專利名稱：轉(zhuǎn)pis基因改變植物抗逆性的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說(shuō)，涉及一種通過(guò)轉(zhuǎn)反義或正義PIS基因改變植物抗逆性的方案及用途。
背景技術(shù)：
磷脂酰肌醇信號(hào)途徑中部分酶的研究進(jìn)展近年來(lái)關(guān)于植物信號(hào)傳導(dǎo)的研究取得了一定的進(jìn)展，其中磷脂酰肌醇代謝途徑在動(dòng)物和高等植物的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇合成酶(PIS)催化myo-inosiol和CDP-甘油生成磷脂酰肌醇(PI)，PI的D3、D4、D5位置有順序的磷酸化產(chǎn)生了重要的信號(hào)分子PI(3.4)P2、PI(3.4.5)P3和PI(4.5)P2。PI(4.5)P2被PI-PLC分解成為IP3和DG，其中IP3刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，DG激活PKC。目前動(dòng)物中許多PI系統(tǒng)中的組分已被克隆出來(lái)，而從植物細(xì)胞中分離出來(lái)的相對(duì)較少。
早在1985年已有人報(bào)道PI參與植物與環(huán)境間的相互作用，現(xiàn)在有明確的報(bào)道表明植物中PI除了在鈣信號(hào)中發(fā)揮作用外，還在一系列環(huán)境脅迫信號(hào)如滲透脅迫、光脅迫、病原體感染和調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起重要作用，另外PI4P和PI(4.5)P2還影響質(zhì)膜H+-ATPase和PLD等酶的活性。總之，磷脂酰肌醇代謝途徑在細(xì)胞與外界因子的相互作用、激素的作用以及外界信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)的傳遞方面發(fā)揮著重要的功能。
最近，編碼植物磷脂酰肌醇系統(tǒng)中部分酶的cDNA已被越來(lái)越多的克隆出來(lái)。有關(guān)磷脂酰肌醇合成酶(PIS)克隆及功能鑒定的工作很少。
1999年Collin等從擬南芥中分離到編碼PIS的cDNA，對(duì)其功能進(jìn)行鑒定并將其定位在2號(hào)染色體上。
2000年Xue等克隆從擬南芥中到AtPIS1基因并將其在酵母中表達(dá)，初步鑒定了其功能。另外Xue等已從水稻中已克隆到編碼PIS的cDNA序列。
2002年，申請(qǐng)人從玉米cDNA文庫(kù)中篩選出一個(gè)編碼磷脂酰肌醇合成酶的全長(zhǎng)cDNA序列(ZmPIS)。序列分析表明，ZmPIS在核苷酸水平上與從其它生物中已經(jīng)克隆出的PIS具有很高的相似性，在氨基酸水平上ZmPIS與來(lái)自水稻、擬南芥、小鼠、酵母及人的PIS的相似性分別為85％、63％、30％、38％和29％，且ZmPIS具有CDP-alcohol磷酸轉(zhuǎn)移酶的特征性保守結(jié)構(gòu)DG(X)2AR(X)8G(X)3D(X)3D。對(duì)ZmPIS基因表達(dá)分析表明，在正常生長(zhǎng)條件下，該基因在玉米的根、莖、葉中都有表達(dá)。而玉米葉中ZmPIS的轉(zhuǎn)錄水平受干旱、鹽脅迫及低溫脅迫誘導(dǎo)。為了驗(yàn)證ZmPIS的功能，ZmPIS的編碼區(qū)被重組入酵母表達(dá)載體pYES2/NT，轉(zhuǎn)化pis酵母突變體YPR113W。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行隨機(jī)孢子分析表明ZmPIS功能性互補(bǔ)pis突變體。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別獲得了轉(zhuǎn)該基因的正義及其反義形式的煙草植株和玉米。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生理分析得出，轉(zhuǎn)ZmPIS基因的表達(dá)使煙草植株的耐鹽性和耐旱性有顯著提高。
根據(jù)申請(qǐng)人的工作得出，植物細(xì)胞膜中PI的積累有利于脅迫條件下傳導(dǎo)信號(hào)的加強(qiáng)和膜的流動(dòng)性增加，從而提高植物細(xì)胞適應(yīng)逆境的能力。即PI產(chǎn)物在受到環(huán)境的高等植物的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮功能性作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用方法是，將從植物中克隆的PIS基因以反義或正義形式重組到植物表達(dá)載體中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和對(duì)植株進(jìn)行抗逆性鑒定，從中篩選出抗逆性明顯提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。
其中，所述PIS基因來(lái)自各種植物，有cDNA形式或基因組基因形式，其編碼序列以反義形式或正義形式構(gòu)建成融合基因，并轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。
其中，所述用于構(gòu)建融合基因的PIS基因的反義形式可為基因的全長(zhǎng)序列，也可以為部分序列，也可以為根據(jù)部分序列人工合成的脫氧多核苷酸。
其中，所述應(yīng)用方法是通過(guò)轉(zhuǎn)PIS反義基因或依據(jù)PIS基因序列設(shè)計(jì)的多核苷酸序列獲得的抗逆性提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株。
其中，所述應(yīng)用方法還可以是通過(guò)轉(zhuǎn)PIS基因獲得對(duì)逆境抗性提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株及后代。
本發(fā)明所說(shuō)的PIS基因主要克隆于植物，以玉米PIS基因(ZmPIS)為代表。該基因一般以cDNA形式克隆，以正向或反向形式重組到植物表達(dá)載體中，也可根據(jù)該基因序列構(gòu)建用于抑制PIS基因表達(dá)的RNAi基因。在植物表達(dá)載體中，該基因轉(zhuǎn)錄由植物特異的啟動(dòng)子啟動(dòng)，編碼區(qū)后為植物基因的3′尾巴區(qū)。因此該融合基因能在植物細(xì)胞中有效表達(dá)。
