專利名稱：節(jié)旋藻藻藍蛋白基因的啟動子及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藻類基因工程技術的改進，具體講是一種節(jié)旋藻的藻藍蛋白基因的啟動子及其制備方法。即節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB341藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子序列及其獲得方法。其屬于分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
現有技術中，有一種節(jié)旋藻Arthrospira platensis，其屬于藍藻類，其蘊涵豐富的蛋白質。其中的藻藍蛋白是藍藻的一種重要的光合色素的主要組成部分。藻藍蛋白是由β和α亞基及發(fā)色團構成。兩該亞基的基因序列是由De Rossi于1985年克隆獲得的(De Rossi E，RiccardiG，Sanangelantoni AM and Ciferri O.Construction of cosmid library of Spirulina platensis as anapproach to DNA physical mapping.FEMS Microbiol.Letters，1985，30239.)，但是迄今為止，兩該亞基的基因序列的上游序列卻沒有被揭示，其影響了節(jié)旋藻基因工程的發(fā)展。因此，充分開發(fā)和合理利用節(jié)旋藻是現代藻類基因工程面臨的問題，如何得到高效的藻類基因啟動子一直是阻礙藻類轉基因獲得成功的關鍵因素。同時，外源基因在轉基因植物中的表達效率低是一個普遍存在而又亟待解決的問題。細菌及真核生物基因工程的啟動子在藻類基因工程中效率更低，有時甚至不起作用。這就延誤了藻類基因工程的發(fā)展。
當前，藻藍蛋白β和α亞基藍藻分子生物學的發(fā)展為藍藻基因工程研究奠定了基礎，有引入外源基因在藍藻中克隆或表達，以改進藍藻遺傳品質的研究；還有將藍藻基因在其他的表達體系中進行表達的研究。有研究報告證明食用節(jié)旋藻安全無毒。這為節(jié)旋藻的大規(guī)模養(yǎng)殖及保健食品和藥品的開發(fā)奠定了基礎。人們發(fā)現節(jié)旋藻不僅具有全面的營養(yǎng)價值，還具有多種醫(yī)療作用。眾所周知，節(jié)旋藻蘊涵豐富的蛋白質、維生素、不飽和脂肪酸、多糖和有益于人體健康的微量元素，該藻營養(yǎng)均衡，安全無毒。
本發(fā)明是在上述已經報道的節(jié)旋藻藻藍蛋白β和α亞基的基因序列的基礎上，設計了簡并引物Y1(ttgatgcctt cactaaggtg g，21bp)和Y2(gtagtagcc(t/g)at(g/a)tcacgagc，21bp)，并進行聚合酶鏈式反應，經過48℃-58℃范圍內的的復性溫度的測試，在最佳復性溫度下擴增得到長900bp的DNA片段。經測序結果分析顯示此基因片段的結構如下1-494bp為cpcB基因；495-605bp為亞基間隔區(qū)序列(IGSB-A)；606-857bp為cpcA基因，該基因序列已提交GenBank，序列登記號為AY244668。核苷酸序列測定結果如下tttctcaagc tgatactcgc ggcgaaatgc tgagtacagc tcaaatcgat gctctgagcc60aaatggttgc tgaaagcaac aaacgtttgg gttctgttaa ccgcattacc agcaacgctt120ccaccattgt ttccaacgct gctcgttctt tgttcgcaga gcaaccccaa ctgattgctc180ccggtggaaa cgcctacacc agccgtcgta tggctgcttg cttgcgtgac atggaaatca240tcctgcgcta tgtaacctac gctgtgtttg ctggcgatgc aagtgttctc gaagatcgtt300gcttgaacgg tttgcgtgaa acttacctgg ctttgggaac tcccggttct tccgttgctg360tcggtgttgg caaaatgaaa gaagctgctc tggcgatcgt taacgatccc gcaggtatca420ctcctggtga ttgtagcgct ttggcttcag aaatcgctgg ttactttgac cgtgctgctg480cagcagtttc ctaatcaagc agatccatag catataacaa ttgaaacagt ttagctgaag540
