專利名稱：蘇丹紅Ⅰ號(hào)的中間修飾物的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物的制備方法及其應(yīng)用。
二背景技術(shù)：
蘇丹紅I號(hào)為親脂性偶氮化合物，是一種人工合成的染料，其化學(xué)名稱為l-苯基 偶氮_2-萘酚，分子式為C16H12N20。作為一種常用的紅色工業(yè)染料，它被廣泛用于溶劑的增 色以及紡織品的增光等方面。 蘇丹紅I號(hào)在人體還原酶的作用下在體內(nèi)生成苯胺和1-氨基_2-萘酚。近些年 來(lái)的研究表明蘇丹紅I號(hào)的致毒性與代謝生成的胺類及萘酚類物質(zhì)密切相關(guān)。肝臟是蘇 丹紅I產(chǎn)生致癌性的主要靶器官，當(dāng)人體誤食或接觸含有蘇丹紅I號(hào)的食品后，通過(guò)人體皮 膚或消化系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)。 一方面，其代謝產(chǎn)物苯胺可直接作用于肝細(xì)胞，引起中毒性肝臟疾 病，同時(shí)還有可能誘發(fā)肝臟基因變異，增加了人體癌變的幾率；另一方面，苯胺進(jìn)入人體后 的代謝產(chǎn)物可以將與血紅蛋白結(jié)合的Fe"氧化為Fe、使得血紅蛋白無(wú)法結(jié)合氧從而導(dǎo)致 患上高鐵血紅蛋白癥。蘇丹紅I號(hào)的另一種代謝產(chǎn)物l-氨基-2-萘酚具有致癌、致畸、致 敏、致突變的潛在毒性，對(duì)眼、皮膚、粘膜有強(qiáng)烈的剌激作用，大量吸收可能會(huì)引起出血性腎 炎。此外，它還可引起膀胱、脾臟等其他器官的腫瘤。 國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)將 蘇丹紅I號(hào)歸為三類致癌物，即動(dòng)物致癌物。1995年歐盟等國(guó)家禁止蘇丹紅作為食品添加 劑，中國(guó)也在1996年的《食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中明令禁止使用蘇丹紅。但是由于其價(jià)廉 易得，色澤鮮亮持久等特點(diǎn)，仍然有一些不法食品生產(chǎn)商、違規(guī)加工、違法使用蘇丹紅染料。 這一方面給國(guó)家的食品安全帶來(lái)了很大的隱患；另一方面，也給消費(fèi)者的身心健康帶來(lái)嚴(yán) 重威脅。 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中蘇丹紅I號(hào)的常用檢測(cè)方法是高效液相色譜法(HPLC)、高 效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、化學(xué)發(fā)光法等。最近，極 譜法、分子印跡技術(shù)(MIT)以及表面等離子共振技術(shù)(SPR)都被應(yīng)用在蘇丹紅I號(hào)的測(cè)定 中。 盡管目前有很多種方法和手段可以檢測(cè)蘇丹紅I號(hào)，而且檢測(cè)效果都還不錯(cuò)。但 是，這些方法的樣品前處理比較復(fù)雜繁瑣，需要精密昂貴的儀器設(shè)備，同時(shí)還要有專門的儀 器操作人員等，很難達(dá)到快速、簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求，因此限制了其在基層檢測(cè)部門的大規(guī) 模推廣使用。 酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)由于具有特異 性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受人們的關(guān)注。免疫分析是以抗體作為生物檢 測(cè)器的分析技術(shù)，而蘇丹紅I號(hào)作為小分子物質(zhì)，分子量為248，是半抗原，本身不具有誘導(dǎo) 產(chǎn)生抗體的能力，不能直接通過(guò)它免疫動(dòng)物而得到檢測(cè)所必須的抗體，因此，合成蘇丹紅I 號(hào)的人工抗原便成為建立其ELISA分析方法的首要步驟和關(guān)鍵所在。
蘇丹紅I號(hào)分子結(jié)構(gòu)本身沒(méi)有可以直接和載體蛋白偶聯(lián)的氨基或羧基，因此需要 引入。本發(fā)明根據(jù)威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號(hào)中酚羥基 變?yōu)榉逾淃}，然后與含有溴的溴酸乙酯反應(yīng)成酯，用堿水解酯鍵，后酸化得含有羧基的中間 修飾物，將此中間修飾物以碳二亞胺為偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)從而得到蘇丹紅I號(hào)的人工 抗原。 本發(fā)明所描述的合成方法，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是 本發(fā)明主要是利用新的合成路線，為蘇丹紅I號(hào)提供了一種全新的人工抗原的制
備方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案是 本發(fā)明所述蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物的結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中n = 3，4，5。