本發(fā)明所說(shuō)的基因正向形式插入是指在植物的啟動(dòng)子序列后面正確連接上PIS基因的完整編碼框，即第一個(gè)密碼子緊靠啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為正義mRNA。本發(fā)明所說(shuō)的基因反向形式插入是指在植物的啟動(dòng)子與PIS基因編碼框的3′端相連，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為與正義mRNA序列相反的mRNA，因此，可抑制內(nèi)源PIS基因的表達(dá)。以反向形式插入的PIS基因并不要求編碼區(qū)完整，但要求轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)基本穩(wěn)定。
本發(fā)明所說(shuō)的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或細(xì)胞水平上表現(xiàn)出的耐(抗)旱性、耐(抗)鹽性、耐冷性、抗寒性、耐澇性、耐熱性、抗(耐)輻射性、抗病性、抗蟲(chóng)性、抗除草劑等特性及其組合。這種抗(耐)性在植株水平上可表現(xiàn)在某些發(fā)育階段或全生育期，可通過(guò)多種指標(biāo)衡量或評(píng)價(jià)。
本發(fā)明所說(shuō)的植物包括高等植物、低等植物和藻類。
其中，包括各類作物和經(jīng)濟(jì)植物、觀賞植物、生態(tài)植物、雜草等；包括被子植物、裸子植物、藻類等；包括草本植物、木本植物和單細(xì)胞藻類等。
ZmPIS序列的基本特征從玉米cDNA篩選出的序列全長(zhǎng)1164bp，包含一個(gè)648個(gè)核苷酸的編碼框。推測(cè)其編碼一個(gè)由215個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，計(jì)算得其分子量和等電點(diǎn)分別為24kDa和8.79。其起始密碼子上游第122-124核苷酸編碼一個(gè)終止密碼子，顯示該cDNA序列包含全長(zhǎng)ZmPIS編碼區(qū)。用Clustal W軟件將ZmPIS序列與來(lái)自其它物種的PIS序列進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，ZmPIS與其它PIS在核苷酸及氨基酸水平上有很高的相似性，在氨基酸水平上與來(lái)自水稻、擬南芥、小鼠、酵母和人的PIS的相似性分別為85％、63％、30％、38％、29％。而且，ZmPIS含有CDP-alcohol轉(zhuǎn)移酶的特征性保守結(jié)構(gòu)D-G-x(2)-A-R-x(8)-G-x(3)-D-x(3)-D。依據(jù)Kyte和Doolittle(1982)的方法對(duì)PIS蛋白進(jìn)行疏水性分析得出PIS是疏水性蛋白，保守結(jié)構(gòu)位于親水性區(qū)域，暗示此結(jié)構(gòu)域是該酶的活性位點(diǎn)。另外，在ZmPIS蛋白質(zhì)序列中發(fā)現(xiàn)有4個(gè)潛在的PKC磷酸化位點(diǎn)29-31(SNK)、69-71(TDR)、112-114(SGK)、116-118(SHK)；兩個(gè)潛在的Casein kinase II磷酸化位點(diǎn)116-119(SHKD)和201-204(TAAD)。
ZmPIS基因的重組采用常規(guī)的分子克隆技術(shù)將ZmPIS的全長(zhǎng)cDNA序列重組入植物雙元表達(dá)載體pROK2或pCam系列等植物表達(dá)載體中獲得正向和反向插入ZmPIS重組質(zhì)粒。可根據(jù)受體植物和所需的ZmPIS基因的表達(dá)強(qiáng)度及可調(diào)控程度，融合基因可選用分別適合于單、雙子葉植物和不同低等生物的組成性啟動(dòng)子，可選擇植物器官或發(fā)育階段特異性的啟動(dòng)子，或?qū)μ禺愋盘?hào)(包括逆境信號(hào)、化學(xué)信號(hào)、物理信號(hào)等)發(fā)生反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。融合基因可選擇不同3′尾巴區(qū)，也可插入增強(qiáng)子序列，也可在編碼區(qū)插入不同內(nèi)含子。重組質(zhì)?？煞謩e導(dǎo)入大腸桿菌或農(nóng)桿菌中增殖或/和保存。
用含有ZmPIS基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物根據(jù)轉(zhuǎn)基因受體材料選用不同轉(zhuǎn)基因方法獲得轉(zhuǎn)基因植物。
常用的轉(zhuǎn)化方法有3類1)直接轉(zhuǎn)化法，即提取重組質(zhì)粒DNA，采用基因槍轟擊法、聚乙二醇誘導(dǎo)法、電融合法、硅碳纖維法等直接將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞。2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳化方法。3)種系轉(zhuǎn)化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，還有將不同類方法組合使用的轉(zhuǎn)化程序，如將基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌結(jié)合使用以提高轉(zhuǎn)化效率。以下以玉米自交系胚性愈傷組織為材料采用基因槍轟擊法和以煙草葉盤(pán)為材料采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
A.玉米自交系胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-12天，取果穗剝?nèi)グ~后于70％酒精中浸泡5min，無(wú)菌條件下挑取約1.0-1.2mm大小的幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4-6周得到松脆、淡黃色的II型愈傷組織，然后繼代培養(yǎng)基每10-15天繼代培養(yǎng)一次。所得到的II型愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。
