專(zhuān)利名稱(chēng)：分離和鑒別在含有核酸的生物樣品中可能存在的各種功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的在于提供一種方法，所述方法使得能夠分離含有核酸的生物樣品中可能存在的各種功能，并且在對(duì)DNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯后，通過(guò)體外蛋白質(zhì)表達(dá)而鑒定所述功能。按照本發(fā)明方法，對(duì)功能的鑒定可通過(guò)生物化學(xué)分析的方法來(lái)確定，以及任選地也可通過(guò)克隆的方法或通過(guò)對(duì)多核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序的方法來(lái)確定。
因此，本發(fā)明的方法尤其可對(duì)具有確定的或可以確定的功能的基因或其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分離。
對(duì)新基因和/或其編碼的蛋白質(zhì)的研究是眾多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的主要目標(biāo)。事實(shí)上，基因療法和細(xì)胞療法或通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法來(lái)創(chuàng)建新的動(dòng)物和植物，對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物的健康、診斷和飼養(yǎng)而言，這些方法已經(jīng)燃起了新的希望，但這些方法特別需要對(duì)眾多的基因和/或蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行逐一辯認(rèn)。因此，存在有眾多的通過(guò)克隆和蛋白質(zhì)表達(dá)而分離和篩選基因的技術(shù)。
在這些技術(shù)中，其中有一項(xiàng)技術(shù)稱(chēng)之為“基因組”(genomics)技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵在于對(duì)某一生物體的基因組組進(jìn)行部分或全部測(cè)序，然后搜索與潛在編碼序列的數(shù)據(jù)庫(kù)中的已鑒別序列的同源性。這些序列一旦得到確認(rèn)，它們就可以進(jìn)行亞克隆并表達(dá)，以便檢查這些序列是否編碼所研究的性質(zhì)。除了實(shí)施過(guò)程需要時(shí)間外，這項(xiàng)技術(shù)還表現(xiàn)出某些缺陷，它只能分辨出一些與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的和參考的功能同源的功能。
對(duì)于研究感興趣的各種性質(zhì)，蛋白質(zhì)組(proteomics)技術(shù)是第二種可以采取的方法。這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵在于從微生物中提取表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行提純。此時(shí)，提純的每個(gè)部分都要進(jìn)行試驗(yàn)以便檢測(cè)哪一部分含有需要的性質(zhì)。這一技術(shù)的主要缺陷在于如下的事實(shí)它無(wú)法獲得所檢測(cè)性質(zhì)和表達(dá)這一性質(zhì)的基因之間的直接聯(lián)系。這一技術(shù)的第二個(gè)缺陷是，它不可能檢測(cè)到在起始微生物中尚未被誘導(dǎo)出的性質(zhì)。
檢測(cè)某一微生物表達(dá)的功能的第三項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵在于使用表達(dá)克隆方法。這一方法的原理就是從起始微生物中提取DNA，將DNA片段化，并且把它插入到體內(nèi)表達(dá)載體中，這個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主。選擇宿主的表達(dá)起始微生物的基因的能力。用同樣的方法，選擇的載體總是與宿主相容的。表達(dá)克隆這一技術(shù)可以用在搜索對(duì)某一微生物的某一功能，這種微生物與現(xiàn)有宿主中一個(gè)具有相近的遺傳性質(zhì)(相同的密碼子利用，相同的GC百分比)。從大量的遺傳來(lái)源各異的微生物著手對(duì)某一功能進(jìn)行搜索的情況下，表達(dá)克隆方式不適用，因?yàn)樗拗饕巡辉倌軌虮磉_(dá)被提供給它們的那些異源基因。
此外，與其他分離和篩選基因的現(xiàn)有技術(shù)方法一樣，表達(dá)克隆方法也有許多的缺陷--轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的細(xì)胞毒性，為暫時(shí)對(duì)付這些毒性的問(wèn)題，它們可能會(huì)引起基因重組；--所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)的代表性較差；--實(shí)施的時(shí)間；--在克隆的基因序列和使用的表達(dá)載體之間相容性較差；--表達(dá)水平變化巨大；--密碼子的使用問(wèn)題；--重折疊以及翻譯后修飾的問(wèn)題；--當(dāng)直接在原始的細(xì)胞提取物中尋找蛋白質(zhì)的活性時(shí)，由于細(xì)胞的生理狀況對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平會(huì)產(chǎn)生影響，因而這將會(huì)帶來(lái)一些問(wèn)題；--自動(dòng)化難度大。
本發(fā)明的目的旨在準(zhǔn)確無(wú)誤地克服這些缺陷，同時(shí)提供一種快速和有效地鑒別與含有核酸的生物樣品中所含的多核苷酸序列相關(guān)的功能的方法，本發(fā)明同樣也可分離出上面所說(shuō)的這種序列。
這一目的通過(guò)分離和鑒定一含有核酸的生物樣品中可能存在的各種功能的方法而實(shí)現(xiàn)，所述方法特征在于包含如下的步驟(a)從所說(shuō)的生物樣品開(kāi)始制備核酸片段；(b)將每個(gè)所說(shuō)的片段與載體分子進(jìn)行結(jié)合；(c)分離步驟(b)的與載體分子相結(jié)合的每個(gè)片段，或由片段與載體分子的結(jié)合組成的每一結(jié)構(gòu)的一部分；(d)對(duì)步驟(c)中與載體分子相結(jié)合的每個(gè)片段，或由片段與載體分子的結(jié)合組成的每一結(jié)構(gòu)的一部分在體外進(jìn)行處理，以獲得轉(zhuǎn)錄物；(e)測(cè)試在步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物的功能，或在轉(zhuǎn)錄物的翻譯后測(cè)試所編碼的蛋白質(zhì)的功能。
本發(fā)明的方法可提供如下的益處--當(dāng)步驟(d)的轉(zhuǎn)錄物具有tRNA，核酶類(lèi)型的有益的性質(zhì)時(shí)，可對(duì)步驟(d)轉(zhuǎn)錄物的各種性質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。
--對(duì)由所述轉(zhuǎn)錄物編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。
當(dāng)測(cè)試步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物所編碼的蛋白質(zhì)的功能時(shí)，本發(fā)明的方法包括在步驟(d)利用一細(xì)胞提取物對(duì)所述轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行體外處理，將其翻譯成蛋白質(zhì)，然后利用任何適宜的方法對(duì)所述蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明中所述的功能更具體地是可被多核苷酸序列編碼的性質(zhì)。例如，如果所述序列編碼蛋白質(zhì)，則這種性質(zhì)可以是酶活性或者親和性，或者如果所述序列編碼催化mRNA，則例如是內(nèi)切核酸酶的活性。
因此，本發(fā)明的方法不僅可以檢測(cè)功能，而且還可以從生物化學(xué)方面鑒定這一功能。例如，如果這種功能是酶活性，那么就可以對(duì)有功能的最佳條件(PH值、溫度、鹽的濃度)，動(dòng)力學(xué)的參數(shù)(Vm、Rm)以及抑制參數(shù)(Ki)進(jìn)行分析。如果功能是親和性，那么可以確定Kd，或確定對(duì)這種蛋白質(zhì)最有親和力的分子。還可以確定翻譯的蛋白質(zhì)的大小或經(jīng)mRNA轉(zhuǎn)錄物的大小，以及任選地測(cè)序相應(yīng)基因。
生物樣品是指任何可能含有核酸的樣品，如土壤樣品，植物樣品，血液樣品(人類(lèi)的血液或動(dòng)物的血液)，水樣品，微生物、細(xì)胞或病毒培養(yǎng)物樣品，生物活檢樣品等，但這些樣品也包括擴(kuò)增產(chǎn)物(PCR、NASBA等)、基因組的DNA、合成的DNA、mRNA，或得自本領(lǐng)域技術(shù)人員常用處理的任何核酸產(chǎn)物。
