專利名稱：一種蘇丹紅Ⅱ完全抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種蘇丹紅n完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蘇丹紅主要包括蘇丹紅i、 n、 ni和iv,其中蘇丹紅n在體內(nèi)代謝可產(chǎn)生二甲
基苯胺(2,4-xylidine)和l-氨基-2-萘酚，ARC將蘇丹紅II和其代謝產(chǎn)物2,4-二甲基苯 胺(2,4-xylidine)均列為三類致癌物。經(jīng)毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和 致癌性。油溶性的蘇丹紅染料一旦被攝入人體，極易溶解在肌體組織中，由于 不具水溶性，因而不會在消化和循環(huán)過程中隨尿液排出體外。如果長期較大劑 量地攝入，就會在體內(nèi)積累而對肌體造成損傷或基因突變而致癌。因蘇丹紅可 能致癌的特性，包括我國在內(nèi)的許多國家都禁止將蘇丹紅作為食用色素添加在 食品當中。
目前，食品中蘇丹紅的檢測方法主要有采用高效液相色譜法(HPLC)和高效 液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)。另外，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、薄層層析法、極 譜法、毛細管電泳、分光光度法等也可對蘇丹紅樣品進行檢測，實驗準度高重 復(fù)性好，可是這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，專業(yè)的操作人員，對檢材的 要求也比較高，并且需要進一步的樣本前處理才能進行，這已經(jīng)不能達到現(xiàn)代 檢測對快速、方便、準確的要求。近年來，以酶聯(lián)免疫吸附法為代表的免疫學(xué) 方法，因其靈敏、特異、快速、操作簡單等優(yōu)點在食品安全快速檢測中地位越
來越重要。所以有必要制備蘇丹紅n完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蘇丹紅II完全抗原的制備方法，所制備的產(chǎn)品可 用于蘇丹紅II免疫分析方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種蘇丹紅II完全抗原的制備方法，第一步為半抗原
的制備及檢測，以蘇丹紅n為原料，在吡啶條件下與琥珀酸酐發(fā)生縮合反應(yīng)，
生成蘇丹紅n-半琥珀酸酯；第二步為完全抗原的制備及檢測，利用活化酯法使
蘇丹紅n-半琥珀酸酯上的羧基與牛血清蛋白(BSA)結(jié)合，制備蘇丹紅n完全 抗原。工藝歩驟為
(1)蘇丹紅II-半琥珀酸酯人工半抗原的合成
稱取蘇丹紅II于50mL的圓底燒瓶中，加入吡啶，攪拌溶解，加入琥珀酸 酐，蘇丹紅II與琥珀酸酐等摩爾投料，在9(TC條件下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)完成 后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，將反應(yīng)液預(yù)先冷卻至4'C，然后移入含有質(zhì)量濃度10%鹽酸的冰蒸餾水中靜置過夜，沉淀以蒸餾水洗至pH6.0,真空干燥，得蘇丹紅n -半琥珀酸酯人工半抗原粗制品；
(2) 蘇丹紅II完全抗原的合成
制備A液稱取0.1mmol半抗原于20mL燒杯中，加入2mL二甲基甲酰胺 溶解后，加入O.lmmoL的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，O.lmmoL的N-羥基琥珀酰 亞胺，室溫攪拌反應(yīng)60min， 4-C保存，此液為A液。
制備B液稱取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氫鈉緩 沖液，4'C保存，此液為B液。
在4'C攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，并邊加邊搖，于4'C下孵育 3h,即得蘇丹紅II完全抗原混合液；
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min,保存在4。C去離子水中備用；
透析將蘇丹紅II完全抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01mol/L 的碳酸氫鈉溶液和2X2L的去離子水透析4-6天，最后使用凍干法將透析袋中 的液體制成粉末，即得蘇丹紅II完全抗原蘇丹紅II-半琥珀酸酯-牛血清蛋白；
(3) 蘇丹紅II完全抗原的鑒定蘇丹紅II完全抗原采用分光光度法鑒定其
偶聯(lián)結(jié)果，利用牛血清蛋白標準液得到標準曲線，從曲線上比對得到抗原溶液
的蛋白濃度，計算摩爾吸光系數(shù)s，再測定蘇丹紅n完全抗原的偶聯(lián)比。
偶聯(lián)比測定偶聯(lián)比是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率) 的方法，雖然測定方法很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃 度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián) 物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
摩爾吸收系數(shù)s:配制蘇丹紅II濃度為O， 10， 20， 30嗎'mL"的20。/。乙腈 溶液，通過紫外掃描可知蘇丹紅II的最大吸收波長為474nm，在474nm處測吸 光值，每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為F吸光值/摩爾濃度。
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 10， 20， 40， 60， 80, 100吸mL—1 的牛血清蛋白溶液L5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，3(TC水浴 溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣，在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。
偶聯(lián)比測定配制150(ig.mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用 20%乙醇稀釋到150嗎'ml/1，在474nm處測吸光值，以20%乙醇為空白，測出 牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率r為 y =〖4 _4)/ff]/(150x 10-3/66200)。
4其中e為摩爾吸光系數(shù)(L.mor1)， 66200為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 為牛血清蛋白濃度(嗎'ml/1)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了蘇丹紅II的完全抗原，合成步驟簡潔， 有效，完全可用于免疫分析當中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以 滿足國內(nèi)對其研究的需要。


圖i蘇丹紅n完全抗原制備前后的紫外掃描圖。
具體實施方式
實施例i
(1) 蘇丹紅n-半琥珀酸酯人工半抗原的合成
