專利名稱：一種甲狀腺疾病輔助診斷儀及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病診斷儀器，具體地說是一種甲狀腺疾病輔助診斷儀及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲亢和甲減是最常見的兩種甲狀腺疾病，分別是由于體內(nèi)的甲狀腺激素分泌過多或嚴(yán)重不足而引發(fā)的內(nèi)分泌疾病。甲亢較為常見，且多見于女性；有報(bào)告稱，甲亢患病率占女性人口的2％，每年新發(fā)病率為2/1000-3/1000婦女人口，且有逐漸增加的趨勢(shì)。甲亢使機(jī)體耗氧量增加，一方面是適應(yīng)代謝過旺的需求，另一方面卻引起了體內(nèi)氧自由基的增加[文獻(xiàn)1.Videla LA，SirT，WolffC；Free Radic Res Commun，1988，51-10]。輔酶Q10無論是作為細(xì)胞能量ATP生成過程中必不可少的質(zhì)子轉(zhuǎn)遞介質(zhì)，還是作為體內(nèi)自由基清除劑，在甲亢期間，其在機(jī)體組織中的含量都會(huì)顯著降低[文獻(xiàn)2.Krishnamurthy S，Prasanna D；Acta Vitaminol Enzymol，1984，617-21；文獻(xiàn)3.Pandolfi C，F(xiàn)errari D，Stanic I，Pellegrini L；Minerva Endocrinol，1994，Sep；19(3)，139-42，Italian.；文獻(xiàn)4.Bianchi G，Solaroli E，Zaccheroni V，Grossi G，Bargossi A M，Melchionda N，Marchesini G；Horm Metab Res，1999，31620-6242-4]。甲減的情況正好與之相反。正是由于輔酶Q10與甲狀腺激素之間存在線性負(fù)相關(guān)的關(guān)系，因此可以把輔酶Q10作為甲狀腺激素分泌的一個(gè)指標(biāo)，通過檢測(cè)輔酶Q10的含量來檢測(cè)體內(nèi)甲狀腺激素的分泌狀況，從而輔助診斷甲亢和甲減這兩種常見甲狀腺疾病。其次，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病人體內(nèi)Q10的含量變化可觀察病人的恢復(fù)狀況，監(jiān)測(cè)整個(gè)治療過程，從而指導(dǎo)病人更好的用藥，選擇更好的治療方案。從這一點(diǎn)上看，檢測(cè)血漿輔酶Q10的含量具有重要的醫(yī)學(xué)意義。
對(duì)輔酶Q10的測(cè)定已有很多報(bào)道光度法[文獻(xiàn)5.Joanna K，Bozena M，JaninaP J；Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1998，17，1345-1350；文獻(xiàn)6.Readlieu E，Nilsson I M，F(xiàn)arley T M，F(xiàn)olkers K；AnalBiochem，1968，23132]、色譜法[文獻(xiàn)7.Wang Q，Lee B L，Ong C N；Journal ofChromatography B，1999，726297-302；文獻(xiàn)8.Zhiri A，Belichard P；Journal ofLiquid Chromatograpy，1994，17(12)，2633-2640；文獻(xiàn)9.Kommuru T R，Khan MA，Ashraf M，Kattenacker R，Reddy I K；Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis，1998，161037-1040；文獻(xiàn)10.Grossi G，Bargossi AM，F(xiàn)iorella P L，Piazzi S，Battino M，Bianchi G P；Journal ofChromatograpy，1992，593217；文獻(xiàn)11.Finckh B，Kontush A，CommentzJ，Hubner Ch，Burdelski M，Kohlschutter A；Anal Biochem，1995，232210；文獻(xiàn)12.Kaplan P，Sebastianova N，Turiakova J，Kucera I；Physiol Res，1996，4539；文獻(xiàn)13.Vadhanavikit S，Sakamoto N，Ashida N，Kishi T，F(xiàn)olkers K；AnalBiochem，1984，142155-158]、伏安法[文獻(xiàn)14.Simona C L，Iulia