專利名稱：一種羅丹明b完全抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種羅丹明B完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羅丹明B，英文名RhodamineB; CAS:81-88-9,分子式C28H31C1N203;羅 丹明B是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，在溶液中有強(qiáng)烈的熒光，用作 實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。其為三苯甲烷類 堿性染料，具有潛在的致癌和致突變性，我國(guó)和歐盟等都不允許在食品中使用。 羅丹明B具有脂溶性，被用作調(diào)味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色劑。使用 了被污染的調(diào)味品制作的食品時(shí)會(huì)造成殘留。調(diào)味品使用羅丹明B染色時(shí)含量 較高，甚至直接摻入，可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。食品中因其含量較低，需送實(shí)驗(yàn)室檢 測(cè)。可能添加的食品類別為調(diào)味品?，F(xiàn)有的儀器檢測(cè)法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)羅丹明B 進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多殘留的檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外尚未有理想的針對(duì)羅丹明B多殘 留免疫檢測(cè)方法的報(bào)道。為了彌補(bǔ)這一空白，設(shè)計(jì)了以羅丹明B自身為半抗原 的合成羅丹明B免疫檢測(cè)的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羅丹明B完全抗原的合成方法。所制備的產(chǎn)品用 于羅丹明B的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種羅丹明B完全抗原的合成方法，以羅丹明B為半 抗原，用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測(cè)定偶聯(lián)物的偶 聯(lián)比；步驟為
(1)羅丹明B完全抗原的合成
配制A液20mg羅丹明B溶于lmL DMF中，全溶后冰浴下加10pL三丁 氨混勻后再加10pL氯甲酸異丁酯磁力攪拌lh;
配制B液40mgBSA溶于3mLpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，4'C保存?zhèn)溆茫?br> 冰浴下將A液逐滴加入B液中，然后置4'C下溫孵3h，即得羅丹明B完全 抗原混合液；
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60'C的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用；
透析:將羅丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0.01M的pH7.4 的磷酸鹽緩沖溶液和2X2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中 的液體制成粉末，即得到羅丹明B完全抗原；(2)羅丹明B完全抗原的鑒定羅丹明B完全抗原采用分光光度法鑒定
其偶聯(lián)結(jié)果，利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上比對(duì)得到抗原溶
液的蛋白濃度，計(jì)算摩爾吸光系數(shù)s，再測(cè)定羅丹明B完全抗原的偶聯(lián)比。
偶聯(lián)比測(cè)定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方
法，雖然測(cè)定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測(cè)偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對(duì)含量)的原理建立起來(lái)的。分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃 度呈比例關(guān)系的原理分別測(cè)定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián) 物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
偶聯(lián)物蛋白濃度測(cè)定配制濃度為0， 40， 60， 80， lOO嗎'mL.1的牛血清蛋 白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，3(TC水浴溫?zé)?分鐘， 每個(gè)濃度做平行樣，在595nm處測(cè)吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。 將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測(cè)定抗原溶液的吸光值，從曲線上得 到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。
摩爾吸光系數(shù)e:配制羅丹明B濃度為O， 10， 20， 30 ^mL"的20%乙醇 溶液，通過(guò)紫外掃描可知羅丹明B的最大吸收波長(zhǎng)為564nm，在564nm處測(cè)吸 光值，每個(gè)濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為￡=吸光值/摩爾濃度。
偶聯(lián)比測(cè)定配制150^mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物完 全抗原用20%乙醇稀釋到150(ig'ml/1，在312nm處測(cè)吸光值，以20%乙醇為空 白，測(cè)出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比 率r為,=[(4-4)/sl/(150xl(T3/66200)，其中s為摩爾吸光系數(shù)(L'tnol—1 )， 66200 為牛血清蛋白的分子量，150xl(^為牛血清蛋白濃度(吸mL—1)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了羅丹明B的人工抗原，合成步驟簡(jiǎn) 潔，有效，可完全用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑， 可以滿足國(guó)內(nèi)對(duì)其研究的需要。


圖l羅丹明B人工抗原制備前后的紫外掃描圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
(1)羅丹明B完全抗原的制備 配制A液20mg羅丹明B溶于lmL DMF，全溶后冰浴下加10pL三丁氨
混勻后再加10pL氯甲酸異丁酯磁力攪拌lh。
配制B液40mgBSA溶于3mLpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，《C保存?zhèn)溆谩?冰浴下將A液逐滴加入B液中，然后置4'C下溫孵3h。即得羅丹明B完全
抗原混合液。
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用。
透析:將羅丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0.01M的pH7.4 的PBS溶液和2X2L的去離子水透析3天。最后使用冷凍干燥法將透析袋中的 液體制成粉末，即得到羅丹明B完全抗原。
2)羅丹明B人工抗原的鑒定
偶聯(lián)物蛋白濃度測(cè)定配制濃度為O, 40， 60， 80， 100嗎.mL.1的牛血清蛋 白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，3(TC水浴溫?zé)?分鐘， 每個(gè)濃度做平行樣.在595nm處測(cè)吸光值，繪制牛血清蛋白濃度與吸光值的關(guān) 系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測(cè)定抗原溶液的吸光值，從 曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算得抗原溶液的蛋白濃度為 3.28mg-ml/1。
摩爾吸光系數(shù)s:配制羅丹明B濃度為O， 10， 20， 30嗎'mL"的20%乙醇 溶液，通過(guò)紫外掃描可知羅丹明B的最大吸收波長(zhǎng)為564nm，在564nm處測(cè)吸 光值，每個(gè)濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為￡=吸光值/摩爾濃度。本實(shí)驗(yàn) 計(jì)算得e=7737.3 L'mo1—1
偶聯(lián)比測(cè)定配制150昭'mL"牛血清蛋白的2(P/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用 20%乙醇稀釋到150pg'mL"，在564nm處測(cè)吸光值，以20%乙醇為空白，測(cè)出 牛血清蛋白溶液的吸光值為Al,偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，偶聯(lián)比率r為 "["-4)/s]/(150x10-3/66200)，則偶聯(lián)比率r為11.67,其中s為摩爾吸光系數(shù)
(L-mor1)， 66200為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3為牛血清蛋白濃度
((ig-mL-1)。
權(quán)利要求
1、一種羅丹明B完全抗原的合成方法，其特征是以羅丹明B為半抗原，用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測(cè)定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比；步驟為(1)羅丹明B完全抗原的合成配制A液20mg羅丹明B溶于1mL DMF中，全溶后冰浴下加10μL三丁氨混勻后再加10μL氯甲酸異丁酯磁力攪拌1h；配制B液40mg BSA溶于3mLpH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆?；冰浴下將A液逐滴加入B液中，然后置4℃下溫孵3h，即得羅丹明B完全抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；透析將羅丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液和2×2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到羅丹明B完全抗原；(2)羅丹明B完全抗原的鑒定羅丹明B完全抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上比對(duì)得到抗原溶液的蛋白濃度，計(jì)算摩爾吸光系數(shù)ε，再測(cè)定羅丹明B完全抗原的偶聯(lián)比。
全文摘要
一種羅丹明B完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以羅丹明B為半抗原，用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測(cè)定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了羅丹明B完全抗原，合成步驟簡(jiǎn)潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國(guó)內(nèi)對(duì)其研究的需要。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101585877SQ20091003172
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月20日
發(fā)明者宋珊珊, 菲 林, 胥傳來(lái) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)