專利名稱：：一種提高植物抗逆性的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種提高植物抗逆性的基因、重組質(zhì)粒及其在改良植物對干旱和鹽的耐受性方面的應(yīng)用
背景技術(shù)：
：環(huán)境脅迫(干旱、高鹽、低溫和高溫等)對于植物的生長發(fā)育有很大的負面影響。傳統(tǒng)育種方法培育新的植物抗逆品種周期長，見效慢。轉(zhuǎn)基因方法培育植物抗逆新品種的周期較短，同時又不影響已有的好性狀，因此逐漸成為抗逆植物品種改良的重要方法。目前通過轉(zhuǎn)基因改良植物抗逆性有兩類方法(1)過量表達轉(zhuǎn)錄因子(Jaglo-OttosenK.R.，GilmourS丄，ZarkaD丄，SchabenbergerO.,TomashowM.F.(1998)ArabidopsisCBF1verexpressioninducesCORgenesandenhancesfreezingtolerance.Sde"ce.280:104-106.KasugaM,LiuQ.，MiuraS.，Yamaguchi-ShinozakiK.,ShinozakiK.(1999)Improvingplantdrought,saltandfreezingbygenetransferofasinglestress--inducibletranscriptionfactor.Atowe17:287-291.HsiehT.H,LeeJ.T,CharngY.Y,ChanM.T.(2002)TomatoplantsectopicallyexpressingArabidopsisCBF1showenhancedresistancetowaterdeficitstress./7朋t腳W。丄130:618-626.)。(2)過量表達單個結(jié)構(gòu)基因(KumarS,DhingraA,DaniellH.(2004)Plastid-expressedbetainealdehydedehydrogenasegeneincarrotculturedcells,roots,andleavesconfersenhancedsalttolerance.PlantPhysiology136:2843-2854.ZhuJ-K.(2001)Plantsalttolerance.TrendsinPlantScience6:66-71.)。因此，開發(fā)出更多的來源不同的提高植物抗逆性的基因有著重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供一個新的提高植物抗逆性的基因、重組質(zhì)粒，所述基因的過量表達可明顯增強轉(zhuǎn)基因植物對干旱和鹽的耐受性。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明所述提高植物抗逆性的基因，命名為^^ZZW2E1/，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:l所示，所表達的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。該基因的克隆用擬南芥爿"丄Z)//2247的推導(dǎo)氨基酸序列在TIGR網(wǎng)站(www.tigr.org)的MaizeGeneIndex數(shù)據(jù)庫中用tBlastn程序進行同源序列比對搜索，獲得一條含完整開放閱讀框(ORF)的高同源(推導(dǎo)氨基酸序列的一致性為77%)的EST拼接序列(TC322649)，據(jù)此序列設(shè)計引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)從玉米中分離到Zl4ZZ)//2Z47的cDNA，如序列表中SEQIDNO:1所示。本發(fā)明所述重組質(zhì)粒，是將SEQIDNO:1所述的核苷酸序列插入到真核表達載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域己知的真核表達載體(如pHB或PBI121)。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，獲轉(zhuǎn)基因植株。試驗表明在外加有NaCl、甘露醇、脫落酸(ABA)的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植株要比野生型植株生長良好，尤其是本發(fā)明所述基因表達量最高的轉(zhuǎn)基因系，與野生型植株相比表型差異更為明顯。將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在千旱處理18天后，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株生長更好，丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量的測定數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下受損的程度低于野生型植株。因此，本發(fā)明所述所述提高植物抗逆性的基因可在植物抗干旱、抗高鹽改良中應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明為培育抗干旱、抗高鹽的植物提供了一種新的重組質(zhì)粒，有利于農(nóng)業(yè)的KI付5頭友欣勺々K艮丄百廠。2、本發(fā)明所述基因的克隆和植物轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。圖1A是Real-timePCR分析Zm^D/Z2Z4/基因在玉米植株不同組織、器官中的表達模式圖；圖1B是Real-timePCR分析在不同脅迫條件下(干旱、高鹽和脫落酸ABA)Zw^丄D/f22^基因在玉米幼苗根中的誘導(dǎo)表達模式圖。圖2是Z""￡Z)/^Z4/轉(zhuǎn)基因煙草陽性篩選植株的RT-PCR分析圖。圖3是野生型煙草以及Zw^丄Z)//2247轉(zhuǎn)基因煙草種子在含潮霉素的MS平板發(fā)芽及成苗實驗結(jié)果圖。圖4是Z^丄D/f2247轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型對照植株的抗逆性比較結(jié)果圖。圖5是Zm^ZZ)//224/轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型對照植株的抗旱性比較結(jié)果圖，圖中，A為正常生長條件，B為干旱條件。