G D，GabrielL R，Hassan Y.A E；Instrumentation science & Technology，2001，29(2)，109-116]、化學(xué)發(fā)光法[文獻(xiàn)15.Battino M，F(xiàn)erri E，Girotti S，Lenaz G；AnalyticaChimica Acta，1991，255367-371]、熒光法[文獻(xiàn)16.Rokos J A S；AnalBiochem，1973，5626]、電子磁共振法[文獻(xiàn)17.Long Y T，Yu Z H，Chen H Y；Electrochem Commun.1999，1，194]等等，其中最成熟最常用的還是液相色譜法。血漿樣品基體復(fù)雜，分析前常常需要經(jīng)過繁瑣的預(yù)處理[文獻(xiàn)9，10，12，13]。Vadhanavikit等人[文獻(xiàn)13]用TLC萃取和凈化血樣，該方法精度較差，回收率也有待提高。SPE集純化和富集于一體，適用于復(fù)雜樣品的預(yù)處理。Kommuru[文獻(xiàn)9]將硅膠SPE柱引入血漿樣品的純化過程，很好地去除了萃取液中一些弱極性的脂溶性雜質(zhì)，但強(qiáng)極性雜質(zhì)的存在使得色譜圖中溶劑前沿仍然很高。文獻(xiàn)[文獻(xiàn)10，12]利用兩種不同極性的SPE柱(硅膠柱和C18柱)依次去除血漿中的弱極性和強(qiáng)極性雜質(zhì)，使血樣得到很大程度的凈化，該方法出峰干凈，有效地保護(hù)和延長了柱壽命；但是，兩步固相萃取費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且，成本較高，很不適于臨床上大批量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甲狀腺疾病輔助診斷儀及其應(yīng)用，其集樣品處理與分析于一體的自動(dòng)化程度較高的分析系統(tǒng)，準(zhǔn)確高效地檢測(cè)人體血漿輔酶Q10含量，為甲亢和甲減病人的診斷和治療提供有益的指導(dǎo)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用了柱切換技術(shù)，建立了一套兩柱相連的液相色譜分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括以下幾個(gè)組件三個(gè)高壓泵、一個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器、一個(gè)紫外-可見檢測(cè)器、一個(gè)系統(tǒng)控制器、一個(gè)色譜工作站、一個(gè)六通閥、色譜分析柱A和色譜分析柱B；主要由高壓泵A(1)、高壓泵B(2)、高壓泵C(3)、自動(dòng)進(jìn)樣器(4)、六通閥(5)、十八烷基鍵合硅膠柱A(6)、混合器(7)、十八烷基鍵合硅膠柱B(8)和紫外-可見檢測(cè)器(9)組成；六通閥(5)的⑥位通過自動(dòng)進(jìn)樣器(4)與高壓泵A(1)連接，六通閥(5)的①位和④位分別接親和十八烷基鍵合硅膠柱A(6)兩端，六通閥(5)的⑤位接廢液排出管路，六通閥(5)的③位與混合器(7)出口相連，高壓泵B(2)和高壓泵C(3)與混合器(7)入口相連，六通閥(5)的②位與十八烷基鍵合硅膠柱B(8)一端相連，十八烷基鍵合硅膠柱B(8)的另一端通過紫外-可見檢測(cè)器(9)與廢液排出管路相連。
甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其通過對(duì)血漿中輔酶Q10含量高低的檢測(cè)輔助診斷甲狀腺疾病，具體步驟如下，1)取血漿加入正丙醇離心脫脂除蛋白后，將上層清液直接上樣分析；2)將分析樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器直接上樣，六通閥處于“LOAD”位置，選用純甲醇淋洗十八烷基鍵合硅膠柱A，使得血漿中輔酶Q10保留在柱A上；3)繼續(xù)用純甲醇沖洗柱A，血漿中殘存的一些雜質(zhì)經(jīng)過柱A流入廢液排出管路；4)六通閥處于“INJECT”位置以甲醇和異丙醇作流動(dòng)相，血漿中輔酶Q10組分從柱A上洗脫下來，經(jīng)過六通閥到達(dá)十八烷基鍵合硅膠柱B的最上端，完成柱A和柱B間在線傳遞全過程；5)六通閥重新回到“LOAD”位置，在柱B上實(shí)行甲醇和異丙醇等度淋洗程序，達(dá)到分離測(cè)定輔酶Q10的目的；6)按照上述步驟便可對(duì)人體血漿輔酶Q10含量進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，通過對(duì)正常人、甲亢及甲減三組人群體內(nèi)Q10含量的監(jiān)測(cè)，可掌握人體血漿含量的大致水平，并通過與正常人比較實(shí)現(xiàn)了是否患甲狀腺疾病的輔助診斷(從而可輔助甲亢或甲減的準(zhǔn)確診斷)；如果含量顯著高于正常人平均值則很可能為甲減；如顯著低于正常人平均值，則很可能為甲亢；否則則為正常。