載體分子是指一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列，其包含用于步驟(d)至少的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，以及也有可能包含一種促進(jìn)步驟(c)的片段分離的物質(zhì)。任選地，這種物質(zhì)可以是一個(gè)或多個(gè)分子的鏈親和素或生物素，或者polypyrol基團(tuán)，或者抗體；這種物質(zhì)也可以是單鏈或雙鏈多核苷酸序列，優(yōu)選地不含使相連片段體內(nèi)表達(dá)的DNA質(zhì)粒載體，或使步驟(c)的片段得以分離的任何其他化合物。
本發(fā)明方法的步驟(c)的分離是指在步驟(b)獲得的片段混合物可以再分為亞集合，每個(gè)亞集合可由一個(gè)或幾個(gè)核酸片段組成。
如果從生物樣品中無(wú)法直接獲得核酸的話(huà)，例如，核酸包含在細(xì)胞、病毒、血液、有機(jī)組織等中，那么本發(fā)明方法中核酸片段的制備步驟(a)可以包含一個(gè)提取步驟。這一提取步驟此時(shí)應(yīng)包含在步驟(a)對(duì)核酸片段的制備過(guò)程中。同樣，當(dāng)生物樣品的組成為mRNA時(shí)，那么對(duì)于制備步驟(a)的核酸片段來(lái)說(shuō)，RT-PCR這一步驟是必不可少的。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，載體分子由兩個(gè)多核苷酸序列組成，這兩個(gè)多核苷酸序列中的每個(gè)序列包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些序列中的每個(gè)序列均與步驟(a)獲得的片段的末端相連。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，由載體分子攜帶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可以是強(qiáng)型的啟動(dòng)子，如T7RNA聚合酶、SP6,Qβ或λ噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明方法的一特定用途使得能夠從含有核酸的樣品中鑒別具有某一功能的多核苷酸序列和/或相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這一目標(biāo)通過(guò)如下的方法達(dá)到，所述方法包含以下的各個(gè)步驟(a)從所說(shuō)的生物樣品開(kāi)始制備核酸片段；(b)將每個(gè)所說(shuō)的片段插入載體中以產(chǎn)生重組載體；(c)通過(guò)任何合適的方式分離每個(gè)重組載體，或這一重組載體的一部分；(d)對(duì)步驟c)中分離的載體或重組載體的一部分在體外進(jìn)行處理，以獲得轉(zhuǎn)錄物；(e)測(cè)試在步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物的功能，或在轉(zhuǎn)錄物的翻譯后用任何合適的方式測(cè)試所編碼的蛋白質(zhì)的功能。
在本發(fā)明方法中，重組載體是指一種其中已導(dǎo)入一片段的載體，如質(zhì)粒載體。這種載體的一部分是指重組載體的包含步驟(a)獲得的片段以及實(shí)施步驟(d)和任選地步驟(e)時(shí)所需的成分的部分。
本發(fā)明方法的各個(gè)步驟可由同一個(gè)操作人員連續(xù)不間斷地優(yōu)選在一個(gè)自動(dòng)化的裝置上很方便地完成，這個(gè)自動(dòng)化的裝置涵蓋上述步驟中的每一步驟；或者，也可采取間斷的方式來(lái)進(jìn)行操作，如需要的話(huà)也可由不同的人員進(jìn)行操作。
片段的轉(zhuǎn)錄步驟(d)和步驟(e)的翻譯步驟同樣也可在稱(chēng)為體外蛋白質(zhì)表達(dá)反應(yīng)或EPIV反應(yīng)中聯(lián)合進(jìn)行。EPIV反應(yīng)可以同時(shí)進(jìn)行，這意味著步驟(e)的翻譯步驟可與步驟(d)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，或分成兩個(gè)不同的步驟，一個(gè)是轉(zhuǎn)錄步驟，另一個(gè)是翻譯步驟。
步驟(d)和步驟(e)的非偶聯(lián)可使得每個(gè)步驟的產(chǎn)率最佳化，由此生成較多數(shù)量的蛋白質(zhì)，在低比活酶的情況下，這一點(diǎn)將顯著有用。
同樣，這樣的非偶聯(lián)可使得校正步驟(e)所生成的產(chǎn)物，以及可使得在以后對(duì)表達(dá)出的不同的功能進(jìn)行比較。
如果是經(jīng)PCR制備的話(huà)，那么轉(zhuǎn)錄步驟(d)和翻譯步驟(e)的分開(kāi)進(jìn)行也同樣可避免DNA模板被核酸酶降解的問(wèn)題。事實(shí)上，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的所有成分較少受到核酸酶的污染，這正好與翻譯提取物相反。
此外，根據(jù)目標(biāo)DNA的不同來(lái)源，轉(zhuǎn)錄步驟(d)和翻譯步驟(e)的分開(kāi)進(jìn)行也使得能夠利用不同的翻譯提取物。事實(shí)上，有利的是利用與本發(fā)明方法所用的生物樣品同一來(lái)源或接近來(lái)源的翻譯提取物進(jìn)行步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物的步驟(e)的翻譯。因此，轉(zhuǎn)錄物翻譯信號(hào)的來(lái)源和細(xì)胞提取物的來(lái)源之間的相關(guān)性被優(yōu)化以得到最佳翻譯效率。例如，可以引述的是使用嗜極菌的翻譯提取物篩選同一生物體或另一嗜極菌(嗜熱菌、嗜鹽菌、嗜酸菌等等)的DNA文庫(kù)；或者使用真核細(xì)胞翻譯提取物對(duì)真核細(xì)胞的DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。這些相應(yīng)的提取物分別可以改善這種方法的效率。選擇這些提取物是因?yàn)槠湓诓襟E(e)翻譯轉(zhuǎn)錄物的能力。
本發(fā)明方法引人注意的地方就在于在步驟(d)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的斷點(diǎn)和使用的翻譯提取物之間，人們可以獲得一種最佳的適應(yīng)。同樣，這些提取物的特征還在于，要么它們不含有人們需求和研究的性質(zhì)；要么它們含有這一性質(zhì)，但在檢測(cè)所需求和研究的功能的測(cè)試條件下，這一性質(zhì)無(wú)法得到檢測(cè)。例如，使用含有中溫菌β-半乳糖苷酶活性的翻譯提取物可允許嗜熱菌β-半乳糖苷酶mRNA的翻譯并在高溫條件下檢測(cè)后者的活性，這樣就可去除中溫菌β-半乳糖苷酶的活性。
步驟(a)獲得的片段，根據(jù)它們不同的基因來(lái)源(即革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性微生物的DNA，真核DNA、病毒DNA等)，以及所檢測(cè)的功能，可使用不同的翻譯提取物。
本發(fā)明方法的一種特定的實(shí)施方案中，其關(guān)鍵就在于在步驟(e)使用一種翻譯提取物，這種提取物實(shí)際上是許多翻譯提取物的混合物。例如，可將過(guò)表達(dá)侶伴蛋白A的大腸桿菌的翻譯提取物與過(guò)量表達(dá)侶伴蛋白B的大腸桿菌的翻譯提取物進(jìn)行混和。所有的混和類(lèi)型均包括在內(nèi)，只要它與上面描述的性質(zhì)相一致。用同樣的方法，也可以使用如下這種翻譯提取物這個(gè)提取物加有一個(gè)或多個(gè)密碼子的一個(gè)或多個(gè)特異tRNAs。這樣獲得的翻譯提取物此時(shí)就可以翻譯含有特異密碼子的mRNA，例如，翻譯一個(gè)含有琥珀密碼子的mRNA時(shí)，在翻譯提取物中添加一個(gè)或多個(gè)tRNA抑制物。
用翻譯提取物對(duì)步驟(e)的處理也可用通用的某一翻譯提取物來(lái)實(shí)現(xiàn)，而不管生物樣品的來(lái)源，例如，它可以是大腸桿菌和/或任何其它細(xì)胞提取物，其中補(bǔ)加或未補(bǔ)加感興趣的分子，例如，上面提到的一些分子(tRNA，侶伴蛋白等等)。
同樣，在步驟(e)的翻譯提取物中也可添加一種或多種物質(zhì)，這樣有利于表達(dá)的蛋白質(zhì)更為有效重折疊或有利于這些蛋白質(zhì)更為有效的成熟，這樣的物質(zhì)如侶伴蛋白、去污劑、硫代甜菜堿、膜提取物等。
可利用各種各樣適宜的方法對(duì)步驟(e)合成的蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行測(cè)試，這種測(cè)試?yán)缈梢詸z測(cè)所研究的酶的一種或幾種活性。當(dāng)從來(lái)自一種或多種嗜極菌的DNA的樣品開(kāi)始搜索具有原始性質(zhì)的酶時(shí)，這一實(shí)施方案更特別適用，例如在高溫下、在酸性的環(huán)境中以及在鹽度很濃的環(huán)境中有活性的熱穩(wěn)定的酶。嗜極菌酶經(jīng)常在接近產(chǎn)生它們的菌株的生理?xiàng)l件(溫度、鹽濃度、PH值等等)的條件下才有活性，這樣的嗜極菌酶對(duì)于眾多的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程(農(nóng)商業(yè)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)業(yè)、造紙業(yè)、洗滌業(yè)、紡織業(yè)等)來(lái)說(shuō)都是一些十分有用的工具，在這些眾多的生產(chǎn)過(guò)程中，這些酶可替代它們的中溫同系物。