具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook,Russell的分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:提高植物抗逆性的基因的克隆1、試劑限制性內(nèi)切酶、7^DNA聚合酶、T4DNA連接酶、PrimeStar熱啟動高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆載體等購自大連寶生物工程公司；Trizol試劑購自北京天為時代科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本ToYoBo公司；質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成；其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2、大腸桿菌菌株和植物材料大腸桿菌克隆菌株為co/UM109,購自Clontech公司。玉米材料為自交系616-1，由四川省農(nóng)科院提供。3、培養(yǎng)基和溶液LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。SOB培養(yǎng)基胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaC10.58g/L，KC10.19g/L，100xMg2+10mL。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。SOC培養(yǎng)基SOB+20mM葡萄糖。TBbuffer(臨用前配置)1MKC14mL，0.45MMnCl22.4mL，0.50MCaCl20.6mL,0.50MK-MES0.5mL，ddH2012.5mL(總體積20mL)。100xMg2+溶液20.33gMgCl2.6H20和24.65gMgSO4.7H20定容于100mLH20,高壓滅菌。20y。葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于100mLH2O，過濾除菌。1MKC1溶液7.45gKC1定容于100mLH20，高壓滅菌。0.45MMnCl2溶液8.9gMnCl2.4H20定容于100mLH2O，高壓滅菌。0.50MCaCl2溶液7.35gCaCl2.2H20定容于100mLH20，高壓滅菌。0.50MK-MES溶液9.76gMES定容于100mLH20，用KOH調(diào)pH至6.3，過濾除菌，分裝成0.5mL每管，-20°<:儲存。DMSO:分裝200pl新鮮DMSO，-20°(:儲存。4、實驗方法4.1質(zhì)粒微量提取1)將帶有克隆載體pMD18-T質(zhì)粒的Eco/z'JM109接種于裝有5mlLB培養(yǎng)液(含適量抗生素)的試管中，37。C搖床培養(yǎng)1216hr，以擴增質(zhì)粒。2)取1.55ml的菌液，于室溫下10，000xg離心lmin。倒凈培養(yǎng)基，往沉淀中加入250fil的ZL-I/RNaseA混和液，漩渦振蕩使細胞完全重新懸浮。3)往重懸混和液中加入250nlZL-n，輕輕翻轉(zhuǎn)試管46次混和溶液，以獲得一澄清的裂解液。4)往上述混和液中加入350ulZL-m，并溫和地上下顛倒離心管數(shù)次，直至形成白色絮狀沉淀。于室溫下10,000xg離心10min。5)取一干凈的Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱裝在一個2ml收集試管上(已備)。小心吸出上清，并將其轉(zhuǎn)至于柱子內(nèi)，確保轉(zhuǎn)至柱內(nèi)的上清中沒有細胞雜質(zhì)沉淀。于室溫下10，000xg離心lmin，使裂解液完全流過柱子。6)棄去離心甩出液，加入50(^1的ZL緩沖液到柱子上，室溫下10，000xg離心lmin洗滌柱子，確保除去殘余的蛋白質(zhì)以得到后面操作所需的高質(zhì)量DNA。7)棄去收集液，加入720pl用無水乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子，室溫10,000xg離心10min，棄去洗滌液。8)可選做步驟重復(fù)步驟7，再用72(Hil的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子一次。9)室溫下10，000xg離心空柱lmin以甩干柱子基質(zhì)。10)把柱子置于一干凈的1.5ml小離心管上，直接加入5010(V1滅菌去離子水或TE緩沖液液到柱子基質(zhì)上(所加的量取決于預(yù)期終產(chǎn)物濃度)，10，000xg離心lmin以洗脫出DNA。4.2DNA回收方案1)處理瓊脂糖凝膠-EB電泳混和物以分別分離DNA片段。任何類型或等級的瓊脂糖都可以使用。2)當帶紋間的間距達到足夠的量的時候，在紫外燈上小心的把所需的DNA片段切下來。這樣就能保證把含DNA的凝膠盡量多的取出來3)通過把凝膠薄片裝在1.5ml小離心管中稱其重量的方法，近似地確定其體積。假設(shè)其密度為lg/ml，于是凝膠的體積便可通過如下方法得到凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml。加入體積為凝膠體積34倍的NJ緩沖液，把混和物置于55~65°C水浴中溫浴7min，或至凝膠完全融化。4)把750pl的DNA—瓊脂糖溶液加到一個Mu-PuDNA回收純化柱上，并把柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(nèi)，室溫下于10，000xg離心lmin，棄去液體。5)選做步驟用300nlNJ緩沖液來洗滌柱子，并在10，000xg下離心lmin。6)用750^1無水乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子。室溫下10，000xg離心lmin。7)棄去流出液，重復(fù)第6步一次。8)棄去液體，把空柱10，000xg離心lmin以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。9)把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入305(Hd10，000xg離心(具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度)的滅菌去離子水(或者PH8.0的TE緩沖液)到柱基質(zhì)上，10，000xg離心lmin以洗脫DNA。4.3玉米總RNA提取1)液氮迅速研磨玉米葉片組織，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5min。2)12，000rpm離心5min。