類似上述的原理也適用于甲狀腺疾病治療效果的判斷；按照步驟1)～5)通過對(duì)人體血漿輔酶Q10含量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可確切的掌握病人的恢復(fù)狀況，為選擇和確定新的治療方案提供輔助依據(jù)。
所述柱A為預(yù)處理柱，長度10～30mm，內(nèi)徑4～4.6mm；柱B為分析柱，長度100～250mm，內(nèi)徑4～4.6mm；純甲醇的流量為0.3～1ml/min，所述甲醇和異丙醇的體積比為15∶1～1∶1。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.方法簡(jiǎn)單。本發(fā)明簡(jiǎn)化了輔酶Q10的萃取過程，選用正丙醇既能脫脂去蛋白又能定量萃取輔酶Q10，避免了以往常采用的先用醇脫脂后再用正己烷萃取的繁瑣過程。血漿基體成分復(fù)雜，若不經(jīng)任何處理直接將萃取液進(jìn)樣分析，常存在以下問題溶劑前沿高，雜質(zhì)顆粒易堵塞柱子，強(qiáng)保留物質(zhì)使柱壽命大大降低，此外，雜質(zhì)往往干擾Q10的測(cè)定。文獻(xiàn)多采用TLC技術(shù)[文獻(xiàn)13]或SPE技術(shù)[文獻(xiàn)9，文獻(xiàn)10，文獻(xiàn)12]凈化和富集血樣。這些方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且測(cè)定精度較差。本發(fā)明的樣品預(yù)處理過程只需用正丙醇脫去血漿脂蛋白，離心分離后便可直接進(jìn)行分析；采用液相色譜自動(dòng)在線分析系統(tǒng)用于血漿中輔酶Q10的測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了從樣品的自動(dòng)預(yù)處理、自動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)分離分析幾大功能，大大簡(jiǎn)化了整個(gè)分析過程，特別適宜于臨床上大批量分析；由于該方法全由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制，保證了樣品測(cè)定間條件的完全一致，因此可直接用外標(biāo)法準(zhǔn)確定量，免去了尋求合適內(nèi)標(biāo)的麻煩。
2.檢測(cè)精度高。本發(fā)明利用柱切換技術(shù)，研制出一種新型的自動(dòng)在線系統(tǒng)，該系統(tǒng)分離分析血漿輔酶Q10實(shí)現(xiàn)了從樣品預(yù)處理到分離分析全過程的自動(dòng)化，避免了費(fèi)時(shí)費(fèi)力的樣品預(yù)處理步驟，同時(shí)也避免了在樣品預(yù)處理過程中產(chǎn)生的人為操作誤差，大大提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度；所有操作過程通過一個(gè)系統(tǒng)控制器，由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化程度較高，適于臨床大批量檢測(cè)；此外，該系統(tǒng)有效地避免了實(shí)驗(yàn)過程中帶來的人為誤差，保證了測(cè)定過程的準(zhǔn)確度和精確度(測(cè)定精度較高，日內(nèi)RSD為0.4％，日間RSD為3％)。用該方法測(cè)得的正常人血漿輔酶Q10的含量水平與甲亢病人的含量水平有顯著性差異(P＜0.05)，因而在臨床上可輔助甲亢及甲減病歷的診斷。
3.成本低。該系統(tǒng)采用自動(dòng)在線裝置凈化血樣，分析柱的使用壽命得到了保證，同時(shí)，該系統(tǒng)避免了用固相萃取小柱凈化血樣，成本大大降低。
4.應(yīng)用效果好。本發(fā)明基于多維液相色譜和輔酶Q10，將輔酶Q10含量作為甲亢、甲減病例臨床判據(jù)指標(biāo)，可以彌補(bǔ)了FT3及FT4作判據(jù)的不足；本發(fā)明的甲狀腺疾病輔助診斷儀，通過特定的緩沖液和分析方法，可自動(dòng)準(zhǔn)確高效地檢測(cè)人體血漿輔酶Q10的含量，從而有效地輔助甲亢和甲減兩種常見甲狀腺疾病的診斷；通過病人體內(nèi)血漿輔酶Q10的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可及早地掌握病人的恢復(fù)狀況，為選擇和確定新的治療方案提供可靠的依據(jù)。