由于蘇丹紅I號(hào)分子結(jié)構(gòu)本身沒(méi)有可以直接和載體蛋白偶聯(lián)的氨基或羧基，因此 需要引入。本發(fā)明根據(jù)威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號(hào)中酚 羥基變?yōu)榉逾淃}，然后與含有溴的溴酸乙酯反應(yīng)成酯，用堿水解酯鍵，后酸化得含有羧基的 中間修飾物，將此中間修飾物以碳二亞胺為偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)從而得到蘇丹紅I號(hào)的 人工抗原。 蘇丹紅I號(hào)中間修飾物的合成 (1)將蘇丹紅I號(hào)(20mmol，4. 96g) 、6-溴己酸乙酉旨(40mmol， 7. 2ml)、 K2C03(140mmol，19. 32g)按1 : 2 : 7的摩爾比溶解于無(wú)水丙酮(Acetone)中，攪拌加熱回 流2天，薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)鑒定蘇丹紅I號(hào)是否反應(yīng)完全。TLC
條件石油醚乙酸乙酯(V/V) = 1 : 50 ; (2)反應(yīng)液抽濾以除去未反應(yīng)的1(20)3，然后旋蒸以除去丙酮； (3)過(guò)柱先用完全石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未
反應(yīng)完的六溴己酸乙酯；接著用石油醚乙酸乙酯=30 : i的洗脫液洗柱，將深紅色的部
分洗出，得產(chǎn)物； (4)產(chǎn)物用乙醇完全溶解后，加入過(guò)量的30% NaOH，攪拌過(guò)夜使其充分水解；
(5)將水解液中的乙醇旋蒸除去，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH < 7. O，溶液呈酸 性，此時(shí)有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物。
蘇丹紅I號(hào)與蛋白偶聯(lián)物的合成 (1)將蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物(72. 4mg， 200uM) 、 二環(huán)己基碳二亞胺 (N， N ' -dicyclohexylcarbodiimide， DCC，41. 2mg，200uM) 、 N-羥基琥珀酰亞胺 (N-Hydroxysuccinimide， NHS， 23mg， 200uM)按等摩爾比混合，溶解于400ul無(wú)水N， N- 二甲 基甲酰胺(N， N-dimethylformamide， DMF)中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜； (2)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167. 5mg/ml的BSA溶液中，fC攪拌反應(yīng) 過(guò)夜； (3)將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4t:透析4天，每12小時(shí)換一次透 析液，以除去未反應(yīng)的雜質(zhì)；
(4)透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，5min ;得蘇丹紅I號(hào)的人工抗原，其結(jié)構(gòu) 如圖2所示。 蘇丹紅I號(hào)人工抗原的合成路線見(jiàn)圖3。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比其有益效果是 目前所報(bào)道的蘇丹紅I號(hào)人工抗原的制備方法中，其中間修飾產(chǎn)物主要是通過(guò)丁 二酸酐法直接在酚羥基上引入羧基，連接臂很短，在和載體蛋白相偶聯(lián)時(shí)容易被載體蛋白 包裹，抗原在其表面的展示能力大幅度下降。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于提供了一種4-6個(gè)碳長(zhǎng)度 的連接臂，可以將蘇丹紅I號(hào)的整個(gè)結(jié)構(gòu)充分展示在載體蛋白的表面，避免了被載體蛋白 包被在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部的情況，因此大大增強(qiáng)了蘇丹紅I號(hào)被免疫細(xì)胞識(shí)別的機(jī)會(huì)，有助于提 高抗體的質(zhì)量。
四

圖1蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物結(jié)構(gòu)圖 圖2蘇丹紅I號(hào)與蛋白偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)圖 圖3蘇丹紅I號(hào)人工抗原的合成路線圖 圖4蘇丹紅I號(hào)中間修飾物的核磁共振圖 圖5蘇丹紅I號(hào)與載體蛋白偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1蘇丹紅I號(hào)-一BSA偶聯(lián)物 (1)將蘇丹紅I號(hào)4. 96g，6-溴己酸乙酯7. 2ml，K2C03 19. 32g按l : 2 : 7的摩爾 比溶解于無(wú)水丙酮中，攪拌加熱回流2天，薄層色譜(TLC)鑒定蘇丹紅I號(hào)是否反應(yīng)完全。 TLC條件石油醚乙酸乙酯(v/v) = 1 : 50 ; (2)反應(yīng)液抽濾以除去未反應(yīng)的1(20)3，然后旋蒸以除去丙酮； (3)過(guò)柱先用完全石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未
反應(yīng)完的六溴己酸乙酯；接著用石油醚乙酸乙酯=30 : 1的洗脫液洗柱，將深紅色的部
分洗出，得產(chǎn)物； (4)產(chǎn)物用乙醇完全溶解后，加入過(guò)量的30% NaOH，攪拌過(guò)夜使其充分水解；