3)取上清，按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。4)4。C12,000g離心15min。5)取上清，按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置10min。6)4°C12，000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。7)按lml75Q/。乙醇/mlTrizol加入75。/。乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。8)4°C8，000g離心5min，盡量棄上清。9)室溫干燥5-10min(RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。)。10)用50ulDEPC-H2O溶解RNA樣品，55-60°C,5-10min。4.4RT-PCR1)RT冰上在一個20(V1EP管中加入以下組分5xRTBufferdNTPMixture(各10mM)RNaseInhibitor(10U/pl)01igo(dT)2o(10pmo,)TotalRNAKNfase-FreeH20Rever丁raAce按以下程序進行反轉(zhuǎn)錄42。C20min(反應(yīng))99°C5min(酶變性)；4'C5min(保存)。2)PCR冰上在一個的20(HUEP管中加入以下組分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>99°C5min(酶變性)5xPrimeStarBuffer10^dNTPMixture(各2.5mM)4^ilRT產(chǎn)物1^TC306087-f31|ilTC306087-r31^ddH2032.5^PrimeStar0.5^按以下程序進行擴增98°C3miii(預(yù)變性)；98°C10s(變性)，55°C15s(復(fù)性)，72。C2.5min(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72'C5min(終延伸)。以上述PCR產(chǎn)物為模板，以巢式引物TC306087-f4和TC306087-r4進行第二輪高保真PCR，延伸時間2min，其它條件同上。引物序列如下TC306087-fi:5'-CGGCTGGATTCCTCACTTTAGT-3，；TC306087-r3:5'-GGCAGCACATTGACAGTTCCTA-3'(2180bp);TC306087陽f4:5'-AGAGCAGGTGTCGGTGTCATG-3，；TC306087-r4:5'-TGGGGAATGGGGAGGTTTAC-3，(1878bp)。4.5高保真PCR產(chǎn)物加尾以及和克隆載體pMD18-T連接在第二輪高保真PCR產(chǎn)物中加lMira《DNA聚合酶，72'C反應(yīng)15min即可。若PCR產(chǎn)物不純，則必須先回收純化目標片段，再加入適量的PCRBuffer、dNTPs和7b《DNA聚合酶進行加尾。加尾后的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T按摩爾分子數(shù)比3/1連接，反應(yīng)體系如下16'C連接過夜。4.6大腸桿菌轉(zhuǎn)化1)感受態(tài)細胞的制備a)接種大腸桿菌單菌落于2mLSOB培養(yǎng)液中，37'C過夜培養(yǎng)；b)轉(zhuǎn)接0.5mL過夜培養(yǎng)物至50mLSOB培養(yǎng)液中，18。C劇烈震蕩18~2化至A600-0.55;c)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰浴10min，4°C4000卬m離心10min;d)去上清，加16mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細胞(注意輕輕旋轉(zhuǎn)，不要用振蕩器或吹吸混勻)，冰浴10min，4°C4000rpm離心10min;e)去上清,加4mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細胞，加入280W的DMSO，輕柔混勻，冰浴10min;f)分裝于預(yù)冷得1.5mLEP管中，液氮凍存。'2)轉(zhuǎn)化a)從液氮中取出一管感受態(tài)細胞冰浴解凍；10xligaseBufferpMD18-T(50赫1)加尾的PCR產(chǎn)物(15(Vg4U)Ligase(350，)ddH201^1nl1^6^1b)將1(^1連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞輕輕混勻，冰浴30min;c)42'C熱沖擊90s，立即冰浴1-2min;d)加0.8mL的SOC，混勻，37。C溫和搖床lh。e)室溫13，000rpm離心1min，倒掉一部分上清液，留約20(^1的上清液，用槍頭將上清液與細胞混勻，涂布LB+amp(50ng/ml)平板,37'C培養(yǎng)過夜。4.7細胞快速裂解法鑒定重組載體1)挑取單個轉(zhuǎn)化子接種于50(H;1含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37'C振蕩培養(yǎng)至A,為0.60.8。2)取200pl菌液至0.5mlEP管中，13，000rpm離心1min，去上清，留約20^1上清。3)加20^12x快速裂解液，劇烈振蕩。4)13000rpm離心15min。5)取5ul上清直接電泳。與對照比，電泳帶滯后的即可能是重組載體。4.8菌落PCR鑒定重組載體經(jīng)過快速裂解法鑒定的重組載體再做菌落PCR以確定插入片段是目標片段，反應(yīng)體系如下10xPCRBuffer2^1Mg2+(1.5mM)1.2pldNTPMixture(各2.5mM)1.6pl菌液1plTC306087-f40.4plTC306087-r40.4plddH2012.4plDNA聚合酶1pl反應(yīng)條件94。C5min(預(yù)變性)；94。C40s(變性)，55。C30s(復(fù)性)，72°C2min(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72'C5min(終延伸)。對菌落PCR確定的重組載體進行測序，測序結(jié)果為序列表中SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。實施例2:Real-timePCR(實時定量PCR)分析提髙植物抗逆性的基因的表達模式1、實驗材料、試劑和儀器常規(guī)試劑和玉米材料與實施例1相同。