圖1為本發(fā)明輔助診斷儀的流程示意圖。
圖2為本發(fā)明輔助診斷儀中六通閥處于“LOAD”切換位置示意圖。
圖3為本發(fā)明輔助診斷儀中六通閥處于“INJECT”切換位置示意圖。
圖4為血漿輔酶Q10的液相色譜在線系統(tǒng)分離譜圖。峰1.輔酶Q10.操作條件色譜分析柱1(4.6mm i.d×20mm)、色譜分析柱2(4.6mm i.d×150mm)、檢測(cè)波長275nm，進(jìn)樣量400ul，其余條件見表1。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.本發(fā)明的儀器可實(shí)現(xiàn)血樣的自動(dòng)預(yù)處理、自動(dòng)進(jìn)樣和輔酶Q10組分的自動(dòng)分離和定量；它主要通過如下步驟來完成；1)取體積0.3ml的新鮮血漿樣品，加入1ml的正丙醇(兩者的體積比可為0.2∶1至0.4∶1均可)離心脫脂除蛋白后，將上層清液直接上樣分析；2)當(dāng)六通閥處于“LOAD”位置(圖2)，通過自動(dòng)進(jìn)樣器將分析樣品直接進(jìn)樣，選用純甲醇淋洗十八烷基鍵合硅膠柱A，使得血漿中輔酶Q10保留在柱A上；3)繼續(xù)用純甲醇沖洗柱A，血漿中殘存的一些雜質(zhì)經(jīng)過柱A流入廢液排出管路廢液瓶中至；4)當(dāng)六通閥處于“INJECT”位置時(shí)(圖3)，以甲醇和異丙醇作流動(dòng)相，血漿中輔酶Q10組分從柱A上洗脫下來，經(jīng)過六通閥的3-4-1-2到達(dá)十八烷基鍵合硅膠柱B的最上端，完成柱A和柱B間在線傳遞全過程；5)六通閥重新回到“LOAD”位置，在柱B上實(shí)行甲醇和異丙醇等度淋洗程序，達(dá)到分離測(cè)定輔酶Q10的目的；在進(jìn)行下一輪血樣分析之前，用純甲醇重新活化色譜分析柱1。
6)按照上述步驟便可對(duì)人體血漿輔酶Q10含量進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，通過對(duì)正常人、甲亢及甲減三組人群體內(nèi)Q10含量的監(jiān)測(cè)，可掌握人體血漿含量的大致水平，從而可輔助甲亢或甲減的準(zhǔn)確診斷；通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可確切的掌握病人的恢復(fù)狀況，為選擇和確定新的治療方案提供可靠的依據(jù)。
2.在本發(fā)明構(gòu)建的輔助診斷儀上，采用表1(其中，流動(dòng)相A為純甲醇溶液，流動(dòng)相B為甲醇和異丙醇體積比9∶1的混合液)及圖4所示分析條件，對(duì)血漿樣品中的輔酶Q10組分進(jìn)行分離測(cè)定(圖4)。
表1 閥切換時(shí)間及流動(dòng)相流速變化

對(duì)6個(gè)甲減病人、39個(gè)甲亢病人及76個(gè)正常人血漿中的輔酶Q10進(jìn)行測(cè)定，正常人體內(nèi)的輔酶Q10含量為0.67±0.25mg/l(mean±SD)，甲亢病人為0.42±0.17mg/l(mean±SD)，甲減為0.89±0.17mg/l(mean±SD)。對(duì)甲亢病人和正常人血漿輔酶Q10含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，二者的含量具顯著性差異(P＜0.05)。
3.對(duì)比甲狀腺激素在體內(nèi)代謝時(shí)間較長，因此它不能作為甲亢疾病的靈敏指標(biāo)。有些病人已出現(xiàn)甲亢癥狀，體內(nèi)FT3，F(xiàn)T4值仍保持正常，比如有一例病人，已出現(xiàn)甲亢癥狀，經(jīng)醫(yī)學(xué)檢測(cè)FT3＝6.1，F(xiàn)T4＝22，TSH＝0.596，單從這組數(shù)據(jù)無法斷定他是否甲亢。通過檢測(cè)血漿輔酶Q10含量，其值為0.33mg/l，明顯低于正常人，因而可輔助確診為甲亢。
4.檢測(cè)血漿輔酶Q10的含量可盡早地了解病人的恢復(fù)狀況。有一例病人，其在甲亢時(shí)和治療一段時(shí)間后的檢測(cè)情況見表2，從該病人的FT3，F(xiàn)T4，TSH很難判斷他是否恢復(fù)，但從輔酶Q10的含量變化就非常清楚了，事實(shí)上，該病人復(fù)查時(shí)已無任何不適癥狀。
表2 一病人甲亢前后的生理數(shù)據(jù)比較

權(quán)利要求
1.一種甲狀腺疾病輔助診斷儀，其特征在于主要由高壓泵A(1)、高壓泵B(2)、高壓泵C(3)、自動(dòng)進(jìn)樣器(4)、六通閥(5)、十八烷基鍵合硅膠柱A(6)、混合器(7)、十八烷基鍵合硅膠柱B(8)和紫外-可見檢測(cè)器(9)組成；六通閥(5)的⑥位通過自動(dòng)進(jìn)樣器(4)與高壓泵A(1)連接，六通閥(5)的①位和④位分別接親和十八烷基鍵合硅膠柱A(6)兩端，六通閥(5)的⑤位接廢液排出管路，六通閥(5)的③位與混合器(7)出口相連，高壓泵B(2)和高壓泵C(3)與混合器(7)入口相連，六通閥(5)的②位與十八烷基鍵合硅膠柱B(8)一端相連，十八烷基鍵合硅膠柱B(8)的另一端通過紫外-可見檢測(cè)器(9)與廢液排出管路相連。