采用常規(guī)方法制備基因槍彈丸。即稱取1.0μm大小的金粉，經(jīng)70％乙醇洗滌后靜置15分鐘，離心去除上清液；再用無(wú)菌水徹底清洗3次，然后50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈)貯存?zhèn)溆?。使用時(shí)渦旋5分鐘打破金粉凝集，依次加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl 0.1M亞精胺，邊加樣邊旋渦。然后，繼續(xù)旋渦2～3分鐘，靜置1分鐘。離心棄上清液后，加70％乙醇靜置。然后離心棄上清液，再用無(wú)水乙醇重懸，取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入0.4cm厚的培養(yǎng)基，然后將愈傷組織高密度放入培養(yǎng)皿中每皿轟擊一次。轟擊參數(shù)取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，微彈飛行距離6-9cm。其它參數(shù)按使用說(shuō)明書(shū)取值。轟擊后材料在暗中恢復(fù)培養(yǎng)3天，然后將材料轉(zhuǎn)入成分不變的新培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，使轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因充分表達(dá)。將材料轉(zhuǎn)入加有選擇劑(如1-5ppm除草劑綠黃隆)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。連續(xù)篩選三代，每代15天。繼代時(shí)淘汰變褐死亡的組織塊。經(jīng)過(guò)篩選的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入不加篩選劑的培養(yǎng)基上在光照16小時(shí)/天下恢復(fù)培養(yǎng)1代后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上分化小苗。愈傷組織產(chǎn)生的小苗在生根培養(yǎng)基中生根，壯苗后移入花盆，長(zhǎng)至約10cm高時(shí)栽到大田中，自交結(jié)實(shí)。轉(zhuǎn)基因植株采用PCR檢測(cè)法篩選，Southern blotting驗(yàn)證。通過(guò)數(shù)代分子檢測(cè)和自交結(jié)實(shí)產(chǎn)生純系，在通過(guò)抗性鑒定和田間選擇獲得轉(zhuǎn)基因優(yōu)異材料。
B.煙草葉盤(pán)遺傳轉(zhuǎn)化取煙草無(wú)菌苗為材料，利用葉盤(pán)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404，攜帶含有ZmPIS基因和植物篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移霉基因nptII的Mini-Ti質(zhì)粒。采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因小芽在含有選擇劑卡那霉素(Kan)150μg/ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選，在生根培養(yǎng)基上生根。采用PCR和Southern雜交分析法確定轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR方法檢測(cè)出分別含正義和反義ZmPIS基因的陽(yáng)性植株，不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化植株。Northern雜交分析表明異源ZmPIS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中有很高的表達(dá)水平，而未轉(zhuǎn)基因植株和不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化植株幾乎沒(méi)有雜交信號(hào)。
轉(zhuǎn)基因植株抗逆性測(cè)定為檢測(cè)ZmPIS基因的生理功能，將其在煙草中進(jìn)行正義和反義表達(dá)。在正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因煙草植株沒(méi)有表型差異。然而，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草葉盤(pán)的鹽耐受性，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因的煙草與對(duì)照植株相比，其耐鹽性和耐旱性明顯提高。用不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化煙草不會(huì)影響再生植株的生理指標(biāo)。所以轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性及耐旱性的改變是由于ZmPIS基因表達(dá)促成的。
轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小苗在生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1個(gè)月后，分別檢測(cè)其耐鹽性和耐旱性。將轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株的葉片切成0.5cm2的葉盤(pán)，分別在含0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％NaCl的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定其相對(duì)生長(zhǎng)量。在含有0.5％和1.0％NaCl的培養(yǎng)基上，各種葉盤(pán)生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)生愈傷組織繼而分化成芽，彼此之間的相對(duì)生長(zhǎng)量沒(méi)有顯著差別。在加有1.5％NaCl的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因的煙草葉盤(pán)呈綠色，邊緣有愈傷組織生成。在加有2.0％NaCl的培養(yǎng)基上，各種葉盤(pán)間的生長(zhǎng)狀況差異明顯，來(lái)自轉(zhuǎn)反義基因植株的葉盤(pán)多數(shù)(70％)死亡；來(lái)自對(duì)照植株的葉盤(pán)約半數(shù)死亡，其余生長(zhǎng)較差；而90％來(lái)自轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因的葉盤(pán)依然存活，生長(zhǎng)較好。相對(duì)生長(zhǎng)量的統(tǒng)計(jì)得出相同結(jié)論轉(zhuǎn)正義基因的植株葉盤(pán)的相對(duì)生長(zhǎng)量明顯高于來(lái)自轉(zhuǎn)反義基因和對(duì)照植株的葉盤(pán)的相對(duì)生長(zhǎng)量。這說(shuō)明正義ZmPIS在煙草中的異源表達(dá)能提高煙草的耐鹽性。
轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐旱性檢測(cè) 為了了解ZmPIS基因能否影響轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)，將轉(zhuǎn)基因煙草小苗置于含10％(W/V)PEG 6000的MS無(wú)機(jī)鹽溶液中進(jìn)行滲透脅迫處理，檢測(cè)葉片相對(duì)含水量的變化。煙草植株在滲透脅迫過(guò)程中葉片相對(duì)含水量逐漸降低，轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)含水量比對(duì)照植株降低速率低。18h后轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因植株得葉片相對(duì)含水量從滲透脅迫處理前的94％-99％降低為62％-66％，而非轉(zhuǎn)基因植株葉片相對(duì)含水量從96％-98％降低為56％-60％。這說(shuō)明轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因的煙草植株耐旱性有一定增強(qiáng)。
轉(zhuǎn)基因玉米植株的耐鹽性檢測(cè)及利用采用PCR方法檢測(cè)出分別含正義和反義ZmPIS基因的玉米陽(yáng)性植株，套袋自交或姊妹交結(jié)實(shí)。收獲的種子播種在砂盆中，澆灌0.8％NaCl水溶液，并以未轉(zhuǎn)基因自交系種子為對(duì)照。轉(zhuǎn)基因植株的不同株系在鹽水澆灌下表現(xiàn)出不同的耐鹽性，多數(shù)轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因的株系表現(xiàn)出比對(duì)照明顯提高的耐鹽性。在轉(zhuǎn)正義ZmPIS基因的株系中，半數(shù)以上株系的5葉期成活率在70％以上，而對(duì)照自交系植株出苗后很快死亡，5葉期的成活率不到20％，且植株嚴(yán)重受害。Northern雜交分析表明ZmPIS基因在這些轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)表達(dá)，在未轉(zhuǎn)基因植株和不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化植株中，ZmPIS基因的表達(dá)水平無(wú)明顯差別。選出耐鹽性優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進(jìn)行配合力測(cè)定，選擇配合力與供體自交系相同或有提高的轉(zhuǎn)基因自交系，并用于耐鹽玉米雜交種培育。
轉(zhuǎn)基因玉米植株的耐旱性檢測(cè)及利用將轉(zhuǎn)ZmPIS正義基因的玉米種子和未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照自交系的種子播在的花盆中，分別在苗期(3-7葉期)、雌雄穗發(fā)育期(9-13葉期)、開(kāi)花授粉期進(jìn)行干旱脅迫處理，檢測(cè)干旱處理對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響、細(xì)胞膜受損程度、植株單株產(chǎn)量及其它經(jīng)濟(jì)性狀和生理指標(biāo)的差異等。綜合多方面的測(cè)試結(jié)果，轉(zhuǎn)ZmPIS正義基因的玉米比對(duì)照植株表現(xiàn)出明顯提高的耐旱性。選出耐旱性優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進(jìn)行配合力測(cè)定，選擇配合力與供體自交系相同或有提高的轉(zhuǎn)基因自交系用于玉米單交種選育。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1轉(zhuǎn)ZmPIS正義基因創(chuàng)造玉米耐鹽自交系及應(yīng)用1)受體系統(tǒng)的建立 以我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上所用的骨干自交系為材料，如鄭58、掖478、掖515等的自交種子。離體培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生叢生芽塊，以叢生芽塊為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。所用培養(yǎng)基有種子萌發(fā)培養(yǎng)基KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O440mg/l，MgSO4·7H2O 370mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO310mg/l，KI0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，CuSO4·5H2O 0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，鹽酸硫胺素10.0mg/l，鹽酸吡哆醇1.0mg/l，煙酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，瓊脂粉7g/l，pH5.8-6.0。用于種子萌發(fā)。液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。
A培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA4.5-9.0μmol/l和2，4-D 1.0-3.0μmol/l，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)。