Real-timePCR試劑盒為大連寶生物工程公司的SYBRPremixExTaqTM(PerfectRealTime),熒光定量PCR儀為百樂公司的iCycler⑧熒光定量PCR儀(Bio-RadLaboratories,USA)。2方法2.1玉米材料的處理玉米種子用自來水37'C浸泡過夜。第二天把種子放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于25°C、16h光照/8h黑暗條件下發(fā)苗，每日加水保持濾紙濕潤。10天后，即玉米苗剛長出第三片葉子時，玉米苗用不同的脅迫條件處理將玉米苗分別在250mMNaCl和100uMABA溶液中浸泡4h，脫水處理則將玉米苗置于干的濾紙上4h,對照組即將玉米苗在水中浸泡4h。處理后分別收集每種處理條件下的至少5株玉米苗的根、莖或葉，立即在液氮中速凍并放入-80'C低溫冰箱保存，直到使用。2.2RNA的提取、電泳及反轉(zhuǎn)錄分別取各種條件處理的玉米苗的根、莖、幼葉、成熟葉、花粉、花絲和幼胚提取總RNA，提取的總RNA用DNaseI處理。根據(jù)電泳結(jié)果，取大約l嗎RNA用于反轉(zhuǎn)錄，獲cDNA(具體方法見實施例1)。2.3Real-timePCR引物的設(shè)計Zff^丄Z)/Z224/基因的引物如下，預(yù)期擴增片段145bp。087RT-f:5，-CAGAAGCGTGCCATCAGAATA-3，；087RT-r:5，-AGCCTTCTACGCCAGCAAAT國3';內(nèi)參基因為玉米ac""7基因(GenBankaccessionno.J01238)，其引物如下，預(yù)期擴增片段143bp。Mac1RT墨f:5，-TTCCTAGCAGCATGAAGGTTAAA-3';Mac1RT-r:5，-CGGACCAGTTTCGTCATACTCT-3，.2.4Real-timePCR以下所有操作必須戴一次性塑料手套，以避免污染EP管外壁而影響熒光的探測。cDNA和引物最好都稀釋后再加，以盡量減少取樣誤差。每個樣品和基因重復(fù)3次。冰上在一個200pl的EP管中加入以下組分(總體積25pi):2xSYBRPremixExTaqTM12,5pll:15稀釋的cDNA6.5l:12稀釋的087RT-f/r(10pM)6pL按以下程序進行擴增(采用大連寶生物工程公司提供的Real-timePCR試劑盒SYBRPremixExTaqTM反應(yīng)條件)95。C40s;95。C5s,60°C20s(40個循環(huán))；95。C60s;55。C60s;55°C10s(每個循環(huán)增加0.5'C，80個循環(huán))。2.5Real-timePCR數(shù)據(jù)分析Real-timePCR數(shù)據(jù)用relativeexpressionsoftwaretool(REST)軟件進行分析(2-AACt法)。用REST軟件分析Real-timePCR數(shù)據(jù)的具體操作1)打開REST軟件；2)在手冊的introduction頁的粉紅色區(qū)域輸入目標基因和內(nèi)參基因(flC""7)名字；3)在PCRefficiency頁輸入內(nèi)參基因和目標基因用于做標準曲線(PCR效率)的Ct值數(shù)據(jù)以計算它們各自的PCR效率。如采用2'A"t法，基因的PCR效率近似為1，此步可省略；4)在CPinput+randomizationtest頁按提示輸入內(nèi)參基因和目標基因的Ct值數(shù)據(jù)，點擊"runPairWiseFixedreallocationRandomisationTest"鍵(紅色)，計算處理樣品與對照樣品中目標基因歸一后的表達比率、P值和標準誤差；5)在CPinput+randomizationtest頁調(diào)出表達率和P值數(shù)據(jù)，在CPvariation頁調(diào)出標準誤差數(shù)據(jù)；6)在excel軟件中做出柱狀圖(詳見excel軟件說明)即完成數(shù)據(jù)分析。3、結(jié)果Real-timePCR數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示Zm^ZD/Z2Z47在根、莖、幼葉、成熟葉、花粉、花絲和幼胚中均有表達，見圖1A。在根中，脅迫處理樣中Zm^丄D//224/的表達量相對未處理樣中的表達量均有顯著性升高。其中，250mMNaCl處理樣中Z^ZD/0247表達量為未處理樣中Zm力丄D//22^表達量的1.59倍(p<0.01);脫水處理樣中》d丄Z)//224/表達量為未處理樣中Za"ALD//2247表達量的1.32倍(p<0.05);lOO^MABA處理樣中Zm^LD//224/表達量為未處理樣中Zm^LD//2Z4/表達量的2.86倍(p<0.01)，見圖1B。實施例3:提高植物抗逆性的基因在煙草中的表達及抗逆性試驗1、材料1.1試劑與材料常規(guī)試劑與實施例l相同。用于轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌菌株為￡/￡4/05，購自Clontech公司；轉(zhuǎn)化用煙草品種為'紅花大金元，，由中國科學(xué)院成都分院生物研究所提供；植物表達載體為pHB，由上海植物生理研究所提供。1.2培養(yǎng)基與溶液YEB培養(yǎng)基酵母提取物lg/L，牛肉膏5g/L,蛋白陳5g/L，蔗糖5g/L，MgS04.7H2O0.5g/L。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。YEP培養(yǎng)基酵母提取物10g/L,蛋白陳10g/L,NaCl5g/L。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。常規(guī)用組織培養(yǎng)基-組分MS基本培養(yǎng)基(g/L)B5基本培養(yǎng)基(g/L)N6基本培養(yǎng)基(g/L)大量元素KN03NH4N03(NH4)2S04MgS04-7H20CaCl2KH2PO4NaH2P04-H201.9000001.650000n/a0.3700000.3320200.170000n/a2.500000n/a0.134000.2500000.113240n/a0.1500002.830000n/a0.4630000.1850000.1253300.400000n/a微量元素MnS04-H20H3B03ZnS04-7H20NaMo04-2H20CuS04KICoCl-6H200.0169000.0062000.0086000細2500.0000250.0008300.0000250.0030000.0020000細2500.0000250扁7500.0000250.0033300.0016000週500n/an/a0.000800n/a鐵鹽FeS04-7H20NarEDTA0.0278000.0373000.0278000.0373000.0278000.0373000有機成分肌醇甘氨酸煙酸鹽酸吡口多醇鹽酸硫胺素0.1000000.0020000.0005000.0005000.100000n/a0.001000n/a0.0020000.0005000.0005000.001000其它蔗糖瓊脂308pH;.82085085.52、方法2.1ZmALZ)好22^基因植物過量表達重組載體的構(gòu)建用于植物過量表達載體構(gòu)建的Z^iZ)/^247基因引物如下.