本發(fā)明的方法可提供如下的益處--當(dāng)步驟(d)的轉(zhuǎn)錄物具有tRNA，核酶類(lèi)型的有益的性質(zhì)時(shí)，可對(duì)步驟(d)轉(zhuǎn)錄物的各種性質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，或--對(duì)由所述轉(zhuǎn)錄物編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。
舉例來(lái)說(shuō)，在具有核酸內(nèi)切酶活性的核酶情況下，可使用具有一端有熒光團(tuán)和另一端有“猝滅”基團(tuán)的核苷酸基質(zhì)檢測(cè)這一活性。在這一基質(zhì)被核酶切割時(shí)，熒光團(tuán)將會(huì)與“猝滅”基團(tuán)分開(kāi)，這樣就會(huì)首次釋放出熒光。
在tRNA情況下，可以使用例如可能含有這種tRNA的反應(yīng)部分，并將這部分放置在一個(gè)體外翻譯反應(yīng)中，這一翻譯反應(yīng)含有一報(bào)道基因的mRNA，這些報(bào)道基因密碼子中的一個(gè)密碼子只有通過(guò)所尋找的tRNA才能閱讀。如果檢測(cè)到報(bào)道基因的活性，這就說(shuō)明，在初始的部分里含有該tRNA，以及可以對(duì)報(bào)道基因的mRNA在體外進(jìn)行翻譯。
在證實(shí)了某種酶活性的情況下，專(zhuān)業(yè)人員可以考慮使用各種類(lèi)型的特異底物以在步驟(e)證實(shí)所尋找的功能是否存在。所尋找的一或幾種功能對(duì)底物的所有轉(zhuǎn)化可利用熟知的方式(熒光測(cè)定法、比色測(cè)定法、吸收值、粘度等)檢測(cè)。
在證實(shí)了親和性的情況下，根據(jù)所尋找的親和性抗體-抗原，雙鏈DNA結(jié)合蛋白，受體-配體等，可例如應(yīng)用如下測(cè)試如放射標(biāo)記配體的固定，包含固定化抗原的免疫學(xué)檢測(cè)，其用尋找的抗體特異檢測(cè)，這一尋找的抗體的揭示是通過(guò)與可揭示的報(bào)道活性偶聯(lián)的抗抗體的抗體，或者使用山羊抗體的抗原檢測(cè)，山羊抗體固定在一個(gè)能夠識(shí)別抗原的支持物上，利用兔第二抗體(形成夾心結(jié)構(gòu))便可檢測(cè)到這一抗原，而兔抗體間接地或根本不與報(bào)道活性(堿性磷酸酶型或過(guò)氧化物酶型)聯(lián)結(jié)在一起。
本發(fā)明的一特定實(shí)施方案步驟(e)由平行測(cè)試或者同時(shí)或不同時(shí)測(cè)試單個(gè)功能或多個(gè)功能的不同性質(zhì)組成。
因此，本發(fā)明方法的引人注意之處就在于它不僅可以檢測(cè)可能包含在一生物樣品中的那些功能，而且--當(dāng)這些性質(zhì)作為例如酶活性或親和性的性質(zhì)時(shí)，可對(duì)它們進(jìn)行定量分析，--可鑒定尤其是生物化學(xué)鑒定如發(fā)揮功能的最佳條件溫度、PH值、鹽的濃度等，分子量，蛋白質(zhì)測(cè)序，和任選地測(cè)序相應(yīng)的多核苷酸序列。
本發(fā)明方法引人注意之處還在于，它完全獨(dú)立于體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)。細(xì)胞宿主，如微生物，如果使用這些宿主，那么只有對(duì)異源片段進(jìn)行分離和擴(kuò)增時(shí)，它們才成為宿主。因此，本發(fā)明的方法可以避免現(xiàn)有技術(shù)的表達(dá)克隆方法所提及的各種問(wèn)題。本發(fā)明方法尤其令人感興趣的是鑒定表達(dá)細(xì)胞毒素蛋白的基因。從這一意義上說(shuō)，與步驟(b)的每個(gè)片段相聯(lián)的載體分子可以是一個(gè)質(zhì)粒載體，它優(yōu)選地不能在體內(nèi)表達(dá)所說(shuō)片段。這種載體的例子為pBR322或pACYC184。
有利地，本發(fā)明的方法在步驟(a)制備的片段可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核酸內(nèi)切酶作用在生物樣品的核酸上或所說(shuō)核酸的PCR產(chǎn)物上而獲得。同樣，也可通過(guò)機(jī)械作用這些核酸獲得這些片段，例如，通過(guò)注射器針頭，在壓力下的破碎，超聲波處理等。
在本發(fā)明方法的一特定實(shí)施方案中，其中生物樣品中的核酸不需片段化如基因組文庫(kù)，步驟(a)的制備用于步驟(b)的片段包括利用如提取和/或純化和/或末端的制備以便與載體分子相聯(lián)，比如說(shuō)插入到質(zhì)粒載體中。
在本發(fā)明方法的一特定實(shí)施方案中，當(dāng)生物樣品來(lái)自某一原核生物體時(shí)，步驟(a)制備的那些片段，其大小為1至幾十kb，優(yōu)選的是1～40kb，有利的是這些片段的大小在1～10kb之間。優(yōu)選地，步驟(a)制備的那些片段的大小為5kb。事實(shí)上，原核生物基因的平均大小約為1000個(gè)堿基對(duì)。通過(guò)使用5000個(gè)堿基對(duì)的片段，可以獲得一些克隆，這些克隆攜帶具有合適核糖體結(jié)合位點(diǎn)的完整的基因。當(dāng)DNA來(lái)源于某一真核細(xì)胞時(shí)，步驟(a)制備的那些片段的大小更重要，較為有益的是，這些大小最好在幾十至幾百個(gè)kb之間。
要注意的是，步驟(a)制備的那些片段可帶有部分或完整的操縱子。
制備步驟(a)的片段的生物樣品可以來(lái)自一個(gè)或多個(gè)相同或不同的原核生物或真核細(xì)胞，甚至病毒。例如，它可以是一個(gè)微生物或微生物混合物的核酸樣品，或者是真核組織細(xì)胞核酸樣品，或相同的或不同生物體的核酸樣品。但是，核酸的樣品同樣也可由一核酸序列或由核酸文庫(kù)組成。生物樣品的組成也可是生物體和/或已知或未知的或核酸。從理想的角度而言，這一樣品的組成最好是合成核酸。
在使用真核細(xì)胞DNA文庫(kù)的情形下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可應(yīng)用例如核提取物(3)由mRNA在體外剪接和成熟的反應(yīng)來(lái)完成。
本發(fā)明的方法確保在步驟(e)證實(shí)的功能和相應(yīng)的多核苷酸效率之間有直接的聯(lián)系。因而，這一方法尤其適用于從基因組的DNA開(kāi)始檢測(cè)功能和鑒別相應(yīng)的基因?；蚴侵妇哂猩飳W(xué)功能的DNA片段或序列。
正如上面所指出的那樣，根據(jù)本發(fā)明方法的一特定實(shí)施方案，在步驟(b)與制備的核酸片段結(jié)合在一起的載體分子是一個(gè)質(zhì)粒載體。在這種情形下，在本發(fā)明方法的步驟(b)中，每個(gè)片段都在克隆位點(diǎn)或限制盒水平插入到一個(gè)載體中。質(zhì)粒載體的特點(diǎn)是，其在克隆位點(diǎn)的一側(cè)包含RNA聚合酶啟動(dòng)子，并任選地在另一側(cè)包含RNA聚合酶終止子。同樣，也可設(shè)計(jì)這樣的一個(gè)載體，它含有一個(gè)克隆位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)周?chē)h(huán)繞的是兩個(gè)相同或相異的RNA聚合酶啟動(dòng)子并且可在兩側(cè)具有相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)RNA聚合酶終止子。這些啟動(dòng)子，和可能的終止子優(yōu)選在可用于在步驟(c)分離重組載體的微生物中不能發(fā)揮功能。
在載體中沒(méi)有RNA聚合酶啟動(dòng)子和/或任選的終止子的情況下，或者在RNA聚合酶啟動(dòng)子和可能的終止子不適合實(shí)現(xiàn)步驟(d)的情況下，這些啟動(dòng)子和可能的終止子可采取任何相應(yīng)的措施在本發(fā)明方法的步驟(c)插入。本發(fā)明方法的一有利的實(shí)施方案，是用攜帶啟動(dòng)子和終止子序列的一套引物進(jìn)行PCR。
根據(jù)本發(fā)明方法的一特定實(shí)施方案，啟動(dòng)子和可能的終止子都是強(qiáng)型的，如T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子和終止子。
在載體分子是一個(gè)質(zhì)粒載體的情況下，步驟(c)中重組載體的分離可通過(guò)用在步驟(b)獲得的所有重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來(lái)完成，從而建立一個(gè)克隆文庫(kù)，然后采用任何適宜的方法提取文庫(kù)的每個(gè)克隆包含的重組載體或載體的一部分。
重組載體的提取或兩側(cè)是相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)RNA聚合酶啟動(dòng)子和可能的終止子的重組載體的一部分的提取，可采用本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)完成，例如，用質(zhì)粒微量制備和可能的消化，或用PCR來(lái)實(shí)現(xiàn)。一種有利的方法是用經(jīng)硫代磷酸酯基團(tuán)保護(hù)免受5′核酸酶攻擊尤其是包含在翻譯介質(zhì)中的核酸酶的攻擊的寡核苷酸來(lái)進(jìn)行這一PCR。