tctaagtgac tggacttctg tttgttacct aattttttgt aaaccaatcg ggagataact600cgagaatgaa aaccccccta accgaagcag tttctatcgc tgattcccaa ggtcgtttcc660taagcagcac cgaaatccaa gtagcttttg gccgttttcg tcaagccaaa gctggtctgg720aagctgctaa agctctgacc tctaaagctg atagtctgat cagtggtgct gcccaagcag780tgtacaacaa gttcccctac accacccaaa tgcagggacc taactacgcg gcagaccaac840gcggtaagga caaatgt857本發(fā)明人在以上工作的基礎上，為研制開發(fā)高效的藻類基因啟動子而設計了如下技術方案。

發(fā)明內容
本發(fā)明是來自藻類基因工程，在上述工作的基礎上，要想得到藻類基因工程的表達產物，就必須使該基因能夠表達，而表達的前提，首先要轉錄，該轉錄又取決于高效的啟動子。因此，本發(fā)明的目的是根據基因的基本功能結構，選擇和設計一個高效的藻類基因工程急需的啟動子，來完成藻類基因工程的轉錄階段任務，使外源基因的表達能夠提高效率，進而得到更多的藻類基因工程所需基因產物。本發(fā)明要選擇和設計得到的節(jié)旋藻(Arthrospira platensisFACHB341)藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子及其制備方法，要為改良和利用節(jié)旋藻奠定一個良好的基礎。
本發(fā)明的目的是由以下技術方案實現的，研制了節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其是長度為1545bp的藻藍蛋白基因的操縱子序列中的DNA片段。該DNA片段長度為427bp，其序列描述為藻藍蛋白β和α亞基基因共用的一個啟動子，該啟動子的序列表征為tcaatatttt aatgcttgta ttgacccacg gattcgctat taattccctg tcagaaaata 60tacttagtta ttaatactta gttatttttc ttaataaatt ttaacaaacc aaagggcgtt 120ggctgtgtat aaaggatatt cgaagaggtg agaaggaagg cgaatgttga tttatgaagt 180ttgattaaca tttgtatcaa aatataaaat tcttctcata aaccctgtag aatcttttaa 240gatttcggaa agtgttctag gatactgaag aaatgaacca cggggcaatt gttaaaagcc 300tttgtcgatg gttcgccccg gaaggggtct taggaggtga caccgatgga ttgattgtcg 360tgatcattca tggtgtgtcc aatcccaact caactctaag caagtcaaca agtaggagat 420aaatcc 426該序列包含有如下功能因子DOFCOREZM、EBOXBNNAPA、GT1CONSENSUS、GTGANTG10、IBOXCORE、MYBGAHV、MYBST1、POLASIG1、POLLEN1LELAT52、RAV1AAT、REALPHALGLHCB21、ROOTMOTIFTAPOX1、TAAAGSTKST1、WBOXATNPR1、-10區(qū)和-35區(qū)。
所述的-10區(qū)中具有轉錄調控功能的因子有TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT；其中CAAT因子位于第2，287，381位位點；TATA因子位于第39，70和83位位點；GATA因子為核鋅指結構DNA，其分別位于第136，262，419和464位位點。
所述的-35區(qū)中具有轉錄調控功能的因子有TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG。
所述的藻藍蛋白操縱子序列，其包括三個開放閱讀框1)、串聯在啟動子后面的、長度為519bp的β亞基基因——cpcB，該基因是結構基因，其編碼173個氨基酸殘基的多肽(β亞基)；2)、串聯在β亞基基因——cpcB后面的、長度為110bp的間隔區(qū)序列——IGSB-A；
3)、串聯在間隔區(qū)序列——IGSB-A后面的、長度為489bp的α亞基基因——cpcA，該基因是結構基因，其編碼163個氨基酸殘基的多肽(α亞基)。
本發(fā)明所述的節(jié)旋藻藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子的制備方法，該方法是以節(jié)旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)基因組為模板，采用染色體步移的方法，即用適當的限制性內切酶將基因組DNA完全消化(本實驗采用Sau3AI內切酶)，用具有相應酶切位點的接頭(由試劑盒提供)進行連接反應，用接頭引物和根據已知區(qū)域設計的引物進行第一次PCR反應；再用上一部擴增的一部分PCR產物及內側引物(接頭內側引物由試劑盒提供)進行第二次特異的擴增DNA。本發(fā)明實驗中采用的試劑盒是大連寶生物公司出品的TaKaRa LAPCRTMin vitro Cloning Kit試劑盒。