-087-f5:CGGAAGCTTAGAGCAGGTGTCGGTGTCATG(HindIII)087-r5:TTTGGATCCTGGGGAATGGGGAGGTTTAC(BamHI)按以下程序進行擴增94。C5min(預(yù)變性)；94。C40s(變性)，58'C30s(復(fù)性)，72。C40s(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72。C5min(終延伸)。高保真PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后用HindIII和BamHI雙酶切，然后與用相同限制酶酶切的pHB載體連接(連接位點HindIII和BamHI)，獲含Zm^丄D//224/基因的過量表達重組載體，命名為pHB-087。2.2農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備1)挑取農(nóng)桿菌單菌落于2ml的YEB液體培養(yǎng)基(含Rif50嗎/ml)中，28"C振蕩培養(yǎng)過夜；2)取過夜培養(yǎng)液500W轉(zhuǎn)接于50mlYEB(含Rif50嗎/ml)液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5;3)4°C5000rpm離心5min收集菌體，加10ml0.15M的NaCl溶液懸浮菌體，冰浴10min;4)4°C5000rpm離心5min收集菌體，用1ml預(yù)冷的20mMCaCl2溶液懸浮菌體，冰浴10min;5)制備好的細胞立即使用，或分裝成20(HU/管，液氮中速凍lmin,置-7(TC保存?zhèn)溆谩?.3農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化1)取20(^1感受態(tài)細胞，冰上解凍；2)力!Uixg構(gòu)建好的pHB-087重組載體，輕彈混勻，冰浴30min;3)液氮中速凍lmin，37。C水浴5min，然后加入lmlYEB培養(yǎng)基，28。C慢速振蕩培養(yǎng)4h;4)將培養(yǎng)物涂布于含5(Hig/mlKan和50pg/mlRif的YEB平板上，28'C培養(yǎng)約48h。2.4農(nóng)桿菌陽性克隆的鑒定挑取平板上長出的單菌落，接種于含50pg/mlKan和50ng/mlRif的YEB液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)過夜，以菌液為模板進行PCR擴增鑒定。2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草2.5.1煙草無菌苗的準備將煙草成熟種子用70%酒精漂洗1min;然后浸泡于活性氯含量24%的次氯酸鈉溶液中，振蕩1520min;用無菌水洗滌45次，用滅菌濾紙吸干多余的水分，接種于MS基本培養(yǎng)基上。25'C暗培養(yǎng)5d，然后光照(16h光照/8h暗)培養(yǎng)至長出無菌苗。無菌苗可以通過組織培養(yǎng)快速繁殖并保存。2.5.2轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌菌液的制備挑取農(nóng)桿菌陽性克隆于YEB(或YEP)液體培養(yǎng)基(含50mg/LRif和50mg/LKan)，28°C、180rpm培養(yǎng)至OD60(^0.60.8。取菌液，按12%的比例，轉(zhuǎn)入新鮮的無抗生素的液體培養(yǎng)基中，加10050(HiM的AS(可加可不加)，28°C、180rpm培養(yǎng)約6h至OD600=0.20.5艮卩可用于轉(zhuǎn)《七。2.5.3轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)取煙草無菌苗，將葉片剪成約0.5cmx0.5cm大小的小塊，于上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡5mino取出煙草葉片，于無菌濾紙上吸干；轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基(含2.0mg/L6-BA和0.5mg/LIAA)，共培養(yǎng)23d。從共培養(yǎng)基上取出煙草葉片，于無菌濾紙上吸去多余的菌體，然后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基(含2.0mg/L6-BA、0.5mg/LIAA、50mg/Lhyg和200mg/LTim)，25。C光照(16h光照/8h暗)篩選分化培養(yǎng)。篩選2代，每代2周。將篩選培養(yǎng)4周后的煙草幼芽轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基(含50mg/Lhyg和100mg/LTim)進行生根培養(yǎng)。生根后的煙草植株移入花盆栽培。2.6轉(zhuǎn)基因植株的鑒定2.6.1煙草基因組DNA的提取1)將煙草葉片在研缽中用液氮研磨，每0.1g植物材料加600pL預(yù)熱至90'C的2xCTAB緩沖液。輕輕混勻，65。C放置60min。2)待混合物冷至室溫后,加等體積氯仿/異戊醇(24:1),輕輕顛倒離心管幾次混勻，室溫10000rpm離心5min。3)取上清，加0.7倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置15min沉淀DNA。4)室溫13000rpm離心10min。70%乙醇洗滌沉淀一次。5)空氣干燥510min,沉淀溶于50pl滅菌水。6)取5nl基因組DNA電泳檢測檢測質(zhì)量。2.6.2基因組DNAPCR檢測為了確定Z^ZZ)//2Z4/基因已經(jīng)整合到陽性篩選煙草植株的基因組，我們以煙草基因組DNA為模板，對ZiALD/OZ47基因全長cDNA和潮霉素基因片段進行了PCR擴增。Zw^ZD^2Z47基因特異引物為087-f5和087-r5，潮霉素基因特異引物為Hyg-f:5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3、Hyg-r:5'-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3'按以下程序進行擴增94。