正如上述所指出的那樣，步驟(c)的分離可通過(guò)任何物理的、機(jī)械的或化學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)，如對(duì)在步驟(b)與載體分子相聯(lián)的所有片段的簡(jiǎn)單極限稀釋。但是，可以采取其它的方法進(jìn)行更為有效的分離，即利用包含在載體分子中的特殊物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行分離，如抗體分子，如此可使用抗體-抗原的親和性來(lái)對(duì)片段進(jìn)行分離，或生物素，如此可利用生物素-鏈親和素來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，等等。
按照本發(fā)明方法的一特定實(shí)施方案，可實(shí)現(xiàn)對(duì)在步驟(c)獲得的與載體分子相結(jié)合的片段或其一部分的挑選。為此，對(duì)于在步驟(c)獲得的與載體分子相聯(lián)結(jié)合的每個(gè)片段或其一部分可進(jìn)行EPIV反應(yīng)，即在步驟(e)翻譯過(guò)程的反應(yīng)混和物中摻入蛋白質(zhì)合成的標(biāo)記(生物素化tRNA、修飾的氨基酸等)。然后例如用ELISA分析每-EPIV反應(yīng)的產(chǎn)物是否存在已得到表達(dá)的蛋白質(zhì)。確定EPIV反應(yīng)呈陰性的與載體分子結(jié)合的那些片段或其一部分。這些片段在它們插入物中不具有ORF。在完成預(yù)先篩選這一工作程序后，去除這些片段，隨后進(jìn)行與蛋白質(zhì)相關(guān)的活性鑒定篩選。這樣的一個(gè)預(yù)篩選的方法，在多次重復(fù)篩選以及同一個(gè)文庫(kù)不進(jìn)行同時(shí)篩選的情形下，可以節(jié)省時(shí)間和試劑。
按照一特定實(shí)施方案，本發(fā)明方法完全能在一個(gè)固相芯片型支持物、膜或納滴定板上實(shí)現(xiàn)。芯片型支持物可以是一塊玻璃板，一張硝酸纖維素膜或本領(lǐng)域已知的任何其它支持物。在這種芯片型或納滴定板支持物上，與載體分子相結(jié)合的片段將得到分離，同時(shí)，可以實(shí)施本發(fā)明方法的試劑被沉積在這一支持物上。對(duì)所尋找的一個(gè)或多個(gè)功能的測(cè)試可直接在支持物上進(jìn)行，如果需要的話(huà)，應(yīng)該先對(duì)這個(gè)支持物進(jìn)行清洗。當(dāng)載體分子為質(zhì)粒載體和/或本發(fā)明的方法在一個(gè)支持物上實(shí)現(xiàn)時(shí)，由重組載體轉(zhuǎn)化的菌落被單獨(dú)轉(zhuǎn)移至同一支持物上，然后原位(3)裂解，以便使每個(gè)菌落都能在支持物上釋放其含有的重組載體的拷貝。另一實(shí)施方案是將每個(gè)重組載體或其一部分單獨(dú)置于同一支持物上，此時(shí)，按照上面所述技術(shù)的任何一種，可將用于EPIV反應(yīng)的試劑沉積在含有沉積的DNA的支持物上。對(duì)功能的測(cè)試可直接在支持物上進(jìn)行，如果需要的話(huà)，應(yīng)該對(duì)這個(gè)支持物先進(jìn)行清洗。
此外，本發(fā)明的其它目的為--通過(guò)本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定和篩選的至今尚未了解的核酸序列；--與一個(gè)載體分子相聯(lián)的含有這個(gè)核酸序列的片段；--含有這一序列的質(zhì)粒載體，用這個(gè)核酸序列或這一載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宿主，或--這個(gè)序列編碼的蛋白質(zhì)。
同樣，該發(fā)明還涉及任何文庫(kù)，這些文庫(kù)由以下部分組成--通過(guò)本發(fā)明方法分離的核酸序列；--與含有這些序列的片段相聯(lián)的載體分子；--含有所說(shuō)序列的載體；--用這些序列的一個(gè)(或一些)序列或這些載體之一轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宿主；--所說(shuō)的序列編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)提供了可以自動(dòng)化操作的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)載體分子是質(zhì)粒載體時(shí)，這種自動(dòng)化形式例如可由如下的方式進(jìn)行--利用Colony Picker類(lèi)型的機(jī)械裝置，可將步驟(b)形成的文庫(kù)中的每一個(gè)重組載體在一個(gè)支持物上、一個(gè)微板孔中進(jìn)行培養(yǎng)。
--這個(gè)培養(yǎng)物可用作用Biorobot 9600(QIAGEN)型機(jī)器人進(jìn)行質(zhì)粒提取步驟，或用作經(jīng)Multiprobe型裝置(PACKARD)在型號(hào)為PTC200或PTC225(自動(dòng)蓋-M J RESEACH)的自動(dòng)熱循環(huán)儀上進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。
--任選的PCR產(chǎn)物的純化可用Biorobot 9600自動(dòng)化裝置來(lái)進(jìn)行。
--步驟(d)和(e)的EPIV反應(yīng)可以完全由Multiprobe機(jī)器人來(lái)管理?？衫脵C(jī)器人的吸移管來(lái)對(duì)在步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物的功能進(jìn)行測(cè)試，可在一個(gè)相應(yīng)的讀數(shù)器上讀取所得的結(jié)果。如果轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與翻譯反應(yīng)分開(kāi)進(jìn)行，那么，mRNA的任選純化可由Biorobot9600來(lái)進(jìn)行。
--在步驟(e)合成的蛋白質(zhì)的活性的試驗(yàn)可由機(jī)器人的吸移管來(lái)完成，可在一個(gè)微板讀數(shù)器(根據(jù)所做的試驗(yàn)可分別采用光度測(cè)定法、熒光測(cè)定法、比色測(cè)定法等)上或通過(guò)其它適宜的方法讀取所得的結(jié)果。
因此，本發(fā)明同樣也涉及用于實(shí)施前述方法的自動(dòng)化裝置，所述裝置包括一個(gè)或多個(gè)支持物、機(jī)器人、自動(dòng)裝置和讀數(shù)器的配置，這些配置任選地使得能在步驟(a)制備樣品，任選地在步驟(b)中將片段與載體分子相結(jié)合，任選地在步驟(c)中分離與載體分子相結(jié)合的片段，以及實(shí)施步驟(d)和步驟(e)。這一設(shè)備在確保本發(fā)明方法或本發(fā)明的部分方法(步驟(d)和(e))重復(fù)使用時(shí)有較高的效率外，它還可以從不同的核酸生物樣品開(kāi)始迅速找尋某些功能。
任何具有前面已確定性質(zhì)的質(zhì)粒載體均可在發(fā)明的方法中使用。例如圖2的載體，它以如下的方式構(gòu)建--質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；--克隆位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)周?chē)莾蓚€(gè)相同的啟動(dòng)子，如T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，或其它強(qiáng)型RNA聚合酶啟動(dòng)子，如Qβ、T3、SP6等，任選地在兩側(cè)是相同RNA聚合酶的終止子。這些啟動(dòng)子和終止子(如果存在)優(yōu)選在用于分離重組載體的微生物中不發(fā)揮功能。這樣的結(jié)構(gòu)可以允許轉(zhuǎn)錄插入到克隆位點(diǎn)中的DNA的片段，而不管其插入方向如何。因此找到一個(gè)好的克隆的可能性就會(huì)增加一倍。原核生物基因的平均大小約為1000個(gè)堿基對(duì)。通過(guò)使用約5000個(gè)堿基對(duì)的原核生物DNA片段生成文庫(kù)，很可能獲得一些克隆，這些克隆含有完整的基因以及它們合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(或稱(chēng)RBS)。利用這一雙啟動(dòng)子系統(tǒng)，基因最差也位于距mRNA起始的2000個(gè)堿基處，這樣就可以通過(guò)本發(fā)明方法對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的表達(dá)(見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)部分的報(bào)告的有關(guān)β-內(nèi)酰胺酶的活性)。
--任選地，在終止子兩側(cè)的特異序列可用作雜交位點(diǎn)以進(jìn)行載體攜帶的核酸片段的PCR擴(kuò)增。