所述的PCR反應，其實驗體系如下DNA1-5μl；10×PCR緩沖液(PCR buffer) 5μl；Mg2+(25mmol/L)5-8μl；脫氧核苷三磷酸(dNTP10mmol/L) 2-5μl；引物C1(50pmol/L) 0.5-3μl；或引物C2(50pmol/L) 0.5-3μl；引物S1(50pmol/L) 0.5-3μl；或引物S2(50pmol/L) 0.5-3μl；DNA聚合酶(TaqE)0.5-1μl；用雙蒸水補足反應體系至50μl；再配以相應的實驗條件進行PCR擴增。
所述的引物C1，其序列為gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca；所述的引物C2，其序列為cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga；所述的引物S1，其序列為tgcatcgcca gcaaacacag c；所述的引物S2，其序列為gagctgtact cagcatttcg cc。
本發(fā)明的積極效果在于由于設計了一種節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其是長度為427bp，其序列描述為藻藍蛋白β和α亞基基因共用的一個啟動子，該啟動子的序列表征得如此清楚、完整，使得在藻藍蛋白β和α亞基基因轉錄起始時，與RNA聚合酶專一性接觸的-10區(qū)和-35區(qū)功能因子能夠迅速地形成復合物，并在轉錄起始位點處迅速進行轉錄。該轉錄的效率取決于本發(fā)明啟動子中表征的堿基組成如本發(fā)明的具有轉錄調控功能的因子TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT，其中CAAT因子位于第2，287，381位位點；TATA因子位于第39，70和83位位點；GATA因子為核鋅指結構DNA，其分別位于第136，262，419和464位位點；和-35區(qū)的功能因子TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG在很大程度上決定了本發(fā)明的啟動子是高效的強啟動子。經本發(fā)明人證明應用化學方法合成寡核甘酸引物誘導本發(fā)明的啟動子39位-10區(qū)的TATA的第一位和第二位堿基發(fā)生突變，獲得2個突變體(AATA，TGTA)，通過檢測突變體結合蛋白的能力，近而間接檢測啟動子的活性。凝膠阻滯實驗結果表明該啟動子的活性有所改變。單堿基突變體結合蛋白的能力明顯下降，說明單堿基突變體啟動子活性下降。突變研究表明，啟動子-10區(qū)和-35區(qū)的堿基突變，或是不同元件之間的距離改變都會使基因的轉錄活性受到影響。
本啟動子具有完整的-35區(qū)和-10區(qū)，兩功能區(qū)的間隔長度顯示它是高效啟動子，這就可以實現本發(fā)明的目的——以高效的強啟動子來完成藻類基因工程的轉錄階段任務，使外源基因的表達提高了效率，進而得到更多的改良和利用節(jié)旋藻所需的基因產物。
附圖及其實施例本發(fā)明的保護范圍不僅局限于本發(fā)明的實施例中。


圖1.節(jié)旋藻的藻藍蛋白基因的啟動子體外克隆PCR原理示意2.節(jié)旋藻的藻藍蛋白基因的啟動子及操縱子的結構示意圖參見圖1-2，圖1中Target DNA即為節(jié)旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)基因組DNA，經Restriction Enzyme Digestion即限制性酶消化(我們實驗中選擇的是Sau3AI)后，與試劑盒帶有的Sau3AI酶切位點的Cassette即接頭進行Ligation也就是連接后，作為模板，用PrimerC1和S1，即引物C1和S1，其中C1為試劑盒帶有的，S1是我們根據基因組DNA序列設計的，進行1st PCR即第一次聚合酶鏈式反應，反應的一部分產物作為模板進行2nd PCR，也就是第二次聚合酶鏈式反應，使用的PrimerC2和S2，即引物C2和S2，其中C2為試劑盒帶有的，S2是我們根據基因組DNA序列設計的，它位于S1的內側，保證了特異性擴增。
圖2中1為USSB藻藍蛋白β亞基上游序列——啟動子元件；2為cpcB藻藍蛋白β亞基基因序列；3為IGSB-A蛋白β亞基和α亞基基因間隔區(qū)序列；4為cpcA藻藍蛋白α亞基基因序列。
本發(fā)明的啟動子的制備過程是根據擴增得到的藻藍蛋白操縱子編碼β亞基基因的部分序列設計引物，首先向β亞基的上游序列移動，其由兩次PCR反應組成。第一次反應所采用的引物為S1，C1；第二反應所采用的引物為S2和C2。S1和S2根據上一步所克隆的cpcB基因所設計(見表1)。
表1.本發(fā)明的實驗所用引物及Cassette序列

表2.本發(fā)明的啟動子PCR反應設計的實驗體系


兩次PCR反應的反應條件為94℃預變性5min，94℃變性60s，50℃復性60s，72℃延伸80s，30個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃延伸10min。最終得到高效特異性的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子。