B培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于叢生芽組織塊分化小苗。
成苗培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于叢生小芽發(fā)育成小苗。
生根培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加IBA 2.8-3.6μmol/l，用于無(wú)根小苗生根。
基本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過(guò)濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。
種子滅菌和萌發(fā)玉米種子用70％乙醇浸泡10分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10-15分鐘，然后用無(wú)菌水洗滌3-5遍。滅菌后種子放在無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量(30-40毫升/250毫升三角瓶)無(wú)菌水，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下1-2天。萌動(dòng)(露白)后種子放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。
莖尖培養(yǎng)和叢生芽組織塊誘導(dǎo)、繼代、分化萌發(fā)種子的胚芽伸長(zhǎng)止3-5厘米時(shí)，剝離胚芽鞘及幼葉，切取長(zhǎng)約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A培養(yǎng)基上于黑暗下(24-27℃)培養(yǎng)，并及時(shí)切去伸長(zhǎng)的胚軸和剝?nèi)ビ兹~。培養(yǎng)6-10天后，莖尖開(kāi)始不規(guī)則膨大生長(zhǎng)，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個(gè)瘤狀或指狀突起。20天后，在瘤狀或指狀突起的表面開(kāi)始形成不定芽及胚狀體。一般每4周繼代培養(yǎng)一次。在繼代培養(yǎng)中，若叢生芽組織塊叢生小芽偏多，2，4-D濃度取3.0μmol/l；若叢生芽組織塊愈傷組織化較重，雖有大量的分生細(xì)胞團(tuán)，但表面很少出現(xiàn)不定芽，可將2，4-D濃度降為1.0μmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)則重新產(chǎn)生大量瘤狀或指狀突起。A培養(yǎng)基上的叢生芽組織塊，少數(shù)有不定根的產(chǎn)生。與幼葉存在一樣，不定根也影響組織塊的膨大生長(zhǎng)及胚狀體和叢生小芽的產(chǎn)生，需要及早去掉。叢生芽組織塊在轉(zhuǎn)移到B培養(yǎng)基上2-3天后，色澤逐漸變黃，質(zhì)地較柔韌，5-6天后表面出現(xiàn)微小突起。掃描電鏡下觀察可見(jiàn)各期胚狀體及不定芽。胚狀體及不定芽迅速發(fā)育，在組織塊表面形成叢生小芽。
2)以叢生芽組織塊為受體的轉(zhuǎn)化和植株再生將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有選擇劑抗性基因和ZmPIS正義基因)的根瘤農(nóng)桿菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0，熱壓滅菌)中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110rpm(轉(zhuǎn)/分)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體種子萌發(fā)培養(yǎng)基(即種子萌發(fā)培養(yǎng)基成分減半，去掉瓊脂粉)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2濃度的液體叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
取繼代后培養(yǎng)13-20天的叢生芽組織塊為轉(zhuǎn)基因受體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后材料在暗中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有頭孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧芐青霉素(Carb)500mg/l的培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)7-12天，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。恢復(fù)培養(yǎng)后或抑菌培養(yǎng)后的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有選擇劑的培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3-4代，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及小芽。在篩選培養(yǎng)中絕大數(shù)叢生芽組織塊逐漸死亡。將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無(wú)選擇劑的去掉2，4-D的A培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)后產(chǎn)生小芽。
將小芽放在成苗培養(yǎng)基上照光下生長(zhǎng)，光強(qiáng)2000-3000lx，光照14-15小時(shí)/天。小苗長(zhǎng)到3-4片葉時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天左右，約40％的小苗產(chǎn)生新根。對(duì)于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根系。生根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長(zhǎng)。植株在自然光照下生長(zhǎng)，日溫22-28℃，夜溫15-21℃，隔天澆灌1/2濃度的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分。生長(zhǎng)2周左右，移植苗產(chǎn)生發(fā)達(dá)根系，然后定植于田間。