--一個(gè)由tRNA基因構(gòu)成的選擇基因(4)。任選地，一個(gè)抗生素抗性基因(或其它類(lèi)型的選擇基因)同時(shí)插入到克隆位點(diǎn)中。這種抗生素的選擇只是運(yùn)用在克隆載體的制備擴(kuò)增方面。事實(shí)上，在插入步驟(b)的每一個(gè)片段時(shí)，一個(gè)DNA片段將取代這一抗性基因。這一系統(tǒng)呈現(xiàn)出這樣的一種益處它不依賴(lài)于抗生素的選擇，因?yàn)榭股剡x擇將會(huì)帶來(lái)抗生素污染和降解的問(wèn)題。這一系統(tǒng)還可以獲得一個(gè)不含其它ORF只含由異源片段引入的ORF的重組載體。另一方面，它使得通過(guò)在極限培養(yǎng)基和含有選擇抗生素的培養(yǎng)基上平行涂布文庫(kù)的一部分可以很快地評(píng)估陰性克隆的比例。
本發(fā)明方法引人注意之處還在于，它可以在粗樣品中研究核酸的功能，并鑒定它們以及識(shí)別相應(yīng)核酸序列。事實(shí)上，本發(fā)明方法避免了對(duì)存在在這一樣品中的每個(gè)微生物的分離。眾所周知，對(duì)包含在樣品中微生物的分離只能給出一些極為有限的結(jié)果，因?yàn)閷?duì)存在的各種各樣微生物，只有百分之幾的微生物得到回收。本發(fā)明方法將會(huì)提供十分可觀的時(shí)間方面的益處。因?yàn)樵?～10天時(shí)間期限內(nèi)篩選的生物多樣性約為100％，因而本發(fā)明的方法能夠獲得較好的結(jié)果。而現(xiàn)有技術(shù)方法對(duì)存在在一個(gè)樣品中的生物多樣性，在幾個(gè)星期，乃至幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)只能分離約5％左右。因?yàn)樾韪鄷r(shí)間來(lái)篩選這些菌株以檢測(cè)蛋白質(zhì)活性。本發(fā)明的方法對(duì)于研究給定種系或細(xì)胞中蛋白質(zhì)活性也將大有裨益。按照本發(fā)明方法，可很容易制備和篩選基因組或cDNA文庫(kù)。如果是cDNA文庫(kù)，載體分子包含相應(yīng)于步驟(e)使用的翻譯提取物的翻譯的起始序列。本發(fā)明方法除了速度快以外，還能擺脫細(xì)胞生理學(xué)方面的問(wèn)題。因而，可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的活性，無(wú)需解決培養(yǎng)和生理狀況的問(wèn)題。本發(fā)明方法可從生物體的功能檢測(cè)開(kāi)始直接達(dá)到檢測(cè)某一基因。同樣，還可以在一個(gè)可能含有所說(shuō)功能的生物體中來(lái)尋找該功能。由于這項(xiàng)技術(shù)具有快速性和有效性，它可以從來(lái)自一收集物的大量生物體中篩選出其中一個(gè)或多個(gè)功能，因而這就提高了微生物的生物多樣性。本發(fā)明方法從分離的嗜極菌，或從嗜極菌的粗樣開(kāi)始，可用于鑒別工業(yè)感興趣的蛋白質(zhì)活性。
最后，本發(fā)明方法在基因組范圍內(nèi)也有益處。根據(jù)它的構(gòu)想，這種方法可以鑒別出一些新的基因，而無(wú)需經(jīng)過(guò)第一步的測(cè)序，因?yàn)樗梢灾苯訌臋z測(cè)一功能而得出相應(yīng)核酸的序列。本發(fā)明方法應(yīng)用到某一生物體的全部基因組DNA時(shí)，可以鑒定這個(gè)生物體的所有表型，這就引出了一個(gè)“表型組(phenomics)”的概念。本發(fā)明還涉及實(shí)施所述的本發(fā)明方法的試劑盒，該試劑盒包括-制備核酸片段所必需的手段；-至少一個(gè)載體分子；-至少一個(gè)聚合因子；-任選地，至少一個(gè)細(xì)胞翻譯提取物；-測(cè)試一種或多種功能所必需的手段；-進(jìn)行不同的步驟所必需的緩沖液。
這一試劑盒可包裝在一個(gè)或多個(gè)不同的容器里。
本發(fā)明的其它益處及特征通過(guò)參照以下實(shí)施例和附圖而明了。這些附圖為

圖1說(shuō)明的是本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案的例子。
圖2說(shuō)明的是用于根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建文庫(kù)的一個(gè)克隆載體的示意圖。
圖3說(shuō)明的是實(shí)施本發(fā)明方法的例子中所用的質(zhì)粒pADH,pTEM,pET26-Tfu2,pLIP和pGFP的示意圖。
圖4說(shuō)明的是由表達(dá)克隆法體內(nèi)獲得的Tfu2(Thermococcusfumicolans,Tfu)DNA聚合酶的intein2的活性，泳道1分子量標(biāo)記1Kb；泳道2在沒(méi)有酶情形下的反應(yīng)；泳道3帶有intein2的反應(yīng)。
圖5說(shuō)明的是用中溫菌翻譯提取物經(jīng)EPIV反應(yīng)(在約400nm曝光后的熒光發(fā)射)產(chǎn)生的GFP的活性。試管A用水(對(duì)照)的EPIV反應(yīng)；試管B用pGFP載體的EPIV反應(yīng)。
圖6說(shuō)明的是用中溫菌翻譯提取物經(jīng)EPIV反應(yīng)產(chǎn)生的Tfu DNA聚合酶的intein2的活性，泳道1分子量標(biāo)記1Kb；泳道2:T-(沒(méi)有酶參與的反應(yīng))；泳道3空白(用EPIV提取物而無(wú)DNA的反應(yīng))；泳道4:T+(與體內(nèi)產(chǎn)生的intein2的反應(yīng))；泳道5測(cè)試(與由EPIV(pET26-Tfu2)產(chǎn)生的intein2的反應(yīng))。
圖7說(shuō)明的是使用含有所述活性的中溫菌翻譯提取物對(duì)嗜熱酶的活性的檢測(cè)。試管A與水(對(duì)照)在37℃保溫進(jìn)行的EPIV反應(yīng)；試管B在37℃保溫的EPIV反應(yīng)；試管C在離心分離后，與水(對(duì)照)在70℃保溫進(jìn)行的EPIV反應(yīng)；試管D在離心分離后，在70℃保溫的EPIV反應(yīng)。Ⅰ-材料1)菌株和質(zhì)粒載體pET26b+屬于載體pET家族，這個(gè)家族由Studier和Moffatt(8)開(kāi)發(fā)，并且由NOVAGEN公司將這一載體商業(yè)化。這一載體可在T7噬菌體啟動(dòng)子的控制下對(duì)一些基因進(jìn)行表達(dá)。載體PINPOINTTM(PROMEGA)攜帶在T7噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子控制下的cat基因(編碼氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶)。pHS2-22-21載體通過(guò)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR將由Tfu DNA聚合酶的intein2識(shí)別的切割位點(diǎn)引入質(zhì)粒pUC19的多克隆位點(diǎn)而構(gòu)建。pHS2-22-21載體與pUC19相應(yīng)，含有intein的homing位點(diǎn)(43個(gè)堿基對(duì))或插入intein基因的位點(diǎn)。
菌株XL1-BLUE[Tn10 proA+B+lacIqΔ(lacZ)M15/recAlendAl gyrA96(NaIr)thi hsdR17(rk-MK+)supE44 relAa 1 lac]用于質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增。
2)試劑按照供應(yīng)商的建議，使用下面表Ⅰ中引用的限制酶和修飾酶。
表Ⅰ
使用的緩沖液見(jiàn)如下表Ⅱ的說(shuō)明。
表Ⅱ
Ⅱ質(zhì)粒的制備和測(cè)試1)構(gòu)建Tfu DNA聚合酶的intein2的基因(itfu2)(在基因庫(kù)中的進(jìn)入編號(hào)為Z69882)插入在載體pET26b+的NdeⅠ和SalⅠ限制位點(diǎn)之間，以建立圖3中說(shuō)明的pET26-Tfu2質(zhì)粒。用同樣的方式，將Thermococcus hydrothermalis的醇脫氫酶基因(adh)插入到載體pET26B+的NdeⅠ和Bam HⅠ限制位點(diǎn)之間，以建立pADH載體。大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶TEM-1基因(bla)(9),Aequorea Victoria的綠色熒光蛋白基因(gfp)(6)，以及Candida Antarctica的脂肪酶B的基因(lipB)(在基因庫(kù)中的進(jìn)入編號(hào)為Y14015)，分別被插入到載體pET26b+的NdeⅠ和Eco RⅠ限制位點(diǎn)之間，以建立圖3中說(shuō)明的pADH質(zhì)粒、pTEM質(zhì)粒、pGFP質(zhì)粒和pLIP質(zhì)粒。對(duì)于這四個(gè)基因中的每個(gè)基因，NdeⅠ的限制位點(diǎn)都與翻譯起始密碼子ATG相重疊。
