和方法考核3. IELISA相關(guān)試劑配制碳酸鹽緩沖液(ρΗ9· 6):準(zhǔn)確稱取Na2CO3L 59g、NaHC032. 93g，少量超純水溶解，定容至 1000mL。洗滌液(ρΗ7·4):準(zhǔn)確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4O. 20g，Na2HPO4 · 12H20 2. 90g，KCl
0.20g，少量超純水溶解，加入吐溫200. 50mL，定容至1000mL。磷酸鹽緩沖液(PBS)(ρΗ7· 4):準(zhǔn)確稱取 NaC18. 00g, KH2PO4O. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KCl 0. 20g,少量超純水溶解，定容至IOOOmL0封閉液準(zhǔn)確稱取卵清蛋白10. OOg,加入IOOOmL磷酸鹽緩沖液，攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。含0. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的Tris_HCl溶液的配制準(zhǔn)確稱取 Tris I. 211g，加入少量水?dāng)嚢枞芙馔耆?，?50mL，攪拌條件下用濃鹽酸調(diào)pH值至7. 4，再加0. 5mL吐溫20溶解，定容至IOOOmL0底物液購(gòu)自武漢飛遠(yuǎn)科技有限公司。終止液2mol/L硫酸。3. 2包被原濃度和抗體工作濃度的確定包被原濃度和抗體工作濃度的初步確定采用方陣滴定初步確定包被原濃度和抗體工作濃度，抗原濃度設(shè)置l、2、4、8、16、32、64mg/L?？贵w濃度為2、4、8、16、32、64X 103。酶標(biāo)板每孔加入50 μ L PBS和50 μ L抗體，選擇OD值接近2. O,且相鄰孔OD值出現(xiàn)較大變化的包被濃度和抗體濃度做為最佳抗原、抗體組合。根據(jù)選擇的不同包被原濃度下OD值接近2. O的抗體濃度，設(shè)置4個(gè)梯度，確定不同抗原濃度下OD值接近2. O的抗體濃度。蘇丹紅I蘇丹紅I做為競(jìng)爭(zhēng)藥物，以標(biāo)準(zhǔn)曲線 IC5tl值做為判定指標(biāo),確定最佳包被原工作濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示包被原濃度達(dá)到32mg/L時(shí),抗原抗體反應(yīng)基本達(dá)到飽和。方陣滴定結(jié)果見表1，分別以4、8、16，32mg/L包被酶標(biāo)板，在OD值在2. O附近的抗體工作濃度附近， 等差設(shè)置3個(gè)抗體濃度，確定OD值在I. 8-2. O之間的對(duì)應(yīng)抗體工作濃度。以確定的抗體濃度建立抑制曲線，藥物濃度設(shè)置I. 25-40 μ g/L，選擇呈線性的濃度范圍建立抑制曲線，計(jì)算抑制曲線的IC5(I。以IC5tl最低的包被濃度確定為最佳包被濃度，以該包被濃度下的抗體工作濃度確定為最佳抗體濃度。結(jié)果顯示最佳包被濃度為16mg/L,抗體工作濃度3X 104。
表I抗體方陣測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種能識(shí)別蘇丹紅I和對(duì)位紅的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞SUI/1H7，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為 CCTCC NO C201185o
3.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，該試劑盒是用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫試劑盒。
5.一種用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫方法，包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)，其步驟如下(1)將半抗原I-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原I-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCCNO C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCCNO C201185的雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6)稱取均質(zhì)后的動(dòng)物組織樣品，用乙腈提取后，取乙腈層用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)煤琌.05 體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液溶解，得到待測(cè)物；(7)取待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
6.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I和對(duì)位紅檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能識(shí)別蘇丹紅I和對(duì)位紅的特異性單克隆抗體和一種用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅I和對(duì)位紅的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞SU I/1H7所分泌的，該雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOC201185。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)等步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法和試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102585008SQ20121004521
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉振利, 張麗燕, 彭大鵬, 戴夢(mèng)紅, 潘源虎, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛, 黃玲利 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)