3)轉(zhuǎn)基因植株的抗性檢測(cè)和選擇利用取移栽成活植株的葉片進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因植株。將轉(zhuǎn)基因植株套袋自交結(jié)實(shí)。取種子播種在砂盆中，用0.7％NaCl水溶液進(jìn)行連續(xù)澆灌30天，將存活小苗移栽到大田，待植株長(zhǎng)大后套袋自交結(jié)實(shí)。對(duì)其下一代繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和耐鹽性檢測(cè)，并套袋自交純合，獲得了耐鹽自交系。該自交系可用于配制玉米耐鹽雜交種。
實(shí)例2轉(zhuǎn)ZmPIS正義基因創(chuàng)造小麥優(yōu)良抗逆育種材料1.小麥無(wú)菌苗獲得小麥優(yōu)良品種的種子，用70％乙醇浸泡1-3分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分鐘，然后用無(wú)菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無(wú)菌水于黑暗條件(20-25℃)下1-2天。待種子萌動(dòng)(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長(zhǎng)止3-4厘米時(shí)，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長(zhǎng)錐。
2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因bar和ZmPIS基因)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
3.小麥無(wú)菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長(zhǎng)錐的無(wú)菌苗浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大氣壓下處理3-6分鐘。
(2)浸染后的芽尖用無(wú)菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在附加200mg/l谷氨酰胺的改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24℃。然后將無(wú)菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。
(3)將照光培養(yǎng)后的無(wú)菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長(zhǎng)，日溫22-28℃，夜溫15-21℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽。
4.轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出3片葉后，噴灑除草劑Finale(Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草劑glufosinate ammonium)水溶液，濃度為9.6ml-10.8ml Finale/L，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株在噴灑后5天后停止生長(zhǎng)，15天左右死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個(gè)體變化同對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體持續(xù)生長(zhǎng)，變化不明顯。待存活植株長(zhǎng)到7-8葉時(shí)，將其定植到田間，并促進(jìn)分蘗。
5.抗除草劑植株經(jīng)春化處理后，在起身-拔節(jié)期取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株。PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行Soudthern blotting檢測(cè)，在獲得的抗除草劑植株中，約20％左右(147/368)為轉(zhuǎn)基因個(gè)體。
6.轉(zhuǎn)基因植株子代分析通過(guò)春化階段(低溫處理?xiàng)l件因品種而異)的植株在長(zhǎng)日照下起身、拔節(jié)、開(kāi)花結(jié)實(shí)。轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子，在浸水萌動(dòng)后放冰箱(0-2℃)中進(jìn)行春化處理30-65天。部分春化處理后的種子用10.8ml Finale/L水溶液處理，觀察統(tǒng)計(jì)抗性和敏感性個(gè)體比例；另一部分春化處理后的種子播種在大田和砂盆，分別進(jìn)行干旱脅迫處理和高鹽脅迫處理，篩選耐旱和/或耐鹽轉(zhuǎn)基因植株。聽(tīng)取抗逆植株的葉片DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因，并統(tǒng)計(jì)外源基因在子代植株中的分離比例，獲得純系后用于小麥育種或直接進(jìn)入安全性實(shí)驗(yàn)和區(qū)域?qū)嶒?yàn)。
實(shí)例3、轉(zhuǎn)ZmPIS基因創(chuàng)造棉花優(yōu)良抗逆育種材料1.棉花無(wú)菌苗獲得取棉花自交系或優(yōu)良品種的種子，用濃硫酸脫去表面絨毛，用70％乙醇浸泡1分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無(wú)菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無(wú)菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下1-2天。待種子萌動(dòng)(露白)后，將其放在銨鹽減半的改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚軸伸長(zhǎng)至3-5厘米時(shí)，剝?nèi)ヒ黄尤~，露出莖端生長(zhǎng)錐。
2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化 同實(shí)例2。