表3.藻藍蛋白操縱子cpcB基因的上游推斷的啟動子元件序列

注轉錄起始位點在表中顏色加深斜體字。推斷的-10區(qū)和-35區(qū)序列下面劃線。
經啟動子元件分析軟件分析表明cpcB基因的上游序列含有啟動子序列，其中的TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT為-10序列，GATACTG和PL序列(GTGATACTGAGCACA)完全相同；其中的TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG為-35序列(見表3的序列下面劃線)。
在向α亞基下游序列擴增的反應中，所采用的引物為PS1，PS2，C1和C2(見表1)。PS1和PS2的序列根據上一次反應的克隆序列的測序結果得到，步移結果得到了cpcA基因的全序列。
將上述得到的序列全部拼接起來，得到長度為1545bp的藻藍蛋白基因的啟動子及操縱子序列(見圖2)，其中包括四個開放閱讀框519bp的cpcB基因，它編碼173個氨基酸殘基的多肽(β亞基)；489bp的cpcA基因，編碼163個氨基酸殘基的多肽(α亞基)；110bp的cpcB基因和cpcA基因的間隔區(qū)序列；427bp的cpcB基因的上游序列——啟動子元件。
如圖1所示1為USSB藻藍蛋白β亞基上游序列——啟動子元件；2為cpcB藻藍蛋白β亞基基因序列；3為IGSB-A蛋白β亞基和α亞基基因間隔區(qū)序列；4為cpcA藻藍蛋白α亞基基因序列。
本發(fā)明中的節(jié)旋藻藻藍蛋白啟動子元件及操縱子的基因序列如下本發(fā)明推斷的核糖體結合位點(RBS)標于該序列中tcaatatttt aatgcttgta ttgacccacg gattcgctat taattccetg tcagaaaata 60tacttagtta ttaatactta gttatttttc ttaataaatt ttaacaaacc aaagggcgtt 120ggctgtgtat aaaggatatt cgaagaggtg agaaggaagg cgaatgttga tttatgaagt 180ttgattaaca tttgtatcaa aatataaaat tcttctcata aaccctgtag aatcttttaa 240gatttcggaa agtgttctag gatactgaag aaatgaacca cggggcaatt gttaaaagcc 300tttgtcgatg gttcgccccg gaaggggtct taggaggtga caccgatgga ttgattgtcg 360tgatcattca tggtgtgtcc aatcccaact caactctaag caagtcaaca agtaggagat 420aaatcc 426 RBS→CPCB
atgtttgatg ccttcaccaa ggtggtttct caagctgata ctcgcggcga aatgctgagt 486acagctcaaa tcgatgctct gagccaaatg gttgctgaaa gcaacaaac gtttggattc 546tgttaaccgc attaccagca acgcttccac cattgtttcc aacgctgctc gttctttgtt 606cgcagagcaa ccccaactga ttgctcccgg tggaaacgcc tacaccagcc gtcgtatggc 666tgcttgcttg cgtgacatgg aaatcatcct gcgctatgta acctacgctg tgtttgctgg 726cgatgcaagt gttctcgaag atcgttgctt gaacggtttg cgtgaaactt acctggcttt 786gggaactccc ggttcttccg ttgctgtcgg tgttggcaaa atgaaagaag ctgctctggc 846gatcgttaac gatcccgcag gtatcactcc tggtgattgt agcgctttgg cttcagaaat 906cgctggttac tttgaccgtg ctgctgcagc agtttcctaa tcaagcagat ccatagcata 966taacaattga aacagtttag ctgaagtcta agtgactgga cttctgtttg ttacctaatt 1026ttttgtaaac caatcgggagataactcgag a 1057RBS→CPCAatgaaaaccc ccctaaccga agcagtttct atcgctgatt cccaaggtcg tttcctaagc 1117agcaccgaaa tccaagtagc ttttggccgt tttcgtcaag ccaaagctgg tctggaagct 1177gctaaagctt tgacctctaa agctgatagt ctgatcagtg gtgctgccca agcagtgtac 