專利名稱：一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種櫛孔扇貝的α2巨球蛋白基因及其制備方法。
背景技術：
α2巨球蛋白(α2-macroglobulin，縮寫為α2M)是動物血漿中的一種大分子糖蛋白，它的功能主要表現(xiàn)為清除組織中內源或外源性的蛋白酶，并通過調節(jié)內源或外源性蛋白酶的活性廣泛地參與多種生理功能。出現(xiàn)炎癥時，機體能誘導合成出豐富的α2巨球蛋白，它進入組織，與組織釋放的過量的蛋白酶結合，并將后者清除，能防止組織被進一步破壞。α2M還可以通過抑制侵入機體的寄生蟲和病原體釋放的多種蛋白酶與毒素，減少其對宿主的破壞，增強宿主的抗病力，是一種重要的非特異免疫因子。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)屬于軟體動物門，瓣鰓綱，珍珠貝目，扇貝科，主要分布于亞洲的中國、朝鮮、韓國和日本沿海，是我國北方海水養(yǎng)殖區(qū)最重要的養(yǎng)殖貝類。但隨著近年來養(yǎng)殖病害的不斷加劇，養(yǎng)成期櫛孔扇貝大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻繁發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重威脅了這一產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，圍繞櫛孔扇貝大規(guī)模死亡問題的探討已引起養(yǎng)殖界各方的高度關注。利用傳統(tǒng)育種和分子生物學手段培育抗逆優(yōu)良品種是當務之急。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因及其制備方法，它能滿足現(xiàn)有技術的上述需求。
一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因，其特征在于它編碼具有SEQ IDNo.2序列的櫛孔扇貝α2巨球蛋白多肽。
一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的制備方法，其特征在于先分別以猜測體引物進行和簡并引物反轉錄聚合酶鏈式反應，再進行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。
本發(fā)明的櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因能用于櫛孔扇貝的抗逆優(yōu)良品種的培育和開發(fā)。


附圖1為櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的核苷酸序列SEQ ID No.1。
附圖2為根據(jù)櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的核苷酸序列推導出的櫛孔扇貝α2巨球蛋白氨基酸序列SEQ ID No.2。
具體實施例方式
根據(jù)節(jié)肢動物馬蹄蟹(Limulus polyphemus)α2M基因序列在α2M受體結合區(qū)選擇猜測體引物α2MUP(5’-GGT TGT GGT GAA CAA AACATG G-3’)和α2MDN(5’-GTA TCC ATC CAG AAA CCA TCT T-3’)。制備櫛孔扇貝血細胞總RNA，反轉錄為cDNA。取2μL上述cDNA作為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)，條件為94℃，2min，1循環(huán)；94℃ 30sec，57.5℃ 30sec，72℃ 1min，30循環(huán)；72℃ 10min，1循環(huán)。得到相應受體區(qū)片段1172bp。在α2M誘餌區(qū)設計簡并引物BAIT(5’-AAG CCC GTTGTA GAA/G ATI A/C G-3’)與受體結合區(qū)的巢式引物OUTR(5’-TTC TGTCTC AAT CTT GCT GG-3’)和INR(5’-TGT TGG TGA GAT ACT GAAGG-3’)組合進行巢式反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，條件為94℃1.5min，1循環(huán)；94℃ 30sec，50℃ 45sec，72℃ 1min，35循環(huán)；72℃10min，1循環(huán)。得到相應誘餌區(qū)片段，長度1218堿基對(base pairs，簡寫為bp)。
3’末端快速克隆(3’RACE)法克隆α2M基因3’末端用反轉錄引物(5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CTT TTT TTT TTT TTT-3’)進行反轉錄。利用3’末端錨定引物(5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-3’)與受體結合區(qū)巢式引物3OUT(5′-AGG GAG ATG GGA AAT GAC TG-3′)和3IN(5’-CAT CTG TGC ATC ATT TAC TGG-3’)組合進行巢式RT-PCR，外側引物擴增條件為94℃，1min，1循環(huán)；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30循環(huán)；72℃ 10min，1循環(huán)。內側引物擴增條件為94℃，1min，1循環(huán)；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30循環(huán)；72℃ 10min，1循環(huán)。得到相應3’末端片段1914bp。
5’末端快速克隆(5’RACE)法克隆α2M基因5’末端利用血細胞總RNA制備雙鏈cDNA。利用DNA連接酶在雙鏈cDNA 5’末端加接頭(5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGAGGT-3’，3’-G CCG GCT CCA-5’)。利用接頭內的巢式引物(OUTA5’-CTAATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3’；INA5’-AG CGT GGT CGC GGCCGA GGT-3’)和誘餌區(qū)巢式引物(OUTB5’-GAA TTC TTC TTC TAC GATGAC AAG GTC-3’INB5’-GTA TAG CAT CCA CGG TGT TGG TGTC-3’)組合進行RT-PCR，外側引物條件為94℃ 1.5min，1循環(huán)；94℃ 30sec，59℃ 35sec，72℃ 3min，30循環(huán)；72℃ 5min，1循環(huán)。內側引物為94℃ 1min，1循環(huán)；94℃ 30sec，62℃ 35sec，72℃ 3min，30循環(huán)；72℃ 5min，1循環(huán)。得到相應5’末端片段2239bp。將上述序列進行拼接，獲得該基因及5’末端和3’末端非翻譯區(qū)，全長6394bp，示于附圖1。其中開放讀碼框從第3位核苷酸到第5159位核苷酸共5157bp，編碼1719氨基酸，示于附圖2。
權利要求
1.一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因，其特征在于它編碼具有SEQ IDNo.2序列的櫛孔扇貝α2巨球蛋白多肽。
2.一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的制備方法，其特征在于先以猜測體引物和簡并引物進行反轉錄聚合酶鏈式反應，再進行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。
全文摘要
一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因，其特征在于它編碼具有SEQ IDNo.2序列的櫛孔扇貝α2巨球蛋白多肽。于先以猜測體引物和簡并引物進行反轉錄聚合酶鏈式反應，再進行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。本發(fā)明的櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因能用于櫛孔扇貝的抗逆優(yōu)良品種的培育和開發(fā)。
文檔編號C12P19/34GK1542134SQ20031010548
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月4日 優(yōu)先權日2003年11月4日
發(fā)明者馬洪明, 麥康森, 徐瑋, 劉付志國, 張文兵, 譚北平, 國 申請人:中國海洋大學