專利名稱：一種檸檬黃完全抗原的合成方法
技術領域：
一種檸檬黃的通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。
背景技術：
檸檬黃色素(Tar)是目前我國批準使用的六種食用合成色素之一，其分子結 構為偶氮化合物，在體內代謝的產物為對人體具有潛在危害的一芳香類化合物。 因此，我國對在食品中的檸檬黃色素有嚴格限制。凡是肉類及其加工品，魚類 及其加工品等都不能使用人工合成色素，即使在適用的品種和范圍內，使用劑 量也有嚴格規(guī)定，決不允許過量使用。但實際上，我國食品中普遍存在檸檬黃 色素的超標、超范圍使用現(xiàn)象屢禁不止。如果人們長期或一次性大量食用擰檬 黃含量超標的食品，可能會引起過敏、腹瀉等癥狀，當攝入量過大，超過肝臟 負荷時會在體內蓄積，對腎臟、肝臟產生一定傷害。目前，檢測檸檬黃含量采 取的方法是薄層分析及分光光度法，近年來，我國科研工作者在檸檬黃檢測方 面做了大量的工作，但都主要集中在理化檢測方面，這些方法不僅需要昂貴的 儀器設備，專業(yè)的操作人員，對檢材的要求也比較高，并且需要進一步的樣本 前處理才能進行，這己經(jīng)不能達到現(xiàn)代檢測對快速、方便、準確的要求。近年 來，國內外已經(jīng)開展了對色素類免疫分析方法的研究，但國內外尚沒有針對擰 檬黃的酶聯(lián)免疫檢測的報道，為了彌補這一空白，有必要制備檸檬黃完全抗原。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種擰檬黃完全抗原的合成方法。所制備的產品用于 檸檬黃的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。
本發(fā)明的技術方案 一種檸檬黃完全抗原的合成方法，以擰檬黃為半抗原， 用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比； 步驟為
(1)檸檬黃完全抗原的合成
配制A液取53.4mg (O.lmmol)檸檬黃溶于2mL 二甲亞砜(DMSO)中， 冰浴10min，加入51pL三正丁胺，冰浴10min，加入87^L氯甲酸異丁酯，4°C 下，攪拌孵育lh，為A液，4t:保存?zhèn)溆茫?br> 配制B液130mg (0.002 mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01 mol/LpH 7.4PBS緩沖液，為B液，4"C保存?zhèn)溆茫?br> 冰浴條件下把A液逐滴滴加入B液中，邊加邊搖，于4。C下孵育4h,即得擰 檬黃完全抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60。C的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。
透析將檸檬黃完全抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01 mol/L的 pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液和2X2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法將透 析袋中的液體制成粉末，即得到檸檬黃完全抗原；
(2)檸檬黃完全抗原的鑒定檸檬黃完全抗原采用分光光度法鑒定其偶 聯(lián)結果，利用牛血清蛋白標準液得到標準曲線，從曲線上比對得到抗原溶液的 蛋白濃度，計算摩爾吸光系數(shù)e，再測定檸檬黃完全抗原的偶聯(lián)比。
偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃 度呈比例關系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián) 物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質。
摩爾吸光系數(shù)s:配制檸檬黃濃度為O， 10， 20， 30嗎'mL'1的0.01M的PBS 溶液，通過紫外掃描可知擰檬黃的最大吸收波長為427nm,在427nm處測吸光 值，每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為^吸光值/摩爾濃度。
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 10， 20， 40， 60， 80， 100嗎'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30'C水浴 溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。
偶聯(lián)比測定配制150嗎.mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產物人 工抗原用20%乙醇稀釋到150嗎.ml/1，在427nm處測吸光值，以20%乙醇為空 白，測出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比 率r為Z = [" -J2)/s]/(l50x1 (r3/66200)。
其中s為摩爾吸光系數(shù)(L'mor1)， 66200為牛血清蛋白的分子量，150xl0—3 為牛血清蛋白濃度(^mL-1^
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了檸檬黃完全抗原，合成步驟簡潔，有效， 完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內 對其研究的需要。


圖l檸檬黃完全抗原制備前后的紫外掃描圖。 具體實施方法 實施例1 (1)檸檬黃完全抗原的制備
4配制A液取擰檬黃53.4mg (O.lmmol)溶于2mL DMSO中，冰浴10min，
加入51mL三正丁肢，冰浴10min，加入87pL的氯甲酸異丁酯，4。C下，攪拌孵 育lh，為A液。
配制B液130mg (0.002 mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01 mol/LPBS 緩沖液，為B液。把A液逐滴滴加入B液中，邊加邊搖，于4'C下孵育4h，即 得檸檬黃完全抗原混合液。
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60'C的去離 子水沖洗3min，保存在4t去離子水中備用。
透析將檸檬黃完全抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS 溶液和2X2L的去離子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉 末，即得到檸檬黃完全抗原。
(2)檸檬黃完全抗原的鑒定
摩爾吸光系數(shù)s:配制擰檬黃濃度為O, 10， 20， 30 ng'ml/1的0.01M的PBS 溶液，通過紫外掃描可知檸檬黃的最大吸收波長為427nm，在427nm處測吸光 值，每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為^吸光值/摩爾濃度。本實驗計 算得￡=25649.76 L'mor1。
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 10， 20， 40， 60， 80， 100嗎'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30。C水浴 溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白 濃度為3.35mg'mL"。
偶聯(lián)比測定配制150^mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產物用 20%乙醇稀釋到150嗎.ml/1，在427nm處測吸光值，以20%乙醇為空白，測出 牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率r為 ,-[(4-4)/s]/(150x1(TV66200)，本實驗計算得r&18 。
其中s為摩爾吸光系數(shù)(Lmor1)， 66200為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 為牛血清蛋白濃度(吸ml/1)。
權利要求
1、一種檸檬黃完全抗原的合成方法，其特征是以檸檬黃為半抗原，用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比；步驟為(1)檸檬黃完全抗原的合成配制A液取53.4mg檸檬黃溶于2mL DMSO中，冰浴10min，加入51μL三正丁胺，冰浴10min，加入87μL氯甲酸異丁酯，4℃下，攪拌孵育1h，為A液，4℃保存?zhèn)溆?；配制B液130mg牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01mol/L pH 7.4PBS緩沖液，為B液，4℃保存?zhèn)溆?；冰浴條件下把A液逐滴滴加入B液中，邊加邊搖，于4℃下孵育4h，即得檸檬黃完全抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用。透析將檸檬黃完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液和2×2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到檸檬黃完全抗原；(2)檸檬黃完全抗原的鑒定檸檬黃完全抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結果，利用牛血清蛋白標準液得到標準曲線，從曲線上比對得到抗原溶液的蛋白濃度，計算摩爾吸光系數(shù)ε，再測定檸檬黃完全抗原的偶聯(lián)比。
全文摘要
一種檸檬黃完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。本發(fā)明以檸檬黃為半抗原，用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了檸檬黃的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內對檸檬黃研究的需要。
文檔編號C07K1/00GK101585875SQ20091003172
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月20日 優(yōu)先權日2009年6月20日
發(fā)明者宋珊珊, 菲 林, 胥傳來 申請人:江南大學