1237aacaagttcc cctacaccac ccaaatgcag ggacctaact acgcggcaga ccaacgcggt 1297aaggacaaat gtgctcgtga cataggctac tacctgcgga tggtaactta ttgcctgatt 1357gctggtggaa ctggccccat ggatgagtac ctgattgccg gtattgatga aatcaaccgg 1417actttcgagc tttctccaag ctggtacatt gaagccctga aatacatcaa agctaaccac 1477ggtttgtctg gtgacgctgc tgttgaagct aactcctacc tcgactacgc gatcaacgcc 1537ctgagctag 1546在該序列中，β亞基基因與α亞基基因共用一個啟動子元件。該啟動子元件中的某些序列，如-10區(qū)序列(TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT)和-35區(qū)序列(TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG)具有轉錄調控因子的功能，是基因表達調控必須的，如若缺失導致啟動子失活。其中上游的第2，287，381位是CAAT位點，TATA因子位于第39，70和83位。GATA因子被認為是核鋅指結構DNA結合蛋白家族，能夠調節(jié)特異性靶基因的表達，它們分別位于第136，262，419和464位。
本發(fā)明獲得的節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB341藻藍蛋白β和α亞基基因啟動子，促使節(jié)旋藻基因在其他受體中高效表達成為可能。
本發(fā)明的啟動子應用實施例4將本發(fā)明的啟動子連接到啟動子探測載體——綠色熒光蛋白質粒，用常規(guī)超聲轉化法轉到節(jié)旋藻中，24小時后觀察熒光情況。具體實驗設計如下根據cpcB基因的上游序列，再設計引物PS2和PS3，常規(guī)PCR方法擴增cpcB基因的起始密碼子上游，這對引物擴增時去除了藻藍蛋白操縱子的編碼區(qū)，從而保證了啟動子探測載體上多克隆位點下游的gfp基因的讀碼框不被破壞。啟動子探測載體綠色熒光蛋白報告基因用限制性內切酶SmaI進行切割產生平末端后，自制T載體，連接采用連接試劑盒進行。反應體系在16℃溫育3hrs。連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞。用PCR反應篩選陽性重組子(PT)。將陽性克隆菌落培養(yǎng)后，通過序列測定確定插入為正向。提取質粒用常規(guī)超聲轉化法轉到節(jié)旋藻中，24小時后用德國產的熒光顯微鏡(AxiophotPhotomicroscope From Carl Zeiss HB050)進行熒光檢測，選定激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為507nm。經與對照組比較，實驗樣品組細胞發(fā)出很強的綠色熒光。經流式細胞儀測量其熒光強度，與對照組相比螢光極大增強，對照組平均熒光強度為14.8，而實驗樣品組平均熒光強度為30.5。
本發(fā)明的節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB341藻藍蛋白β和α亞基啟動子的獲得，促進了藻類基因工程的發(fā)展，為藻類種質改良提供了前提，使外源基因在節(jié)旋藻中或節(jié)旋藻基因在其他受體——大腸桿菌DH5α中實現了高效表達。
權利要求
1.一種節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其是長度為1545bp的藻藍蛋白基因的操縱子序列中的DNA片段，其特征在于該DNA片段長度為427bp，其序列描述為藻藍蛋白β和α亞基基因共用的一個啟動子，該啟動子的序列表征為tcaatatttt aatgcttgta ttgacccacg gattcgctat taattccctg tcagaaaata 60tacttagtta ttaatactta gttatttttc ttaataaatt ttaacaaacc aaagggcgtt 120ggctgtgtat aaaggatatt cgaagaggtg agaaggaagg cgaatgttga tttatgaagt 180ttgattaaca tttgtatcaa aatataaaat tcttctcata aaccctgtag aatcttttaa 240gatttcggaa agtgttctag gatactgaag aaatgaacca cggggcaatt gttaaaagcc 300tttgtcgatg gttcgccccg gaaggggtct taggaggtga caccgatgga ttgattgtcg 360tgatcattca tggtgtgtcc aatcccaact caactctaag caagtcaaca agtaggagat 420aaatcc 426。
