專利名稱：櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記cfeem003和cfeem007的快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于櫛孔扇貝DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，是一種快速檢測(cè)櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)CFEEMOO3和CFEEMOO7的方法。
背景技術(shù)：
在真核生物基因組中，存在著由1-6個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SimpleSequence Repeats)，簡(jiǎn)稱SSRs，又稱之為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)。隨著分子標(biāo)記的發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)成為國(guó)際上主流的標(biāo)記技術(shù)之一。微衛(wèi)星標(biāo)記有諸多優(yōu)點(diǎn)，如隨機(jī)分布在整個(gè)基因組中，多態(tài)性高；可通過(guò)PCR迅速擴(kuò)增，需要的DNA樣品量較少，并且重復(fù)性好；孟德?tīng)柺竭z傳，共顯性標(biāo)記。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面得到廣泛的應(yīng)用。
已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者在多種海洋和水產(chǎn)生物中篩選出多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。徐鵬等利用PCR法快速篩選了中國(guó)對(duì)蝦含有微衛(wèi)星的重組陽(yáng)性克隆。Yue等從ESTs和利用構(gòu)建富集文庫(kù)的方式成功篩選了鯉魚(yú)(Cyprinus carpio L.)的28個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。在扇貝的微衛(wèi)星研究中，僅報(bào)道了從海灣扇貝和櫛孔扇貝EST數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選成功的幾個(gè)位點(diǎn)。Roberts等對(duì)29個(gè)海灣扇貝EST-SSRs設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中8個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物或者特異性產(chǎn)物，13個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有多態(tài)性，篩選成功的位點(diǎn)僅有8個(gè)。李紅蕾等搜索了櫛孔扇貝6935條ESTs，發(fā)現(xiàn)42條序列含有微衛(wèi)星，選取了其中的7條序列設(shè)計(jì)引物，其中僅有3對(duì)引物有望在以后的工作中加以應(yīng)用。而櫛孔扇貝基因組來(lái)源的微衛(wèi)星標(biāo)記以及微衛(wèi)星標(biāo)記在櫛孔扇貝分子遺傳學(xué)分析中的應(yīng)用至今沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測(cè)方法。主要利用建立的櫛孔扇貝微衛(wèi)星富集文庫(kù)中含有微衛(wèi)星的陽(yáng)性克隆，在核心重復(fù)序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而快速的檢測(cè)櫛孔扇貝每個(gè)個(gè)體在此微衛(wèi)星區(qū)域的遺傳變異，獲得櫛孔扇貝在該位點(diǎn)的多態(tài)性圖譜，通過(guò)圖譜直觀、準(zhǔn)確地檢測(cè)出每個(gè)個(gè)體的基因型。
本發(fā)明是按照以下操作步驟完成的首先提取櫛孔扇貝閉殼肌的基因組DNA并稀釋備用；菌落原位雜交法篩選構(gòu)建的櫛孔扇貝微衛(wèi)星富集文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，在其微衛(wèi)星核心重復(fù)序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；使用該引物對(duì)櫛孔扇貝不同地理群或者櫛孔扇貝群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，利用軟件Quantity One準(zhǔn)確快速地確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得櫛孔扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜。
兩個(gè)陽(yáng)性克隆的序列為CFEEM003CAATGAGTGGGTAATACTCTACTCGATGGAAAAAGTGGAAGGTTGAAGCCCCCAACACAACACACACACACACACACACACGCTTGCTTACGACAGACATGCFEEM007AGTGTTTTATACAGAGGTTTTACGGTAAAAGACCATGACAACTGACACAAGTGCATTATACAGAGGTTTTACGGTACAAGATCATGTAGACATTCTCTGAGGATACGGGAGCAGTAGAAAAAACACACAACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACCAGTTATGCCCAGACGCCGCGTACAATAAACAAAACATTGTTTAGCTGATAAGTTAGAAAAACGAAATACCATTCTGTCACAACAAATGTGCACGCAGACGTATTTATAACATAATCTGTATTTTACTTCTTACCCAAGATATAGCATGCACACTGTCTGCTTGCGAAAGAAAACAAAATGAGATTACTCAGAGGG其中兩個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)的核心重復(fù)序列為CFEEM003(CA)2(AC)11；CFEEM007(TC)13。
兩個(gè)位點(diǎn)的核心序列兩端設(shè)計(jì)的特異性引物序列分別為CFEEM003正向引物5’-ATG AGT GGG TAA TAC TCT ACT CG-3’；CFEEMOO3反向引物5’-CAT GTC TGT CGT AAGCAA GC-3’，退火溫度60℃。CFEEM007正向引物5’-TTC TCT GAG GAT ACG GGA GC-3’；CFEEM007反向引物5’-GTT TAT TGT ACG CGG CGT C-3’，退火溫度60℃。
提取櫛孔扇貝基因組DNA，將其稀釋為20ng/μl，每個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2μl，反應(yīng)體系為20μl。
