一株氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用甲砜霉素的類似物1-(4-氨基苯基)-2-二氯乙胺-1,3-丙二醇作為半抗原，將半抗原通過重氮化偶聯(lián)牛血清蛋白（BSA），得到完全抗原，與弗氏佐劑混合均勻后，通過皮下注射免疫BALB/c小鼠；用重氮化法合成包被抗原用于小鼠血清和細(xì)胞上清的篩選。將免疫小鼠的脾細(xì)胞通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株群選性的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明提供的細(xì)胞株對(duì)甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考均具有較好的抑制，可以滿足目前市場(chǎng)上對(duì)氯霉素類多殘免疫檢測(cè)產(chǎn)品的需求。CGMCC No.93062014.05.28
【專利說明】一株氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，具體涉及氯 霉素類通用單克隆抗體的制備方法，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 氯霉素類抗生素是廣泛使用的獸藥之一，目前主要有氯霉素（CAP)、甲砜霉素 (TAP)和氟苯尼考（FF)三種藥物。然而氯霉素會(huì)導(dǎo)致人體再生障礙性貧血，這種毒性作用 與劑量和療程無關(guān)，引起許多國家和地區(qū)的重視。美國僅允許CAP用于非食用動(dòng)物，在動(dòng)物 性食品中不得檢出；歐盟不允許CAP用于產(chǎn)奶母牛和產(chǎn)蛋雞，在其它大動(dòng)物的使用也受到 限制。我國農(nóng)業(yè)部2002年2月發(fā)布《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》，明文禁止在 所有食品動(dòng)物中使用CAP。TAP的血液系統(tǒng)毒性較低，抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，免疫抑 制作用較強(qiáng)，目前除我國與日本外，歐共體和美國均限制或禁用于食品動(dòng)物。
[0003] FF作為新一代的CAP替代品，以其廣譜、高效、吸收迅速、分布廣泛、安全、動(dòng)物專 用等特點(diǎn)，在國內(nèi)外畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖、防疫上迅速獲得廣泛應(yīng)用。但是，繁殖毒性試驗(yàn)結(jié)果 表明，F(xiàn)F具有胚胎毒性，使Fl代雄性大鼠附睪重量明顯減輕，F(xiàn)2幼仔的哺乳指標(biāo)降低，存活 率也較低，建議培育的種牛以及懷孕、哺乳期的牛(包括奶牛)禁用。美國FDA規(guī)定，F(xiàn)F的宰 前停藥期為28天。國內(nèi)休藥期一般畜禽30天，水產(chǎn)類7天。FF在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn) 物為氟苯尼考胺（FFA)，同時(shí)還有氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸及一些還未辨明的代謝物， 在不同動(dòng)物及不同臟器中代謝物的比例和成分又有所不同，根據(jù)FF代謝特點(diǎn)及樣本處理 程序，通常以FFA作為殘留標(biāo)示物。目前，許多國家都規(guī)定了其在食品性動(dòng)物中的最高殘留 限量。
[0004] 動(dòng)物飼料和組織中氯霉素類藥物殘留是獸藥殘留研究領(lǐng)域的重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象，因 此，亟待建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的氯霉素類藥物殘留檢測(cè)方法，確保動(dòng)物性食品的安全。
[0005] 目前檢測(cè)氯霉素類抗生素的方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法 (LC/MS)等儀器檢測(cè)方法，而免疫分析方法相對(duì)較少。其中儀器檢測(cè)方法檢測(cè)準(zhǔn)確，但儀器 昂貴，操作復(fù)雜，時(shí)間長，樣品前處理繁瑣。免疫分析方法相對(duì)于儀器檢測(cè)方法，具有低成 本、高通量、高靈敏、對(duì)技術(shù)人員要求低等特點(diǎn)，因此適用于大量樣品的快速篩查。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用， 通過細(xì)胞株的篩選，得到的抗體對(duì)CAP、TAP、FF都具有較好檢測(cè)靈敏度，可以用來建立氯霉 素類總量的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一株氯霉素類通用性單克隆細(xì)胞株，已保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9306。
[0008] 氯霉素類通用性單克隆抗體，其由氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 CGMCC No. 9306所分泌產(chǎn)生。所述氯霉素類通用性單克隆抗體應(yīng)用于氯霉素類的多殘免疫 檢測(cè)。