通過(guò)幾種限制分布分析驗(yàn)證每一構(gòu)建。利用10ng每種質(zhì)粒，通過(guò)熱休克(2)，轉(zhuǎn)化200μl XLl-BLUE chimiocompetent細(xì)胞(1)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素以及12.5μg/ml的四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上。從這些轉(zhuǎn)化的每個(gè)轉(zhuǎn)化的克隆開(kāi)始，利用TIP100型柱(QIAGEN)實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA的大量制備。在異丙醇中沉淀后，每個(gè)質(zhì)粒DNA樣品都重懸于100μl的緩沖液T中。這些質(zhì)粒DNA的濃度通過(guò)260nm分光光度測(cè)量進(jìn)行評(píng)估。在TBE1％的瓊脂糖凝膠沉積0.2μl這些載體檢驗(yàn)每個(gè)質(zhì)粒DNA的純度。
2)體內(nèi)表達(dá)測(cè)試--活性試驗(yàn)--pTEM利用10ng的pTEM質(zhì)粒通過(guò)熱休克方法轉(zhuǎn)化200μl的BL21 DE3(pLysS)chimiocompetent細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素、20μg/ml的氯霉素、32μg/ml的IPTG以及100μg/ml的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。37℃保溫過(guò)夜后，可在陪氏培養(yǎng)皿上觀察到眾多的菌落，這些菌落表明pTEM質(zhì)粒的TEM-1基因已經(jīng)表達(dá)且有功能，其賦予氨芐青霉素抗性。
--pGFP利用10ng的pGFP質(zhì)粒通過(guò)熱休克方法轉(zhuǎn)化200μl的BL21 DE3(plysS)chimiocompetent細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素、20μg/ml的氯霉素以及32μg/ml的IPTG的LB固體培養(yǎng)基上。37℃保溫過(guò)夜后，可在陪氏培養(yǎng)皿上觀察到眾多的菌落。所有的這些菌落都對(duì)紫外光激發(fā)(約為400nm)產(chǎn)生反應(yīng)，同時(shí)發(fā)出綠色的熒光，這使得可驗(yàn)證pGFP質(zhì)粒的gfp基因是否表達(dá)，以及是否有功能。
--pET26-Tfu2利用10ng的pET26-Tfu2質(zhì)粒，通過(guò)熱休克方法轉(zhuǎn)化200μl的BL21 DE3(pLysS)chimiocompetent細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上。從這一轉(zhuǎn)化的克隆開(kāi)始的培養(yǎng)物用0.5mM的IPTG在OD600nm=0.5時(shí)在37℃誘導(dǎo)兩個(gè)小時(shí)。離心分離后，細(xì)菌的沉淀物在20mM,pH值為7.5的磷酸鈉緩沖液中重懸。多次利用凍融循環(huán)這一方法就可獲得細(xì)胞的溶解。接著，在QFast-Flow柱上，利用NaCl梯度純化intein2。根據(jù)如下方案對(duì)這一酶的活性進(jìn)行試驗(yàn)將1μl具有最高純酶濃度的洗脫組分稀釋100倍。取這個(gè)稀釋液1μl，與3μl的IT2緩沖液和220ng的ScaⅠ限制酶線(xiàn)性化的pHS2-22-21質(zhì)粒一起在70℃的條件下保持15分鐘，終體積為30μl。取這一消化混合物15μl，沉積在TBE 1％瓊脂糖凝膠上。在遷移和用溴化乙錠染色后，將凝膠放置在紫外線(xiàn)下。正如圖4所指明的那樣，通過(guò)對(duì)凝膠的分析表明存在兩個(gè)條帶，它們分別有934個(gè)堿基對(duì)和1752個(gè)堿基對(duì)，這與通過(guò)intein2對(duì)載體pHS2-22-21(ScaⅠ線(xiàn)性化的)的切割相符。pET26-Tfu2R質(zhì)粒的itfu2基因因而得到表達(dá)，它的產(chǎn)物，intein2具有活性。
--pADH利用10ng的pADH質(zhì)粒，通過(guò)熱休克方法轉(zhuǎn)化200μl的BL21 DE3(pLysS)chimiocompetent細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上。從這一轉(zhuǎn)化的克隆開(kāi)始的培養(yǎng)物用1mM的IPTG在OD600nm=0.6時(shí)在37℃誘導(dǎo)三個(gè)小時(shí)。離心分離后，細(xì)菌的沉淀物在磷酸鈉緩沖液50mM-MgCl210mM pH值8.0中重懸，細(xì)胞裂解物在1mg/ml的溶菌酶、10μg/ml的RNAse A和100μg/ml的DNAseⅠ的存在下在冰上保溫30分鐘而獲得。提取步驟的離心上清在50℃保溫30分鐘，再次離心。這一最后步驟的上清用作測(cè)量活性的酶提取物。在不包含質(zhì)粒的BL21 DE3(pLysS)細(xì)胞的培養(yǎng)物上進(jìn)行相似提取，作為陰性對(duì)照。用分光光度計(jì)根據(jù)340nm處NADP還原為NADPH的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可測(cè)試出醇脫氫酶基因的活性。為此，10μl的酶提取物或?qū)φ张c500μl的TADH緩沖液和490μl的水一起在50℃的條件下保持5分鐘。在這些條件下，可檢測(cè)到酶提取物的活性為15.6UDO/min/ml，而對(duì)照的活性為0UDO/min/ml。pADH質(zhì)粒的adh基因因而是表達(dá)的，且其產(chǎn)物醇脫氫酶具有活性。Ⅲ-利用自中溫菌株(37℃)制備的翻譯提取物進(jìn)行體處蛋白質(zhì)表達(dá)試驗(yàn)(EPIV)在十分之一體積的醋酸鈉3M pH6.0和兩體積的無(wú)水醇存在下沉淀4μg每個(gè)載體，沉淀物用70％的乙醇進(jìn)行漂洗以除掉任何痕量鹽。每種沉淀的DNA重懸浮在4μl的緩沖液T中。
在終體積50μl的含有各0.1mM的20種氨基酸、20μl的“S30PREMIX”提取物以及15μl的“T7 S30 extract”(PROMEGA)的體外蛋白質(zhì)表達(dá)混合物中，將這一DNA在37℃保持二個(gè)小時(shí)?！癝30PREMIX”提取物和“T7 S30 extract”含有所有的在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和翻譯反應(yīng)必需的成分，尤其是T7RNA聚合酶、CTP、UTP、GTP、ATP、tRNAs、EDTA、葉酸以及相應(yīng)的鹽。按照Z(yǔ)ubay(10)所描述的方法，從內(nèi)切蛋白酶ompT和離子蛋白酶缺陷的大腸桿菌B的菌株產(chǎn)生翻譯提取物，這樣可以更好地穩(wěn)定體外所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
在轉(zhuǎn)錄-翻譯的混合物中用超純無(wú)菌水代替DNA而保溫制備陰性的對(duì)照。保溫2μg的PINPOINTTM質(zhì)粒形成陽(yáng)性對(duì)照。
EPIV反應(yīng)一直保持在冰上，直到每個(gè)樣品的酶活性能夠得到評(píng)估為止。Ⅳ-活性測(cè)定1)中溫酶a)GFP的活性圖5表示的暴露在強(qiáng)度約為400nm的紫外線(xiàn)下的含有用pGFP載體進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的產(chǎn)物的試管，以及含有對(duì)照反應(yīng)的試管。只有包含pGFP質(zhì)粒的EPIV反應(yīng)的試管才發(fā)出一道綠色的熒光。因而，EPIV反應(yīng)可以產(chǎn)生一種GFP蛋白質(zhì)，它具有熒光活性。
B)β-內(nèi)酰胺酶的活性通過(guò)用分光光度法在486nm跟蹤一種生色頭孢菌素nitrocephine的降解動(dòng)力學(xué)評(píng)估β-內(nèi)酰胺酶的活性。為此，將5μl、10μl或20μl用pTEM載體進(jìn)行的EPIV反應(yīng)在終體積1ml的BETA緩沖液中在37℃的條件下保持2分鐘。在這些條件下，可評(píng)估出用pTEM載體進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的平均活性為8.9UDO/min/ml提取物，而對(duì)照EPIV反應(yīng)的活性為0.6UDO/min/ml提取物。因而，體外蛋白質(zhì)表達(dá)反應(yīng)可合成具有活性的β-內(nèi)酰胺酶，它能夠在體外降解nitrocephine。
對(duì)照載體PINPOINTTM攜帶在其本身啟動(dòng)子控制下的bla基因。然而，用這一載體進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的β-內(nèi)酰胺酶活性被檢測(cè)為6UDO/min/ml提取物。應(yīng)指出的是，加入1ng/μl的大腸桿菌RNA聚合酶的抑制劑利福平時(shí)，不會(huì)顯著改變載體PINPOINTTM的β-內(nèi)酰胺酶體外表達(dá)。載體PINPOINTTM的bla基因位于T7啟動(dòng)子下游的2133個(gè)堿基對(duì)處，這一個(gè)基因因而被有效轉(zhuǎn)錄和翻譯。這就說(shuō)明，在EPIV反應(yīng)期間，位于T7啟動(dòng)子下游的2000個(gè)堿基對(duì)處的基因可以有效轉(zhuǎn)錄和翻譯。