3.棉花無(wú)菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液涂到用解刨針刺傷的莖尖生長(zhǎng)錐上，并用農(nóng)桿菌浸濕的棉花球覆蓋在其上，然后在黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為24-26℃。再將無(wú)菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。
(2)將照光培養(yǎng)后的無(wú)菌苗移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，讓植株在自然光照下生長(zhǎng)，日溫22-28℃，夜溫18-23℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽。
4.轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出3片葉后，噴灑8mg/l綠黃隆(沈陽(yáng)農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25％)水溶液，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株在噴灑后3天停止生長(zhǎng)，12天左右開(kāi)始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個(gè)體變化同對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體有很強(qiáng)抗性，持續(xù)生長(zhǎng)。存活植株長(zhǎng)到5葉期時(shí)，將其定植到田間。
5.抗除草劑植株的分子生物學(xué)鑒定抗除草劑植株長(zhǎng)到7-8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因。PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行Southern blotting檢測(cè)。在獲得的186株抗除草劑PCR陽(yáng)性植株中，約20％以上(42/200)的植株為轉(zhuǎn)基因個(gè)體。
6.轉(zhuǎn)基因植株子代的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花后自交或姊妹交結(jié)實(shí)。種子播種在大田或溫室，在植株4-6葉期時(shí)取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)子代植株是否帶有外源基因，并統(tǒng)計(jì)外源基因在子代分離比例，結(jié)果表明，在30％左右(12/38)的轉(zhuǎn)基因株系中，外源基因在子代植株中的分離比例符合孟德?tīng)柖伞?br> 7.轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定和利用取純合的轉(zhuǎn)基因植株的種子，播種在花盆中，植物2葉期時(shí)進(jìn)行低溫處理，通過(guò)存活率統(tǒng)計(jì)和生理指標(biāo)測(cè)定，篩選出耐冷株系，用于生產(chǎn)。進(jìn)行砂盆中，用0.7％NaCl水溶液進(jìn)行連續(xù)澆灌30天，將存活小苗移栽到大田，待植株長(zhǎng)大后套袋自交結(jié)實(shí)。對(duì)其下一代繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和耐鹽性檢測(cè)，并套袋自交純合，獲得了耐鹽自交系。該自交系可用于配制玉米耐鹽雜交種。
實(shí)例4、轉(zhuǎn)ZmPIS正義基因創(chuàng)造大豆耐冷耐旱育種材料1.大豆無(wú)菌苗獲得取優(yōu)良品種的種子，用70％乙醇浸泡2-3分鐘，用0.1％氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無(wú)菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無(wú)菌水(50-60毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下2-3天。待種子萌動(dòng)(露白)后，將其放在改良B5培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚軸長(zhǎng)至3-5厘米時(shí)，剝?nèi)ヒ黄尤~并露出莖端生長(zhǎng)錐。
2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑綠黃隆抗性基因als和ZmPIS基因)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良B5液體培養(yǎng)基(即改良B5培養(yǎng)基基本成分減半)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2改良B5液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-10倍用于轉(zhuǎn)化。
3.大豆無(wú)菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長(zhǎng)錐的無(wú)菌苗頂端浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大氣壓下處理3-6分鐘。
(2)浸染后的苗頂用無(wú)菌濾紙吸干，把小苗根端插入改良B5培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)溫度為22-24℃。
(3)將無(wú)菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，頂部覆蓋蛭石，自然光照下生長(zhǎng)，日溫23-28℃，夜溫20-25℃，隔天澆灌1/2改良B5培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽。