[0009] 提供的氯霉素類通用性單克隆抗體的制備方法基本步驟為： (1) 完全抗原的制備：采用重氮化法分別合成免疫原和包被原。合成的具體步驟如下： A液制備：以甲砜霉素（TAP)的類似物即1-(4-氨基苯基）-2-二氯乙胺-1，3-丙二醇 (TAP-NH2)作為半抗原，取0. 023_〇1半抗原于25mL燒杯中，加入2mL DMF、0. 2mL水和0. 2mL 的lmol/L鹽酸溶液，形成黃色溶液，冷至0-5°C ;然后逐滴滴加 lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀 粉-碘化鉀試紙監(jiān)測(cè)，直到試紙變藍(lán)灰色停止滴加，4°C下攪拌Ih ; B液制備：稱取20mg的KLH、IOOmg的BSA及150mg的OVA分別溶于均為6mL pH 9. 0硼 酸鹽緩沖液，得三支不同的B液，4°C保存； 在4°C攪拌下，將A液逐滴滴加到B液中，并用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使 保持pH 9，4 °C攪拌過夜，透析，即分別得到免疫原TAP-NH2-KLH,包被原TAP-NH2-BSA及 TAP-NH2-OVA ； (2) 動(dòng)物免疫與效價(jià)測(cè)定：采用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免 疫用100 μ g偶聯(lián)抗原TAP-NH2-KLH與等量福氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周 后，再用100 μ g偶聯(lián)抗原TAP-NH2-KLH與等量福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用 半量偶聯(lián)抗原TAP-NH 2-KLH加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后 采用腹腔免疫，通過間接競爭ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制； 其具體ELISA程序如下： a、 包被：將包被抗原（TAP-NH2-OVA)用0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，加入酶標(biāo) 板孔中1〇〇μ L/孔，37°C孵育2h ; b、 洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200 μ L PBST溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗 滌3次；以下洗滌方法相同； c、 封閉：拍干后，加入200yL /孔封閉液，37°C孵育2h。洗滌后烘干備用； d、 加樣：酶標(biāo)板上半部分加入PBS，50 μ L/孔(上半部分稱為0標(biāo))，下半部分加入不 同濃度的氯霉素類標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50 μ L/孔(下半部分成為加 標(biāo))，上下部分對(duì)應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原（TAP-NH2-OVA)的孔中，37°C孵育30min ;充 分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，IOOyL/孔，37°C孵育30min，洗滌后拍干； e、 顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入IOOyL的顯色液（TMB與底物液比例 1:5)，37°C避光反應(yīng) 15min ; f、 終止和測(cè)定：取出酶標(biāo)板，每孔加入50μ L終止液（2mol/L的硫酸)終止反應(yīng)，然后用 酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值A(chǔ)45tl ; g、 結(jié)果判讀：以O(shè)D值大于或等于陰性血清對(duì)照孔的2. 1倍（即P/N彡2. 1)所對(duì)應(yīng)的血 清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)；上下部分對(duì)照，加標(biāo)OD值為0標(biāo)一半的即是所加 的標(biāo)準(zhǔn)品濃度； (3) 細(xì)胞融合與篩選：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為1450)方 法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下： K無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； i、 收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； j、 將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照10:1 (數(shù)量比）的比例混合，離心后用50% PEG融合，時(shí) 間I min，之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、 2%的50XHAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPMI-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn) 行用含20%胎牛血清、1%的100XHT的RPMI-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì) 胞上清進(jìn)行篩選。
[0010] 篩選分兩步：第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔，第二步選用TAP、CAP、FF 為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競爭ELISA對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選出對(duì)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品均具有較 好抑制的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能 穩(wěn)定分泌氯霉素類通用性單克隆抗體的細(xì)胞株CGMCC No. 9306。
[0011] (4)單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟 油I mL ;7天后每只小鼠腹腔注射I X IO6雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 9306,從第七天開始收集腹 水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用氯霉素的含苯氨基的類似物作為半抗原，用重氮 化法分別合成免疫原和包被原；免疫BALB/c小鼠，獲得了對(duì)TAP、CAP、FF等均具有較好親 和力和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體；該抗體使得氯霉素類的多殘免疫檢測(cè)方法成為了可能。