(5)將水解液中的乙醇旋蒸除去，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH < 7. O，溶液呈酸 性，此時(shí)有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物；
(6)將蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物72. 4mg， 二環(huán)己基碳二亞胺41. 2mg， N_羥基琥珀 酰亞胺23mg按等摩爾比混合，溶解于400ul無(wú)水N， N_ 二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；
(7)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167. 5mg/ml的BSA溶液中，fC攪拌反應(yīng) 過(guò)夜； (8)將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4t:透析4天，每12小時(shí)換一次透 析液，以除去未反應(yīng)的雜質(zhì)； (9)透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，5min ;得蘇丹紅I號(hào)的人工抗原。
實(shí)施例2蘇丹紅I號(hào)-一OVA偶聯(lián)物 (1)將蘇丹紅I號(hào)4. 96g，6-溴己酸乙酯7. 2ml，K2C03 19. 32g按l : 2 : 7的摩爾比溶解于無(wú)水丙酮中，攪拌加熱回流2天，薄層色譜(TLC)鑒定蘇丹紅I號(hào)是否反應(yīng)完全。TLC條件石油醚乙酸乙酯(v/v) = 1 : 50 ; (2)反應(yīng)液抽濾以除去未反應(yīng)的1(20)3，然后旋蒸以除去丙酮； (3)過(guò)柱先用完全石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未
反應(yīng)完的六溴己酸乙酯；接著用石油醚乙酸乙酯=30 : 1的洗脫液洗柱，將深紅色的部
分洗出，得產(chǎn)物； (4)產(chǎn)物用乙醇完全溶解后，加入過(guò)量的30% NaOH，攪拌過(guò)夜使其充分水解；
(5)將水解液中的乙醇旋蒸除去，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH < 7. O，溶液呈酸性，此時(shí)有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物；
(6)將蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物72. 4mg， 二環(huán)己基碳二亞胺41. 2mg， N-羥基琥珀酰亞胺23mg按等摩爾比混合，溶解于400ul無(wú)水N， N- 二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；
(7)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的112. 5mg/ml的OVA溶液中，，fC攪拌反應(yīng)過(guò)夜； (8)將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4t:透析4天，每12小時(shí)換一次透析液，以除去未反應(yīng)的雜質(zhì)； (9)透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm， 5min ;得蘇丹紅I號(hào)一_OVA偶聯(lián)物。
實(shí)施例3蘇丹紅I號(hào)中間修飾物及其偶聯(lián)物的鑒定 首先，采用核磁共振的方法對(duì)蘇丹紅I號(hào)中間修飾物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，根據(jù)圖譜所反映出的H的位置和數(shù)量顯示其修飾成功；同時(shí)，使用紫外分光光度掃描的方法對(duì)蘇丹紅I號(hào)與載體蛋白偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定，根據(jù)其特征吸收峰的變化及其峰形鑒定是否偶聯(lián)成功。蘇丹紅I號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品在480nm處有一強(qiáng)的吸收峰，而BSA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶聯(lián)物在這兩個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，是兩個(gè)物質(zhì)吸收峰疊加的結(jié)果，表明兩者偶聯(lián)成功，進(jìn)一步的使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)得出偶聯(lián)比約為1 : 10。 實(shí)施例4蘇丹紅I號(hào)一-蛋白偶聯(lián)物的應(yīng)用 蘇丹紅I號(hào)-一BSA偶聯(lián)物作為人工抗原來(lái)分別免疫雄性新西蘭大白兔和Balb/c雌性小鼠，可制備出高質(zhì)量的多克隆抗體和單克隆抗體。而蘇丹紅I號(hào)-一OVA偶聯(lián)物可以作為酶聯(lián)免疫分析(ELISA)時(shí)的包被原來(lái)進(jìn)行蘇丹紅I號(hào)的免疫學(xué)檢測(cè)。
權(quán)利要求