2.一種甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其特征在于通過對(duì)血漿中輔酶Q10含量高低的檢測(cè)輔助診斷甲狀腺疾病，具體步驟如下，1)取血漿加入正丙醇離心脫脂除蛋白后，將上層清液直接上樣分析；2)將分析樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器直接上樣，六通閥處于“LOAD”位置，選用純甲醇淋洗十八烷基鍵合硅膠柱A，使得血漿中輔酶Q10保留在柱A上；3)繼續(xù)用純甲醇沖洗柱A，血漿中殘存的一些雜質(zhì)經(jīng)過柱A流入廢液排出管路；4)六通閥處于“INJECT”位置以甲醇和異丙醇作流動(dòng)相，血漿中輔酶Q10組分從柱A上洗脫下來，經(jīng)過六通閥到達(dá)十八烷基鍵合硅膠柱B的最上端，完成柱A和柱B間在線傳遞全過程；5)六通閥重新回到“LOAD”位置，在柱B上實(shí)行甲醇和異丙醇等度淋洗程序，達(dá)到分離測(cè)定輔酶Q10的目的；6)按照上述步驟便可對(duì)人體血漿輔酶Q10含量進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，通過對(duì)正常人、甲亢及甲減三組人群體內(nèi)Q10含量的監(jiān)測(cè)，可掌握人體血漿含量的大致水平，并通過與正常人比較實(shí)現(xiàn)了是否患甲狀腺疾病的輔助診斷；如果含量顯著高于正常人平均值則很可能為甲減；如顯著低于正常人平均值，則很可能為甲亢；否則則為正常。
3.按照權(quán)利要求2所述甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其特征在于按照步驟1)～5)通過對(duì)人體血漿輔酶Q10含量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可確切的掌握病人的恢復(fù)狀況。
4.按照權(quán)利要求2所述甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其特征在于其中所述柱A為預(yù)處理柱，長度10～30mm，內(nèi)徑4～4.6mm；柱B為分析柱，長度100～250mm，內(nèi)徑4～4.6mm。
5.按照權(quán)利要求2所述甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其特征在于其中所述純甲醇，流量為0.3～1ml/min。
6.按照權(quán)利要求2所述甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其特征在于其中所述甲醇和異丙醇的體積比為15∶1～1∶1。
7.按照權(quán)利要求2所述甲狀腺疾病輔助診斷儀的應(yīng)用，其特征在于其中所述血漿與正丙醇的體積比為0.2∶1至0.4∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及疾病診斷儀器，具體地說是一種甲狀腺疾病輔助診斷儀及其應(yīng)用；主要由高壓泵A(1)、高壓泵B(2)、高壓泵C(3)、自動(dòng)進(jìn)樣器(4)、六通閥(5)、十八烷基鍵合硅膠柱A(6)、混合器(7)、十八烷基鍵合硅膠柱B(8)和紫外－可見檢測(cè)器(9)組成；六通閥(5)的⑥位通過自動(dòng)進(jìn)樣器(4)與高壓泵A(1)連接，六通閥(5)的①位和④位分別接親和十八烷基鍵合硅膠柱A(6)兩端，六通閥(5)的⑤位接廢液排出管路，六通閥(5)的③位與混合器(7)出口相連，高壓泵B(2)和高壓泵C(3)與混合器(7)入口相連，六通閥(5)的②位與十八烷基鍵合硅膠柱B(8)一端相連，十八烷基鍵合硅膠柱B(8)的另一端通過紫外－可見檢測(cè)器(9)與廢液排出管路相連。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)精度高、成本低、應(yīng)用效果好。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1623507SQ20031010527
公開日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者許國旺, 江平, 鄭育芳 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所