2)嗜熱酶a)Intein2的活性對(duì)用載體pET26-Tfu2進(jìn)行的EPIV反應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)，以便了解活性Intein2是否能夠產(chǎn)生。為此，5μl EPIV反應(yīng)與220ng的ScaⅠ限制酶線(xiàn)性化的pHS2-22-21質(zhì)粒以及3μl的IT2緩沖液一起在70℃的條件下保持20分鐘，終體積為30μl。對(duì)于陰性對(duì)照物的組成，用水來(lái)替代5μl的EPIV反應(yīng)。陽(yáng)性的對(duì)照包括1μl稀釋至1/100的體外產(chǎn)生的純化Intein2組分。最后，通過(guò)保溫不含任何DNA的5μl EPIV反應(yīng)制成特異性對(duì)照。
保溫結(jié)束后，在苯酚-氯仿中進(jìn)行4次提取試驗(yàn)，在乙醇中進(jìn)行沉淀，然后用70％的乙醇進(jìn)行漂洗，以便除掉鹽。在10μl的緩沖液T中重溶每種沉淀，其中8μl加至TBE 1％的瓊脂糖凝膠。在遷移和用溴化乙錠染色后，將凝膠放置在紫外線(xiàn)下以便分析限制性分布。在圖6的泳道5上，出現(xiàn)934個(gè)堿基對(duì)和1752個(gè)堿基的條帶，這與泳道4(陽(yáng)性對(duì)照)的條帶相同。出現(xiàn)這樣的情況表明，通過(guò)EPIV反應(yīng)確實(shí)產(chǎn)生了intein2，并且這個(gè)酶具有活性。此外，EPIV反應(yīng)是特異的，因?yàn)樵谟镜?的對(duì)照上觀察不到其他消化條帶。
b)醇脫氫酶的活性用分光光度法，通過(guò)在340nm跟蹤NADP還原成NADPH的動(dòng)力學(xué)，測(cè)試醇脫氫酶活性。為此，5μl、10μl或15μl的用pADH載體或者無(wú)DNA進(jìn)行的EPIV反應(yīng)，與500μl的TADH緩沖液一起在終體積1ml中在50℃保溫5分鐘。在這些條件下，評(píng)估出用pADH載體進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的平均活性為2.3UDO/min/ml提取物，用水進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的對(duì)照活性為0.32UDO/min/ml提取物。因而，在EPIV反應(yīng)期間產(chǎn)生了活性形式的Thermococcus hydrothermalis的ADH(在基因文庫(kù)中的進(jìn)入編號(hào)為Y14015)。
3)嗜冷酶用分光光度法，通過(guò)在572nm跟蹤生色脂類(lèi)(1,2-O-二月桂基-rac-甘油-3-戊二酸-9-羥基-3-異吩惡唑酮酯)的降解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，便可測(cè)試出脂肪酶的活性。為此，5μl的用pLIP載體或者無(wú)DNA進(jìn)行的EPIV反應(yīng)，在100μg底物存在下在反應(yīng)緩沖液中在70℃保溫15分鐘。在這些條件下，可評(píng)估出用pLIP載體進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的活性約為0.50UDO/min/ml提取物，而對(duì)照的活性為0.04UDO/min/ml提取物。因而，Candida antarctica(真核生物)脂肪酶B的活性在EPIV反應(yīng)期間，以活性形式產(chǎn)生。Ⅴ-用含有中溫活性的翻譯提取物檢測(cè)嗜熱性質(zhì)Themotoga neapolitana的β-半乳糖苷酶基因被插入一個(gè)含有T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的載體中?？梢允褂眠@樣獲得的載體與含有β-半乳糖苷酶活性的大腸桿菌菌株的翻譯提取物進(jìn)行EPIV反應(yīng)。同時(shí)，也進(jìn)行一項(xiàng)沒(méi)有DNA的EPIV反應(yīng)試驗(yàn)。將每個(gè)EPIV反應(yīng)的一部分在磷酸鈉(50mM,PH值為7)的緩沖液中在Xgal存在下于37℃保溫，這兩個(gè)試管在幾分鐘之內(nèi)都會(huì)變成藍(lán)色(參見(jiàn)圖7上的試管A和試管B)。在有Xgal存在的情形下，將每個(gè)EPIV反應(yīng)組分在同樣的條件下但溫度為70℃下進(jìn)行保溫，只有對(duì)應(yīng)于用編碼β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒進(jìn)行的EPIV反應(yīng)的試管才會(huì)變成藍(lán)色(參見(jiàn)圖7中的試管C和試管D這兩個(gè)試管都已經(jīng)過(guò)離心分離以便沉積中溫菌翻譯提取物的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在70℃的條件下進(jìn)行活性試驗(yàn)期間熱變性沉淀)。在這一溫度(中溫菌β-半乳糖苷酶熱變性)下，無(wú)法測(cè)試到中溫β-半乳糖苷酶的活性。因此，如果這一性質(zhì)在所尋找性質(zhì)的檢測(cè)條件下無(wú)法檢測(cè)的話(huà)，此時(shí)就可以使用含有類(lèi)似于所尋找性質(zhì)的該性質(zhì)的翻譯提取物。Ⅵ-從嗜極菌制備翻譯提取物根據(jù)Zubay(1973)(10)或按照Pratt(1984)(7)所描述的方法，其它生物體的，尤其是嗜極菌的翻譯提取物可從細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行制備。離心分離的速度，細(xì)胞破碎的條件以及不同反應(yīng)或制備緩沖液，通過(guò)系統(tǒng)性試驗(yàn)而針對(duì)每個(gè)類(lèi)型的翻譯提取物進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。因而，這樣在實(shí)現(xiàn)一系列翻譯提取物時(shí)，無(wú)論基因的來(lái)源如何，都可以翻譯基因，本發(fā)明的方法因而允許在翻譯系統(tǒng)和編碼所尋找的性質(zhì)的基因表達(dá)之間有一相關(guān)性。
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權(quán)利要求
1.分離和鑒定一含有核酸的生物樣品中可能存在的各種功能的方法，其特征在于包含如下的步驟(a)從所說(shuō)的生物樣品開(kāi)始制備核酸片段；(b)將每個(gè)所說(shuō)的片段與載體分子進(jìn)行結(jié)合；(c)分離步驟b)的與載體分子相結(jié)合的每個(gè)片段，或由片段與載體分子的結(jié)合組成的每一結(jié)構(gòu)的一部分；(d)對(duì)步驟c)中與載體分子相結(jié)合的每個(gè)片段，或由片段與載體分子的結(jié)合組成的每一結(jié)構(gòu)的一部分在體外進(jìn)行處理，以獲得轉(zhuǎn)錄物(e)測(cè)試在步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物的功能，或在轉(zhuǎn)錄物的翻譯后測(cè)試所編碼的蛋白質(zhì)的功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(e)包括對(duì)步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物在體外利用一細(xì)胞提取物進(jìn)行處理，使得其翻譯成蛋白質(zhì)，然后用任何合適的方式測(cè)試所述蛋白質(zhì)的功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于載體分子由一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列組成，這種多核苷酸序列包括用于步驟(d)的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，以及任選地有利于步驟(c)的片段的分離的物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于載體分子由二個(gè)多核苷酸序列組成，每個(gè)多核苷酸序列含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，這兩個(gè)序列的每一個(gè)都與在步驟(a)中獲得的任一個(gè)片段的一個(gè)末端結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其特征在于載體分子帶有的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子類(lèi)型。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于轉(zhuǎn)錄步驟(d)可與步驟(e)的翻譯同時(shí)進(jìn)行，或不同時(shí)進(jìn)行。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(e)轉(zhuǎn)錄物的翻譯由與生物樣品同一來(lái)源或接近來(lái)源的翻譯提取物進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其特征在于翻譯提取物要么不具備步驟(e)中測(cè)試的功能，要么具有這一功能，但在所說(shuō)的步驟(e)的測(cè)試條件下不可檢測(cè)到。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其特征在于翻譯提取物是多種翻譯提取物的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其特征在于翻譯提取物包含特異于一個(gè)或多個(gè)密碼子的一或多個(gè)tRNA，和/或有利于所表達(dá)的蛋白質(zhì)的重折疊或更有效的成熟的一種或多種物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-6和8-10任一項(xiàng)的方法，其特征在于無(wú)論生物樣品的來(lái)源如何，翻譯提取物是一種通用翻譯提取物。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(e)有測(cè)試轉(zhuǎn)錄物的功能如核酶或tRNA組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟(e)由測(cè)試從所述轉(zhuǎn)錄物翻譯的蛋白質(zhì)的酶活性或親和性功能組成。