C5min(預(yù)變性)；94°C40s(變性)，56°C30s(復(fù)性)，72°C40s(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72。C5min(終延伸)。2.6.3RT-PCR檢領(lǐng)!l為進一步確定基因已經(jīng)整合到陽性篩選煙草植株的基因組并表達，我們以煙草葉片cDNA為模板，對》n^D股247基因進行了PCR擴增，引物為087RNAi-fl和087RNAi-rl。2.6.4潮霉素抗性實驗隨機挑取三株經(jīng)上述RT-PCR檢測確定的煙草轉(zhuǎn)基因植株(命名為Zmv4Z￡)//224/-Overexpressionl、2、3，簡稱為轉(zhuǎn)基因植株l、2、3)，將其第一代(Tl)種子和野生型煙草種子(各200顆左右)表面消毒后置于含50mg/L潮霉素的MS平板上，25°C16h光照/8h暗培養(yǎng)。記錄其發(fā)芽率和成苗率。2.7轉(zhuǎn)基因植株Zm^LD好2247基因表達量分析實驗提取煙草轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)基因植株1、轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3和野生型煙草對照植株葉片的RNA，反轉(zhuǎn)合成cDNA。以cDNA為模板，以煙草GAPDH基因(GenBankaccessionno.AJ133422)為內(nèi)參基因，用real-timeRT-PCR方法對Zm^tD//2247mRNA進行定Z"WLD/f224/基因realtimeRT-PCR引物為087RT-f和087RT-r(見實施例2);煙草GAPDH基因realtimeRT-PCR引物為(預(yù)期片段大小133bp)NgapRT-f:5，-CTCAACATTGTTTCAAATGCTAGCT-3，NgapRT-r:5，-CAGTTTTCTGTGTGGCTGTGATG-3'2.8轉(zhuǎn)基因和野生型幼苗于MS培養(yǎng)基上的抗逆性實驗將野生型煙草種子和轉(zhuǎn)基因煙草的第一代(Tl)種子表面消毒后置于含有不同濃度的NaCl(OmM、50mM、100mM和250mM)、—甘露醇(OmM、匸50mM、300mM和500mM)、脫落酸(ABA)(OnM、0.5pM、1和2|iM)的MS平板上(每皿放50顆種子)，于組培室25'C、16h光照/8h暗培養(yǎng)。每天統(tǒng)計萌芽率。待平板上轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草幼苗有足夠差異時照相，測量根長和鮮重(測10株幼苗的平均值，重復(fù)三次測量)。2.9丙二醛(maloiialdehyde，MDA)含量的測定1)取植物葉片0,2g，液氮磨碎；加2ml0.1^TCA(三氯乙酸)溶液，震蕩混勻，置于冰上。2)勻漿于4。C13,000rpm離心10min，上清液為樣品提取液。3)取上清液0.51111(對照加0.511110.1%TCA溶液)，加lml含0.5%(w/v)TBA(硫代巴比妥酸)的20WTCA溶液，混勻后于沸水浴30min。4)迅速冰浴冷卻，4'C13,000rpm離心10min。取上清液測厶532和&00。5)按以下公式計算MDA含量MDA含量(nmol/g)=155"x(As32—A60())x稀釋倍數(shù)+植物組織鮮重(g)2.10轉(zhuǎn)基因和野生型植株土壤抗旱性實驗將轉(zhuǎn)基因煙草的第一代(Tl)種子表面消毒后置于含50mg/L潮霉素的MS平板上，野生型煙草種子表面消毒后置于MS平板上。25°C16h光照/8h暗培養(yǎng)。4周后，取大小相近的幼苗移栽至土中(蛭石營養(yǎng)土普通土=1:1:1)，每兩天澆一次水，每周澆一次1/8MS培養(yǎng)液。4周后，一部分幼苗停止?jié)菜?，另一部分正常澆水以作對照，直到差異明顯，拍照，測MDA含量。3、結(jié)果3.1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定3丄1轉(zhuǎn)基因煙草陽性篩選植株RT-PCR鑒定結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中隨機挑取9株進行RT-PCR分析，結(jié)果在6株中擴出預(yù)期大小的產(chǎn)物，如圖2所示。3丄2轉(zhuǎn)基因以及野生型種子在MS平板上潮霉素抗性實驗結(jié)果在含潮霉素的MS平板上，野生型煙草以及轉(zhuǎn)基因煙草種子都能萌芽。但是，野生型煙草種子萌芽后卻不能成苗；而轉(zhuǎn)基因煙草種子不僅萌芽，且絕大部分成苗，轉(zhuǎn)基因植株l、轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3的成苗率分別為77%、80%和78%,如圖3所示。這再一次證明了轉(zhuǎn)基因植株l、轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3確實是Z^4i:Z)/^247轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。3.2轉(zhuǎn)基因和野生型煙草幼苗的抗逆性從圖4可以看出，在含NaCl(100mM)、甘露醇(300mM)、ABA(0.5pM)的MS平板上，三株煙草轉(zhuǎn)基因系的幼苗比野生型幼苗長得更好，表明轉(zhuǎn)基因系的抗逆性優(yōu)于野生型。在不同濃度NaCl的MS平板上，轉(zhuǎn)基因和野生型幼苗的鮮重、根長、MDA值見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從表中可以看出1)鮮重50mMNaCl處理后，野生型降為對照組的68.8%;轉(zhuǎn)基因植株1降為對照組的68.9%;轉(zhuǎn)基因植株2降為對照組的77.4%;轉(zhuǎn)基因植株3降為對照組的74.8%。100mMNaCl處理后，野生型降為對照組的36.8%;轉(zhuǎn)基因植株1降為對照組的38.4%;轉(zhuǎn)基因植株2降為對照組的40%;轉(zhuǎn)基因植株3降為對照組的39.9%。250mMNaCl處理后，野生型降為對照組的3.3%;轉(zhuǎn)基因植株1降為對照組的14.3%;轉(zhuǎn)基因植株2降為對照組的31.4%;轉(zhuǎn)基因植株3降為對照組的31.5%。由此可見，在50mM和100mMNaCl處理條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型幼苗的鮮重之間的區(qū)別很小。