4.轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出3片葉后，噴灑2.0mg/l(因基因型而不同)綠黃隆(沈陽(yáng)農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25％)水溶液，以植株掉液滴為宜，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株在噴灑后4天停止生長(zhǎng)，15天左右開(kāi)始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個(gè)體的變化與對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體持續(xù)生長(zhǎng)，變化不明顯。存活植株長(zhǎng)到5葉期，將其定植到田間。
5.抗除草劑植株生長(zhǎng)到7-8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因。PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行Southern blotting檢測(cè)。在獲得的抗除草劑PCR陽(yáng)性植株中，約20％以上(26/121)的植株為轉(zhuǎn)基因個(gè)體。
6.轉(zhuǎn)基因植株后代的分子生物學(xué)鑒定和抗逆性測(cè)定及利用將轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子，播種在大田或溫室。植株(T1代)3-4葉期時(shí)取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因，并統(tǒng)計(jì)外源基因在子代植株中的分離比例。結(jié)果表明，以無(wú)菌苗莖尖分生組織為轉(zhuǎn)基因受體組織，能有效獲得轉(zhuǎn)基因植株。
將T1代植株產(chǎn)生的種子分別在15℃下萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)出苗率并計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，篩選出耐冷好的株系。將3葉期植株在10℃下24小時(shí)，檢測(cè)植株受傷害程度，選出耐冷性強(qiáng)的株系。結(jié)合萌發(fā)期和苗期測(cè)定結(jié)果，優(yōu)選出耐冷性比對(duì)照顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系用于育種。
將3葉期T2植株用不同濃度PEG溶液處理，觀測(cè)植株萎蔫時(shí)間及程度，判斷不同株系苗期耐滲透脅迫性。將T2植株播種在花盆，待植株開(kāi)花初期進(jìn)行干旱脅迫處理，收獲時(shí)測(cè)量植株地上部分生物量和子粒產(chǎn)量，挑選出比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓戤a(chǎn)量顯著提高的株系進(jìn)行大田種植和綜合性狀分析。綜合耐旱性測(cè)定的結(jié)果，選出耐旱性優(yōu)異綜合性狀好大豆育種材料。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，將從植物中克隆的PIS基因以反義或正義形式重組到植物表達(dá)載體中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和對(duì)植株進(jìn)行抗逆性鑒定，從中篩選出抗逆性明顯提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。
2.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述PIS基因來(lái)自各種植物，有cDNA形式或基因組基因形式，其編碼序列以反義形式或正義形式構(gòu)建成融合基因，并轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。
3.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述用于構(gòu)建融合基因的PIS基因的反義形式可為基因的全長(zhǎng)序列，也可以為部分序列，也可以為根據(jù)部分序列人工合成的脫氧多核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述應(yīng)用是通過(guò)轉(zhuǎn)PIS反義基因或依據(jù)PIS基因序列設(shè)計(jì)的多核苷酸序列獲得的抗逆性提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株。
5.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述應(yīng)用是通過(guò)轉(zhuǎn)PIS基因獲得對(duì)逆境抗性提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株及后代。
6.如權(quán)利要求1、4或5所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述植物抗逆性包括耐旱性、耐鹽性、耐澇性、耐冷性、耐熱性、耐輻射性、抗旱性、抗鹽性、抗輻射性、抗病性、抗蟲(chóng)性、抗除草劑特性之一或組合。
7.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述植物包括高等植物、低等植物和藻類。
8.如權(quán)利要求7所述轉(zhuǎn)PIS基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其特征是，所述植物包括各類栽培的草本作物和木本作物、牧草和雜草。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種轉(zhuǎn)PIS(磷脂酰肌醇合成酶)基因改變植物抗逆性的應(yīng)用，其方法是，將從植物中克隆的PIS基因以反義或正義形式重組到植物表達(dá)載體中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和對(duì)植株進(jìn)行抗逆性鑒定，從中篩選出抗逆性明顯提高或降低的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1769462SQ200510044789
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日
發(fā)明者張舉仁, 楊愛(ài)芳, 張可煒, 尹小燕, 谷曉峰 申請(qǐng)人:山東大學(xué)