對(duì)櫛孔扇貝不同地理群體或者櫛孔扇貝個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)條件為40ng櫛孔扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶(Promega)。使用這兩對(duì)引物時(shí)設(shè)置的PCR程序參數(shù)為95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)(pUC19/HaeIII)。電泳2-3小時(shí)后用溴化乙錠(濃度為0.15mg/mL)染色，凝膠成像系統(tǒng)上紫外成像并對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析。利用軟件Quantity One對(duì)每個(gè)個(gè)體帶進(jìn)行快速準(zhǔn)確的基因型確定。
應(yīng)用上述方法，可以檢測(cè)櫛孔扇貝的每個(gè)個(gè)體在此微衛(wèi)星區(qū)域的遺傳變異情況。通過(guò)電泳圖譜和Quantity One軟件分析結(jié)果，能夠準(zhǔn)確、方便、快捷地判讀出每個(gè)個(gè)體在上述兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因的大小以及每個(gè)個(gè)體的基因型。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明。
首先提取櫛孔扇貝的基因組DNA備用；然后用菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的櫛孔扇貝微衛(wèi)星富集文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序，再在微衛(wèi)星核心重復(fù)序列的兩端設(shè)計(jì)引物；并使用該引物對(duì)櫛孔扇貝不同群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；利用已有的軟件Quantity One準(zhǔn)確快速地確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得櫛孔扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜，準(zhǔn)確地檢測(cè)出每個(gè)個(gè)體的基因型，從而快速的檢測(cè)櫛孔扇貝每個(gè)個(gè)體在此微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳變異。
1、櫛孔扇貝基因組DNA的提取取扇貝閉殼肌約0.1克，加入500μlSTE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl 10％的SDS，以及5μl 20mg/ml的蛋白酶K，56度處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μlNaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿冰無(wú)水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘。將核酸沉淀于管底。70％7醇(1000μl)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100μl的無(wú)菌水和少量RNase A，4度直到DNA全部溶解。紫外分光光度計(jì)定量稀釋成20ng/μl備用。
2、根據(jù)富集文庫(kù)—菌落原位雜交的結(jié)果，陽(yáng)性克隆測(cè)序，其序列為CFEEM003CAATGAGTGGGTAATACTCTACTCGATGGAAAAAGTGGAAGGTTGAAGCCCCCAACACAACACACACACACACACACACACGCTTGCTTACGACAGACATGCFEEM007AGTGTTTTATACAGAGGTTTTACGGTAAAAGACCATGACAACTGACACAAGTGCATTATACAGAGGTTTTACGGTACAAGATCATGTAGACATTCTCTGAGGATACGGGAGCAGTAGAAAAAACACACAACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACCAGTTATGCCCAGACGCCGCGTACAATAAACAAAACATTGTTTAGCTGATAAGTTAGAAAAACGAAATACCATTCTGTCACAACAAATGTGCACGCAGACGTATTTATAACATAATCTGTATTTTACTTCTTACCCAAGATATAGCATGCACACTGTCTGCTTGCGAAAGAAAACAAAATGAGATTACTCAGAGGG3、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)在櫛孔扇貝微衛(wèi)星富集文庫(kù)基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列的保守性設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增該位點(diǎn)的微衛(wèi)星片斷。由于微衛(wèi)星核心重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)不同，使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生了長(zhǎng)度的變化而呈現(xiàn)多態(tài)性，這是檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性的根源所在。引物設(shè)計(jì)采用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設(shè)計(jì)采用以下嚴(yán)謹(jǐn)度(1)引物長(zhǎng)度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度大于50度；(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-250bp。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，兩個(gè)位點(diǎn)的特異性PCR引物序列為CFEEM003正向引物5’-ATG AGT GGG TAA TAC TCT ACT CG-3’；CFEEM003反向引物5’-CAT GTCTGT CGT AAG CAA GC-3’，退火溫度60℃。CFEEM007正向引物5’-TTC TCT GAG GAT ACGGGA GC-3’；CFEEM007反向引物5’-GTT TAT TGT ACG CGG CGT C-3’，退火溫度60℃。
4、PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系的組成為40ng櫛孔扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
5、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)(pUC19/HaeIII)。電泳完畢后用溴化乙錠(濃度為0.15mg/mL)染色，紫外觀察成像并對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析。