但在250mMNaCl處理條件下，轉(zhuǎn)基因幼苗的鮮重明顯高于野生型幼苗的鮮重，尤其是》n^丄i)/f22J7表達量較高的轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3。2)根長50mMNaCl處理后，野生型降為對照組的92.1%;轉(zhuǎn)基因植株1降為對照組的91.3%;轉(zhuǎn)基因植株2為對照組的96.0%;轉(zhuǎn)基因植株3降為對照組的96.0%。lOOmMNaCl處理后，野生型降為對照組的86.1%;轉(zhuǎn)基因植株1降為對照組的91.0%;轉(zhuǎn)基因植株2降為對照組的95.4%;轉(zhuǎn)基因植株3降為對照組的90.4%。250mMNaCl處理后，野生型降為對照組的2.5%;轉(zhuǎn)基因植株1降為對照組的4.3%;轉(zhuǎn)基因植株2降為對照組的7.8%;轉(zhuǎn)基因植株3降為對照組的8.5%?？梢钥吹剑诘蜐舛?50mM)NaCl處理條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型幼苗的根長之間的區(qū)別很小。但在250mMNaCl處理條件下，轉(zhuǎn)基因幼苗的根長明顯大于野生型幼苗的根長，尤其是Zm^LDF224/表達量較高的轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3。結(jié)果與鮮重測量結(jié)果類似。3)MDA含量各種濃度NaCl處理條件下，相對對照組而言，轉(zhuǎn)基因和野生型的MDA含量都升高了，但轉(zhuǎn)基因的MDA含量較野生型而言升高的值都明顯要小。50mMNaCl處理后，野生型升為對照組的169.7%;轉(zhuǎn)基因植株1升為對照組的147.8%;轉(zhuǎn)基因植株2升為對照組的115.0%;轉(zhuǎn)基因植株3升為對照組的131.9%。100mMNaCl處理后，野生型升為對照組的204.9%;轉(zhuǎn)基因植株1升為對照組的182.8%;轉(zhuǎn)基因植株2升為對照組的122.0%;轉(zhuǎn)基因植株3升為對照組的147.6%。250mMNaCl處理后，野生型升為對照組的249.1%;轉(zhuǎn)基因植株1升為對照組的225.3%;轉(zhuǎn)基因植株2升為對照組的135.6%;轉(zhuǎn)基因植株3升為對照組的166.5%。轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3在任何濃度NaCl條件下，MDA量的升高值均明顯低于野生型。轉(zhuǎn)基因植株7和野生型之間的差異并不明顯。實驗結(jié)果表明，在高濃度NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因幼苗明顯較野生型幼苗生長地更好，并且在NaCl的耐受和轉(zhuǎn)基因株系中Zw^Zi)fl2Z47的表達量有很好的相關(guān)性。3.3轉(zhuǎn)基因和野生型煙草的抗旱性實驗結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，在停止?jié)菜蟮?8天，野生型植株明顯萎焉，轉(zhuǎn)基因植株1植株表型近似野生型，但轉(zhuǎn)基因植株2和轉(zhuǎn)基因植株3植株沒有任何萎焉的跡象。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株比野生型煙草植株更耐干旱。序列表<110>四川大學(xué)<120>—種提高植物抗逆性的基因及其應(yīng)用<勝2〈170>PatentlnVersion3.2<210>1<211>1896<212>DNA<213>玉米(Zeaw，)〈220〉<221>mRNA<222>(1).....(1896)<223>提高植物抗逆性的基因<400〉1Cgg3￡lgCtt￡lgagcaggtgtcggtgtcatggccUctggtggccgctgctggtgctcgcc60gccgcatacgcgctctgtcgcctgctcctcttcctcatcccgcccaccgtcccatccatc120gacgtcgacgcctccgacgtgttggtc卿gaggscagcttcatctacataccg卿鄉(xiāng)180ggtaaatcaactcagactgacaaggtccaatgctatgaaccagcgaccatg犯atacttg240gggtacttcccagtggtgactcctgatgaggtc卿gaacatgttgcaca300gctca卿gaaagc肌cttc卿c犯aggcgccagtttcttcgaattctt360ctc肌gtatst3Cttg幼C3tcaggatctcstatgcg鄉(xiāng)tatcatctcgggacactgga42138g3Ct3tggttgatgcttccctgtgagaagattacctgg480cttttggatg3gggCg3卿gtggctg,cctg犯tacag￡itctactggg3g3tC33tg540ctgcat犯gagagc犯犯gttgagttttaccctcttggagtgatcggtgcgattgtatct600tgg犯ttatcccttccataatgtttttaatccagtgctagcagcagtattctccggtaat660gcagcagttEitaaaggtctcagaacatgcgacttggtcgggctgcttttattttcgtatt720at3caagcagctctttcagctgttggtgcacctgagaatctggtgcacataataactggt780tttgcggaaacaggccaagctcttgtatcatcagtagacatgtgggatca840cc鄉(xiāng)tgttggaaaaatgatcatgaaaagggcgtcgg卿ctctaatacctgt犯ctctg900gagcttggtggc犯agattcatttattgtgtgtgaagatgtagatttacccagtgttgtt960caagttgctactagagctgctctgcaatctagtgggc卿attgcgctggtgctg幼aga1020ttttatgttcctattctgcctttgtttcacagatagtgaa謹tctat幼gtgttgggcccccattatcaggctgggtgcaatctgtatgatt1140gagcactctgagaaacttcagaatcttgttgctgtc卿gggagctttggcaatcttggtactgtcctggtg犯tgttgatcacacaatgattataccaaC8gttCtgEltaaatatggtcttggctgtgctgttUttcttcccagttac3Ctgtggggt3gcagcaatctctttgccattcggtggtgtt犯agacagcttgcgagcttgctgccttgtgaagtctgttacagtgatcccgaagcctatccagtatcccttgcttgtggagactctgtatggctatagccttata肌gatggttaccgagcag幼ttctacgaatgcccggggggttcaggscgctgta犯cctccccattccccaggaaatgatgctctagacaaaggtgccgaaatt1200gaagatgcagttgatcaatttttcccacca1260aaaattatgcaagaagagacatttggacct1320gaagaggctatcaaacttgcaaacgactca1380ggc犯cc3gaagcgtgccatcag犯tsgcg1440aatgattttgcttc犯gttacatgtgccag1500ggattcgggagatttgctggcgtagaaggc1560gtagaagatagattgtggccatatattaga1620gtctcagagcatggatttgagttccagcag1680gtgtg卿caggttgcggtcccttgtg犯t1740gccccggcttcaaatgcgaccacgaagaaa1800ttgaatctgtttatggtaagtctgatctct1860tccaaa1896〈210〉2〈211〉593〈212〉PRT〈213〉玉米〈223〉提高植物抗逆性的多肽〈400〉2-METAlaPheTrpLeuCysArgLeulieAspValAsplieTyrlieProGinCysTyrGluTrpProLeuLeuValLeuAlaAlaMaTyrAla51015LeuLeuPheLeulieProProThrValProSer202530AlaSerAspValLeuValLysGluAspSerPhe354045ArgArgGlyLysSerThrGinThrAspLysVal505560ProAlaThrMET!LysTyr!LeuGlyTyrPhePro657075<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>ArgMaAlaLeuArgPheTyrVallieValLysThrGlyArgTyrAspLysLeuGinAsnlieAlaValArgAspGinPhePheMETLyslieMETMETLysPheSerSer丄ysTyrGlyArgAlalieArglieAsnAspPheGlyGlyVal!LysGlyLeuArgAlaLeuTipProTyrProValSerGluGinSer320HisAsp335ValLys350METGly365LeuVal380GlySer395ProPro410GinGlu425SerAsp440LeuGly455lieAla470AlaSer485AspSer500CysCys515lieArg530HisGly545SerGlyGinAsnCysAlaGlyAlaAsplieTyrSerAlaPheValSerSerlieSerValGlyProProLeuAlalieCysMETlieGluHisSerAsnAspAlaLeuAspLysGlyAlaPheGlyAsnLeuGlyGluAspAlaThrValLeuValAsnValAspHisGluThrPheGlyProlie工leProGluGluAlalieLysLeuAlaAsnCysAlaValPheSerGlyAsnGinSerGinLeuHisCysGlyValAlaSerTyrMETCysGinSerLeuProGlyPheGlyArgPheAlaGlyValLeuValLysSerValValGluAspThrVallieProLysProlieGinPheGluPheGinGinLeuLeuValAsn325Ser340Val355MET370Leu385Leu400Val415Gly430lie445Phe460His475Cys490Arg505Ser520Pro535Gin550Glu330Gin345Ser360Glu375Glu390Val405Thr420lie435Asp450Lys465Ala480Phe495Glu510Arg525Tyr540Glu555ThrLeuTyrGlyTyrSerValTrpAspArgLeuArgSerLeuVal560565570AsnLeulieLysMETValThrGluGinAsnSerAlaProAlaSer575580585AsnAlaThrThrLysLysArgArg5卯2權(quán)利要求1、一種提高植物抗逆性的基因，其特征在于它具有序列表中SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、一種提高植物抗逆性的重組質(zhì)粒，其特征在于它含有權(quán)利要求l所述基因。3、權(quán)利要求l所述基因在植物抗干旱改良中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求l所述基因在植物抗鹽改良中的應(yīng)用。全文摘要一種提高植物抗逆性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。將SEQIDNO1所述的核苷酸序列插入到載體中，獲得本發(fā)明所述重組質(zhì)粒，上述載體可選用本領(lǐng)域已知的真核表達載體。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，獲轉(zhuǎn)基因植株。試驗表明在外加有NaCl、甘露醇、ABA的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植株要比野生型植株生長更好。將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在干旱處理18天后，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株生長更好。丙二醛含量的測定數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)基因植株在逆境條件下受損的程度低于野生型植株。因此，本發(fā)明所述提高植物抗逆性的基因可在植物抗干旱、抗高鹽改良中應(yīng)用。文檔編號C12N15/82GK101338315SQ20081004575公開日2009年1月7日申請日期2008年8月8日優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日發(fā)明者劉永生,劉永勝,維唐,牛向麗,笛羅,高永峰,黃維藻申請人:四川大學(xué)