[0013] 生物材料樣品保藏：一株氯霉素類通用性單克隆細(xì)胞株，已保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2014年5月28日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9306。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是完全抗原的紫外表征圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0016] 本發(fā)明通過將完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間 接ELISA和間接競爭ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)CAP、TAP、FF均有較好靈敏度的通 用性單克隆抗體。
[0017] 實(shí)施例1氯霉素類通用性單克隆抗體的制備 1、完全抗原的制備 A液制備：取0. 023mmol半抗原了4?-順2于2511^燒杯中，加入2mL DMF、0. 2mL水和0. 2mL 的lmol/L鹽酸溶液，形成黃色溶液，冷至0-5°C。然后逐滴滴加 lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀 粉-碘化鉀試紙監(jiān)測(cè)，直到試紙變藍(lán)灰色停止滴加，4°C下攪拌lh。
[0018] B液制備：稱取20mg的KLH、IOOmg的BSA及150mg的OVA分別溶于均為6mL ρΗ9· 0 硼酸鹽緩沖液，得三支不同的B液，4°C保存。在4°C攪拌下，將A液逐滴滴加到B液中，并 用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使保持pH 9,4°C攪拌過夜，透析，即分別得到免疫原 TAP-NH2-KLH、包被原 TAP-NH2-BSA 及 TAP-NH2-OVAo
[0019] 2、動(dòng)物免疫：選擇健康的6?8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取免疫原與等體 積弗氏完全佐劑混合均勻后，通過皮下注射免疫BALB/c小鼠，每只100 μ g ;每間隔21天， 采用免疫原與等體積弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三免后7-10天采血，使用間接競爭 ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇抑制最好的小鼠，在四免后21天沖擊免疫，不使 用佐劑，腹腔注射。通過間接競爭ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制。
[0020] 其具體ELISA程序如下： 1) 包被：將包被抗原（TAP-NH2-OVA)用0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，加入酶 標(biāo)板孔中100 μ L/孔，37°C孵育2h ; 2) 洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200 μ L PBST溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗 滌3次；以下洗滌方法相同； 3) 封閉：拍干后，加入200yL /孔封閉液，37°C孵育2h。洗滌后烘干備用； 4) 加樣：酶標(biāo)板上半部分加入PBS，50 μ L/孔(上半部分稱為0標(biāo))，下半部分加入不 同濃度的氯霉素類標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50 μ L/孔(下半部分成為加 標(biāo))，上下部分對(duì)應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原（TAP-NH2-OVA)的孔中，37°C孵育30min ;充 分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，IOOyL/孔，37°C孵育30min，洗滌后拍干； 5) 顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100 μ L的顯色液（TMB與底物液比例 I : 5)，37°C避光反應(yīng) 15min; 6) 終止和測(cè)定：取出酶標(biāo)板，每孔加入50 μ L終止液（2mol/L的硫酸）終止反應(yīng)，然后 用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值OD45tl ; 7) 結(jié)果判讀：以O(shè)D45tl值大于或等于陰性血清對(duì)照孔的2. 1倍卿P/N彡2. 1)所對(duì)應(yīng)的 血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)。上下部分對(duì)照，加標(biāo)OD值為0標(biāo)一半的即是所 加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
[0021] 3、細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為1450)方法進(jìn) 行細(xì)胞融合，具體步驟如下： (1) 無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； (2) 收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； (3) 將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照10:1 (數(shù)量比）的比例混合，離心后用50% PEG融合， 時(shí)間I min，之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血 清、2%的50XHAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%C0 2的 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPMI-1640篩選培養(yǎng) 液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100XHT的RPMI-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全 換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。