稱取O.lmol的蘇丹紅II于50mL的圓底燒瓶中，溶于5mL吡啶中，攪拌溶 解，加入O.lmol的琥珀酸酐，在9(TC條件下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)除去吡啶。將反應(yīng)液預(yù)先冷卻至4°C，然后移入添加有2mL濃鹽酸的20mL 冰蒸餾水中靜置過夜，沉淀以蒸餾水洗至pH6.0，真空干燥，得蘇丹紅II -半琥珀 酸酯人工半抗原粗制品。
(2) 蘇丹紅II完全抗原的制備
制備A液稱取0.1mmol半抗原于20mL燒杯中，加入2mL二甲基甲酰胺 溶解后，加入O.lmmoL的N，N'-二環(huán)已基碳酰亞胺，O.lmmoL的N-羥基琥珀酰 亞胺，室溫攪拌反應(yīng)60min， 4。C保存，此液為A液。
制備B液稱取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氫鈉緩 沖液，4。C保存，此液為B液。
在4。C攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液，并邊加邊搖，于4。C下孵育3h， 即得蘇丹紅II完全抗原混合液。
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。
透析將完全抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01mol/L的碳酸氫鈉 溶液和2X2L的去離子水透析4-6天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成 粉末，即得到蘇丹紅n完全抗原蘇丹紅II -半琥珀酸酯牛血清蛋白。
(3) 蘇丹紅n完全抗原的鑒定
偶聯(lián)比測定估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，
雖然種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量) 的原理建立起來的.分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的 原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子 均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
摩爾吸收系數(shù)s:配制蘇丹紅II濃度為O， 10， 20， 30嗎'mL"的20%乙腈溶液，通過紫外掃描可知蘇丹紅II的最大吸收波長為474nm，在474nm處測吸 光值，每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為e-吸光值/摩爾濃度。本實驗 摩爾吸收系數(shù)￡=11118.9。
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 10， 20， 40， 60， 80， 100嗎TnL-1 的牛血清蛋白溶液1.5ml，加入5ml考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30。C水浴溫 熱5分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值 的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光值， 從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。
偶聯(lián)比測定配制150^mL"牛血清蛋白的20Q/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用 20%乙醇稀釋到150lig'ml/1，在474nm處測吸光值，以20%乙醇為空白，測出 牛血清蛋白溶液的吸光值為Al,偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率r為 y = [(4 - 4)/f]/(150xl0匿3/66200)，本實驗f19。
其中s為摩爾吸光系數(shù)(L'mor1)， 66200為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 為牛血清蛋白濃度(嗎.mL—1)。
權(quán)利要求
1.一種蘇丹紅II完全抗原的合成方法，其特征是第一步為半抗原的制備，以蘇丹紅II為原料，在吡啶條件下與琥珀酸酐發(fā)生縮合反應(yīng)，生成蘇丹紅II-半琥珀酸酯；第二步為完全抗原的制備及檢測，利用活化酯法使蘇丹紅II-半琥珀酸酯上的羧基與牛血清蛋白結(jié)合，制備蘇丹紅II完全抗原；工藝步驟為(1)蘇丹紅II-半琥珀酸酯人工半抗原的合成稱取蘇丹紅II于50mL的圓底燒瓶中，加入吡啶，攪拌溶解，加入琥珀酸酐，蘇丹紅II與琥珀酸酐等摩爾投料，在90℃條件下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，將反應(yīng)液預(yù)先冷卻至4℃，然后移入含有質(zhì)量濃度10％鹽酸的冰蒸餾水中靜置過夜，沉淀以蒸餾水洗至pH6.0，真空干燥，得蘇丹紅II-半琥珀酸酯人工半抗原粗制品；(2)蘇丹紅II完全抗原的合成制備A液稱取0.1mmol半抗原于20mL燒杯中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解后，加入0.1mmol的N，N′-二環(huán)己基碳酰亞胺，0.1mmol的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)60min，4℃保存，此液為A液；制備B液稱取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氫鈉緩沖液中，4℃保存，此液為B液；在4℃攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，并邊加邊搖，于4℃下孵育3h，即得蘇丹紅II完全抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；透析將蘇丹紅II完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的碳酸氫鈉溶液和2×2L的去離子水透析4-6天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到蘇丹紅II完全抗原蘇丹紅II-半琥珀酸酯-牛血清蛋白；(3)蘇丹紅II完全抗原的鑒定蘇丹紅II完全抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用牛血清蛋白標準液得到標準曲線，從曲線上比對得到抗原溶液的蛋白濃度，計算摩爾吸光系數(shù)ε，再測定蘇丹紅II完全抗原的偶聯(lián)比。
全文摘要
一種蘇丹紅II完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以蘇丹紅II為原料，在吡啶條件下與琥珀酸酐發(fā)生縮合反應(yīng)，生成蘇丹紅II-半琥珀酸酯；利用活化酯法使蘇丹紅II-半琥珀酸酯上的羧基與牛血清蛋白BSA結(jié)合，制備蘇丹紅II完全抗原。用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了蘇丹紅II的完全抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內(nèi)對蘇丹紅II研究的需要。
文檔編號C07K14/435GK101585876SQ20091003172
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月20日
發(fā)明者宋珊珊, 菲 林, 胥傳來 申請人:江南大學(xué)