一種蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物，其特征在于結(jié)構(gòu)為其中，n＝3，4，5，在被修飾的酚羥基部位引入了4-6個(gè)碳長(zhǎng)度的連接臂，當(dāng)其與載體蛋白偶聯(lián)時(shí)，可以將蘇丹紅I號(hào)的整個(gè)結(jié)構(gòu)充分展示在載體蛋白的表面。F2009100320174C00011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇丹紅I號(hào)中間修飾物，其特征是連接臂為3-溴丙酸乙酯 (Ethyl 3—bromopropionate)或4—、漠丁酸乙酉旨(Ethyl 4—bromobutyrate)或5、漠戊酸乙酉旨 (Ethyl 5-bromopentanoate)或6-溴己酸乙酉旨(Ethyl 6-bromoc即ronate)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述蘇丹紅I號(hào)中間修飾物的制備方法，其特征在于合成步驟為(1) 將蘇丹紅I號(hào)4.96g，6-溴己酸乙酯7. 2ml，碳酸鉀19. 32g按l : 2 : 7的摩爾比 溶解于無(wú)水丙酮中，攪拌加熱回流2天，薄層色譜(TLC)鑒定蘇丹紅I號(hào)是否反應(yīng)完全，TLC條件石油醚乙酸乙酯(V/V) = 1 : 50 ;(2) 將反應(yīng)液抽濾以除去未反應(yīng)的碳酸鉀，然后旋蒸以除去丙酮；(3) 過(guò)柱先用完全石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應(yīng)完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚乙酸乙酯=30 : i的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產(chǎn)物；(4) 產(chǎn)物用乙醇完全溶解后，加入3倍量的30% NaOH，攪拌過(guò)夜使其充分水解；(5) 將水解液中的乙醇旋蒸除去，后加入10%稀鹽酸酸化，調(diào)pH < 7. 0，溶液呈酸性，此 時(shí)有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物與蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于它的結(jié) 構(gòu)為<formula>formula see original document page 2</formula>其中，n = 3，4，5，載體蛋白可以為牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、卵清 蛋白(Ovalbumin, OVA)、匙孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)、人血清白蛋白 (Human serum albumin, HSA)、兔血清白蛋白((Rabbit serumalbumin， RSA)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物與蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于合成步驟為(1)將蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物72. 4mg，二環(huán)己基碳二亞胺41. 2mg， N_羥基琥珀酰亞胺23mg按等摩爾比混合，溶解于400ul無(wú)水N， N_ 二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；(2) 將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167. 5mg/ml的BSA溶液中，4。C攪拌反應(yīng)過(guò)夜；(3) 將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4t:透析4天，每12小時(shí)換一次透析液， 以除去未反應(yīng)的雜質(zhì)；(4) 透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，5分鐘；得蘇丹紅I號(hào)的人工抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物與蛋白的偶聯(lián)物在制備蘇丹紅I號(hào)多 克隆和單克隆抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蘇丹紅I號(hào)的中間修飾物及其制備方法和應(yīng)用。該方法根據(jù)威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號(hào)中酚羥基變?yōu)榉逾淃}，然后與含有溴的溴酸乙酯反應(yīng)成酯，用堿水解酯鍵，再酸化得含有羧基的中間修飾物。將此中間修飾物以碳二亞胺為偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)從而得到蘇丹紅I號(hào)的人工抗原。整個(gè)方法簡(jiǎn)單易行，操作簡(jiǎn)便，人工抗原得率和純度高。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101717349SQ20091003201
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者徐加發(fā), 成義祥, 沈萍萍, 黃小波 申請(qǐng)人:南京大學(xué)