綜上所述，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)微衛(wèi)星標(biāo)記的核心是根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性引物，因此本發(fā)明的核心是特異性PCR引物；本發(fā)明可以準(zhǔn)確、方便、快捷地判讀出櫛孔扇貝PYMSE005位點(diǎn)的每個(gè)等位基因的大小以及每個(gè)個(gè)體的基因型。操作簡(jiǎn)單，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定直觀；本發(fā)明主要應(yīng)用于櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建、不同地理群體遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面的研究。
權(quán)利要求
1.一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于首先提取櫛孔扇貝閉殼肌的基因組DNA稀釋備用；然后菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的櫛孔扇貝微衛(wèi)星富集文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，在其微衛(wèi)星核心重復(fù)序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；接著使用該引物對(duì)櫛孔扇貝不同群體或者群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；最后利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，即獲得櫛孔扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于兩個(gè)陽(yáng)性克隆的序列為CFEEM003CAATGAGTGGGTAATACTCTACTCGATGGAAAAAGTGGAGGGGGGGGGGGGAGGTTGAAGCCCCCAACACAACACACACACACACACACACACGCTTGCTTACGACAGACATGCFEEM007AGTGTTTTATACAGAGGTTTTACGGTAAAAGACCATGACAACTGACACAAGTGCATTATACAGAGGTTTTACGGTACAAGATCATGTAGACATTCTCTGAGGATACGGGAGCAGTAGAAAAAACACACAACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACCAGTTATGCCCAGACGCCGCGTACAATAAACAAAACATTGTTTAGCTGATAAGTTAGAAAAACGAAATACCATTCTGTCACAACAAATGTGCACGCAGACGTATTTATAACATAATCTGTATTTTACTTCTTACCCAAGATATAGCATGCACACTGTCTGCTTGCGAAAGAAAACAAAATGAGATTACTCAGAGGG
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于兩個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)的核心重復(fù)序列分別為CFEEM003(CA)2(AC)11；CFEEM007(TC)13。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于在其心序列兩端設(shè)計(jì)的特異性引物序列分別為CFEEM003正向引物5’-ATG AGT GGG TAA TAC TCT ACTCG-3’；CFEEM003反向引物5’-CAT GTC TGT CGT AAG CAA GC-3’，退火溫度60℃。CFEEM007正向引物5’-TTC TCT GAG GAT ACG GGA GC-3’；CFEEM007反向引物5’-GTT TAT TGT ACG CGG CGT C-3’，退火溫度60℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于提取櫛孔扇貝的基因組DNA，將其稀釋為20ng/μl，每個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2μl，反應(yīng)體系為20μl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)櫛孔扇貝不同地理群體或者櫛孔扇貝個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)條件為40ng櫛孔扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶；使用這兩對(duì)引物時(shí)設(shè)置的PCR程序參數(shù)為95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法，其特征在于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)——pUC19/HaeIII；電泳2-3小時(shí)后用濃度為0.15mg/mL的溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)上紫外成像并對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析；最后利用軟件Quantity One確定每個(gè)個(gè)體在上述兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因的大小以及每個(gè)個(gè)體的基因型。
全文摘要
一種櫛孔扇貝兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記CFEEM003和CFEEM007的快速檢測(cè)方法。首先提取櫛孔扇貝的基因組DNA備用；然后用菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的櫛孔扇貝微衛(wèi)星富集文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序，再在微衛(wèi)星核心重復(fù)序列的兩端設(shè)計(jì)引物；并使用該引物對(duì)櫛孔扇貝不同群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；利用已有軟件準(zhǔn)確快速地確定每個(gè)個(gè)體的基因型，獲得櫛孔扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明應(yīng)用于櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建、不同群體或養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面的研究。能夠準(zhǔn)確、方便、快捷地判讀出每個(gè)等位基因的大小和每個(gè)個(gè)體的基因型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1793382SQ20051004479
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者包振民, 胡景杰, 汪小龍, 戰(zhàn)愛(ài)斌, 惠敏 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)