14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(e)由平行測(cè)試或同時(shí)測(cè)試單個(gè)功能或多個(gè)功能的不同性質(zhì)組成。
15.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(b)中與每個(gè)片段結(jié)合的載體分子是一種質(zhì)粒載體，這一質(zhì)粒載體優(yōu)選地不能在體內(nèi)表達(dá)所述片段。
16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于當(dāng)生物樣品來(lái)自原核生物時(shí)，在步驟(a)中制備的片段的大小為1至幾十個(gè)kb，優(yōu)選是1至40kb，以及有利的大小是1到10kb。
17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于在真核生物情況下，在步驟(a)中制備的片段有利的是大小為幾十至幾百個(gè)kb。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其特征在于在步驟(a)中制備的片段可以帶有部分的或完整的操縱子。
19.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于用于制備步驟(a)的片段的生物樣品來(lái)自一個(gè)或多個(gè)原核生物或真核細(xì)胞，或來(lái)自相同的或不同的病毒。
20.根據(jù)上述權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其特征在于用于制備步驟(a)的片段的生物樣品由合成核酸的序列或文庫(kù)組成。
21.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于用于制備步驟(a)的片段的生物樣品由未知的生物體和/或核酸組成。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-15和17-21任一項(xiàng)的方法，其特征在于生物樣品是真核DNA文庫(kù)，并且步驟(d)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通過(guò)使用核提取物進(jìn)行mRNA的體外剪接和成熟反應(yīng)來(lái)完成。
23.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于在步驟(b)與核酸片段相結(jié)合的載體分子是一種質(zhì)粒載體，并且在步驟(b)中每個(gè)片段在克隆位點(diǎn)或限制盒位置插入一載體，所說(shuō)的質(zhì)粒載體包括-在克隆位點(diǎn)的一側(cè)的一個(gè)RNA聚合酶啟動(dòng)子，任選地，在另一側(cè)的一個(gè)RNA聚合酶終止子；-一克隆的位置，其周?chē)鸀閮蓚€(gè)相同的或不同的RNA聚合酶啟動(dòng)子，以及任選地兩側(cè)都有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的RNA聚合酶終止子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于啟動(dòng)子以及任選的終止子在步驟(c)分離重組載體所用的微生物中無(wú)功能。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于步驟(c)中重組載體的分離如下進(jìn)行用步驟(b)中獲得的重組載體的集合轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而建立一個(gè)克隆文庫(kù)，隨后用任何合適的方式提取重組載體或文庫(kù)中每個(gè)克隆所含的載體的一部分。
26.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于它可以全部在固相支持物如芯片、膜、納滴定(nanotitration)板上實(shí)現(xiàn)。
27.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法鑒別和選擇的一個(gè)未知核酸序列。
28.含有權(quán)利要求27的核酸序列的質(zhì)粒載體。
29.用權(quán)利要求27的核酸序列和權(quán)利要求28的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
30.由權(quán)利要求27的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
31.由權(quán)利要求27的核酸序列或權(quán)利要求28的載體或權(quán)利要求30的蛋白質(zhì)組成的文庫(kù)。
32.適用于權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法步驟(b)的質(zhì)粒載體，其特征在于所述質(zhì)粒載體包括-質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；-克隆位點(diǎn)，它的周?chē)莾蓚€(gè)相同的啟動(dòng)子，如T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子或其它強(qiáng)RNA聚合酶啟動(dòng)子，任選地，兩側(cè)有相同RNA聚合酶的終止子；-任選地在終止子兩側(cè)的特異序列，其作為PCR擴(kuò)增載體攜帶的壞死片段的雜交位點(diǎn)；-由tRNA基因組成的一個(gè)選擇基因，以及任選地，平行地插入克隆位點(diǎn)的另一個(gè)選擇基因。
33.用于實(shí)施根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法的試劑盒，其特征在于其包括-制備核酸片段所必需的手段；-至少一個(gè)載體分子；-至少一個(gè)聚合因子；-任選地，至少一個(gè)細(xì)胞翻譯提取物；-測(cè)試一種或多種功能所必需的手段；-進(jìn)行不同的步驟所必需的緩沖液。
34.用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法的自動(dòng)化裝置，其特征在于所述裝置包括一個(gè)或多個(gè)支持物、機(jī)器人、自動(dòng)裝置和讀數(shù)器的配置，這些配置任選地使得能在步驟(a)制備樣品，任選地在步驟(b)中將片段與載體分子相結(jié)合，任選地在步驟(c)中分離與載體分子相結(jié)合的片段，以及實(shí)施步驟(d)和步驟(e)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離和鑒定一含有核酸的生物樣品中可能存在的各種功能的方法,其特征在于包含如下的步驟:(a)從所說(shuō)的生物樣品開(kāi)始制備核酸片段;(b)將每個(gè)所說(shuō)的片段與載體分子進(jìn)行結(jié)合;(c)分離步驟(b)的與載體分子相結(jié)合的每個(gè)片段,或由片段與載體分子的結(jié)合組成的每一結(jié)構(gòu)的一部分;(d)對(duì)步驟(c)中與載體分子相結(jié)合的每個(gè)片段,或由片段與載體分子的結(jié)合組成的每一結(jié)構(gòu)的一部分在體外進(jìn)行處理,以獲得轉(zhuǎn)錄物;(e)測(cè)試在步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)錄物的功能,或在轉(zhuǎn)錄物的翻譯后測(cè)試所編碼的蛋白質(zhì)的功能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1323356SQ9981203
公開(kāi)日2001年11月21日 申請(qǐng)日期1999年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月12日
發(fā)明者達(dá)尼埃爾·迪普雷, 讓-米歇爾·馬松, 法布里斯·勒菲弗 申請(qǐng)人:普羅蒂厄斯股份公司