2.根據權利要求1所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其特征在于所述的該啟動子的序列中包含有如下功能因子DOFCOREZM、EBOXBNNAPA、GT1CONSENSUS、GTGANTG10、IBOXCORE、MYBGAHV、MYBST1、POLASIG1、POLLEN1LELAT52、RAV1AAT、REALPHALGLHCB21、ROOTMOTIFTAPOX1、TAAAGSTKST1、WBOXATNPR1、-10區(qū)和-35區(qū)。
3.根據權利要求2所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其特征在于所述的-10區(qū)中具有轉錄調控功能的因子有TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT；其中CAAT因子位于第2，287，381位位點；TATA因子位于第39，70和83位位點；GATA因子為核鋅指結構DNA，其分別位于第136，262，419和464位位點。
4.根據權利要求2所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其特征在于所述的-35區(qū)中具有轉錄調控功能的因子有TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG。
5.根據權利要求1所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，其特征在于所述的藻藍蛋白操縱子序列，其包括三個開放閱讀框1)、串聯在啟動子后面的、長度為519bp的β亞基基因——cpcB，該基因是結構基因，其編碼173個氨基酸殘基的多肽(β亞基)；2)、串聯在β亞基基因——cpcB后面的、長度為110bp的間隔區(qū)序列——IGSB-A；3)、串聯在間隔區(qū)序列——IGSB-A后面的、長度為489bp的α亞基基因——cpcA，該基因是結構基因，其編碼163個氨基酸殘基的多肽(α亞基)。
6.根據權利要求1所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子的制備方法，所述的該方法是以節(jié)旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)基因組為模板，采用染色體步移的方法，即用適當的限制性內切酶將基因組DNA完全消化，用具有相應酶切位點的接頭，進行連接反應，其特征在于該反應是用接頭引物C1和根據已知區(qū)域設計的引物S1而進行了第一次PCR反應；再用上一部擴增的一部分PCR產物及內側引物C2、S2進行第二次特異的擴增DNA；所述的PCR反應，其實驗體系如下DNA 1-5μl；10×PCR緩沖液(PCR buffer) 5μl；Mg2+(25mmol/L) 5-8μl；脫氧核苷三磷酸(dNTP10mmol/L)2-5μl；引物C1(50pmol/L)0.5-3μl；或引物C2(50pmol/L) 0.5-3μl；引物S1(50pmol/L)0.5-3μl；或引物S2(50pmol/L) 0.5-3μl；DNA聚合酶(TaqE) 0.5-1μl；用雙蒸水補足反應體系至50μl；再配以相應的實驗條件進行PCR擴增。
7.根據權利要求6所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子的制備方法，其特征在于所述的引物S1，其序列為tgcatcgcca gcaaacacag c；
8.根據權利要求6所述節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子的制備方法，其特征在于所述的引物S2，其序列為gagctgtact cagcatttcg cc。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種節(jié)旋藻的藻藍蛋白β和α亞基基因的啟動子，該DNA片段長度為427bp，其序列描述為藻藍蛋白β和α亞基基因共用的一個啟動子。該序列包含有如下功能因子－10區(qū)和－35區(qū)主要功能區(qū)及DOFCOREZM、EBOXBNNAPA、GT1CONSENSUS、GTGANTG10、IBOXCORE等功能因子。本啟動子具有完整的－35區(qū)和－10區(qū)，兩功能區(qū)的間隔長度顯示它是高效啟動子，這就可以實現以高效的強啟動子來完成藻類基因工程的轉錄階段任務，使外源基因的表達提高了效率，進而得到更多的改良和利用節(jié)旋藻所需的基因產物。本啟動子應用在啟動子探測載體——綠色熒光蛋白中實現了高效表達，證明了其可開發(fā)性。
文檔編號C12N15/11GK1528892SQ20031010541
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權日2003年10月16日
發(fā)明者張學成, 劉金姐, 隋正紅, 茅云翔, 任雪瑩 申請人:中國海洋大學