[0022] 篩選分兩步：第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔，第二步選用TAP、CAP、FF 為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競爭ELISA對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選出對(duì)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品均具有較 好抑制的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能 穩(wěn)定分泌氯霉素類通用性單克隆抗體的細(xì)胞株CGMCC No. 9306。
[0023] 5、單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油 I mL ;7天后每只小鼠腹腔注射IX IO6雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 9306,從第七天開始收集腹水， 將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0024] 使用間接競爭ELISA和間接ELISA，測(cè)定單克隆抗體對(duì)CAP、TAP、FF的IC5tl分別為 ： 0. 13ng/mL、0. 55ng/mL、l. 5ng/mL ;可以滿足目前市場(chǎng)上對(duì)氯霉素類免疫檢測(cè)產(chǎn)品的需求。
[0025] 該單克隆抗體對(duì)CAP、TAP、FF的IC5tl和交叉反應(yīng)率如表1所示。
[0026] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一株氯霉素類通用性單克隆細(xì)胞株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9306。
2. 權(quán)利要求1所述細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的氯霉素類通用性單克隆抗體，其特征在于：其由 氯霉素類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No. 9306所分泌產(chǎn)生。
3. 權(quán)利要求2所述氯霉素類通用性單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟為： (1) 完全抗原的制備：采用重氮化法分別合成免疫原及包被原，合成的具體步驟如下： A液制備：以甲砜霉素的類似物即1- (4-氨基苯基）-2-二氯乙胺-1，3-丙二醇作為半 抗原，簡寫TAP-NH2，取0. 023mmol半抗原于25mL燒杯中，加入2mL DMF、0. 2mL水和0. 2mL 的lmol/L鹽酸溶液，形成黃色溶液，冷至0-5°C ;然后逐滴滴加 lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀 粉-碘化鉀試紙監(jiān)測(cè)，直到試紙變藍(lán)灰色停止滴加，4°C下攪拌lh ; B液制備：稱取20mg的KLH、100mg的BSA及150mg的OVA分別溶于均為6mL pH 9. 0硼 酸鹽緩沖液，得三支不同的B液，4°C保存； 在4°C攪拌下，將A液逐滴滴加到B液中，并用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使 保持pH 9，4 °C攪拌過夜，透析，即分別得到免疫原TAP-NH2-KLH、包被原TAP-NH2-BSA及 tap-nh2-ova ； (2) 動(dòng)物免疫與效價(jià)測(cè)定：采用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免 疫用1〇〇 μ g偶聯(lián)抗原TAP-NH2-KLH與等量福氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周 后，再用1〇〇μ g偶聯(lián)抗原TAP-NH2_KLH與等量福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用 半量偶聯(lián)抗原TAP-NH 2-KLH加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后 采用腹腔免疫，通過間接競爭ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制； (3) 細(xì)胞融合與篩選：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG方法進(jìn)行細(xì)胞融合；所用聚乙 二醇分子量為1450 ; (4) 單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1 mL ;7天后每只小鼠腹腔注射1 X 106雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 9306,從第七天開始收集腹水， 將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的氯霉素類通用性單克隆抗體，置于_20°C保存。
4. 權(quán)利要求2所述氯霉素類通用性單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于：所述氯霉素類通 用性單克隆抗體應(yīng)用于氯霉素類的多殘免疫檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104263701SQ201410510572
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】匡華, 郭玲玲, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)