用于改善植物抗逆性的枸杞ggps1基因及該基因的重組載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因及包括該基因的重組載體,具體為枸杞中牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPS1的克隆。通過提取新鮮枸杞葉片中的總RNA,克隆枸杞中的牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPS1,得到基因完整的序列為1134bp;構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-LmGGPS1并構(gòu)建了雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-LmGGPS1,電擊法將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58細(xì)胞,用這種細(xì)胞轉(zhuǎn)化煙草,得到轉(zhuǎn)基因煙草,通過測試,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草大大提高了植物番茄紅素的含量,類胡蘿卜素的含量也有所提高。本發(fā)明可用于制備轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜植株。
【專利說明】用于改善植物抗逆性的枸杞汾?%/基因及該基因的重組載體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種枸杞chinense #i^7er)牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,(--?1)及包括該基因的重組載體,具體為枸杞中牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的克隆。
【背景技術(shù)】
[0002]牦牛兒基牦牛兒焦磷酸(GGPP)是生物界普遍存在的重要中間代謝產(chǎn)物.在植物中,GGPP參與葉綠素、類胡蘿卜素、赤霉素、質(zhì)體醌、維生素Ε、單萜和苯醌等產(chǎn)物的合成,對植物光合作用、生長發(fā)育和產(chǎn)品品質(zhì)等有重要影響。該產(chǎn)物由GGPS直接催化合成。GGPP不僅是類胡蘿卜素生物合成的最直接的前體物質(zhì),還是植物體內(nèi)赤霉素、葉綠素和質(zhì)體醌等前體物質(zhì)。GGPP的合成是類胡蘿卜素合成中的限速過程。通過一系列的酶促反應(yīng),產(chǎn)生的番茄紅素不僅賦予番茄鮮艷的色澤,而且具有重要的營養(yǎng)保健價(jià)值。醫(yī)學(xué)研究表明,血清中高含量的番茄紅素可顯著地降低各種癌癥的發(fā)病率,血液中的番茄紅素含量與前列腺癌、消化道癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、皮膚癌等多種癌癥的發(fā)生幾率呈負(fù)相關(guān),研究表明人體中高番茄紅素含量能顯著的降低前列腺癌的發(fā)生幾率。番茄紅素保護(hù)心腦血管的作用主要是通過其抗氧化作用,降低血清脂質(zhì)和低密度脂蛋白的過氧化作用,從而減少動脈硬化和冠心病的發(fā)病率,高番茄紅素的攝入能顯著的降低心腦血管疾病的發(fā)病幾率。番茄紅素還具有提高免疫力、延緩衰老等作用。
[0003]番茄紅素能夠猝 滅單線態(tài)氧、清除自由基,防止蛋白質(zhì)和DNA受到氧的破壞等作用。番茄紅素清除單線態(tài)氧的能力是目前常用抗氧化劑維生素E的10倍,β_胡蘿卜素的2倍。番茄紅素分子在所有類胡蘿卜素中含有的共軛雙鍵的數(shù)量最多,其淬滅單線態(tài)氧速率常數(shù)是維生素E的100倍,是抗氧化能力最強(qiáng)的類胡蘿卜素。番茄紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了其具有很強(qiáng)的去除活性氧和自由基的能力,是一種有效的抗氧化劑。而且類胡蘿卜素,尤其是β_胡蘿卜素能抑制、清除體內(nèi)自由基,可以延緩衰老和預(yù)防腫瘤、血栓、動脈粥樣硬化等疾病。類胡蘿卜素能增加免疫系統(tǒng)中B細(xì)胞的活力、消滅外源入侵的病原菌,能提高淋巴輔助T細(xì)胞的活力,協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,并提高其他免疫組分的活性;還能增加自然殺傷細(xì)胞的數(shù)目,以消除機(jī)體內(nèi)被感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。
[0004]在植物中,GGPS基因與其它酶共同作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。GGPS是合成二萜、四萜和多萜的關(guān)鍵酶。煙草萜類化合物與煙葉香氣密切相關(guān),它們不但作為重要的煙草香氣前體物存在于煙葉中,而且在煙氣中也發(fā)現(xiàn)了煙葉中具有的大部分類萜化合物。如二萜是葉面腺體膠質(zhì)分泌物的主要組成成分,其主要成分是西柏三烯二醇,它的降解產(chǎn)物茄酮及其衍生物是重要的香味物質(zhì);四萜化合物類胡蘿卜素是煙葉中重要的致香物前體物,其降解產(chǎn)物如大馬酮、紫羅蘭酮、巨豆三烯酮等是煙葉中重要致香成分。在我國煙葉生產(chǎn)中,增加煙葉萜類化合物含量,特別是與香氣品質(zhì)密切相關(guān)的香氣前體物質(zhì)如二萜、類胡蘿卜素等在煙葉中的積累,可增加煙葉香氣量,改善煙葉香氣品質(zhì)。因此,研究轉(zhuǎn)基因GGPS煙草具有重要意義。
[0005]植物類胡蘿卜素合成的步驟如下:3-甲基_3,5-二羥基戊酸(MVA)在酶的催化作用下合成異戊烯焦磷酸(IPP),異戊烯焦磷酸(IPP)首先在異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(IPI)的作用下生成帶有丙烯基結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP),它是異戊稀合成途徑中必需的前體物質(zhì),DMAPP和IPP經(jīng)過連續(xù)的縮合依次生成牦牛兒基焦磷酸(GPS)、法呢基焦磷酸(FPP)、牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(GGPP)。兩分子的GGPP由八氫番茄紅素合成酶(PSY)催化聚合成八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的脫氫反應(yīng)生成順式結(jié)構(gòu)的原番茄紅素(prolycopene),原番茄紅素在胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)的作用下異構(gòu)成反式結(jié)構(gòu)番茄紅素。番茄紅素隨后相應(yīng)環(huán)化酶的催化下,生成a、3 -胡蘿卜素,并進(jìn)一步生成其它類型的色素(Tanaka et al., 2008)。
[0006]隨著人類對番茄紅素和類胡蘿卜素藥用價(jià)值及醫(yī)療保健作用的不斷發(fā)現(xiàn),對番茄紅素和類胡蘿卜素的種類和產(chǎn)量的需求也將越來越大,然而,番茄紅素類胡蘿卜素很難用化學(xué)方法合成?,F(xiàn)代分子生物學(xué)研究手段的發(fā)展,使得番茄紅素和類胡蘿卜素生物合成途徑中的一系列關(guān)鍵酶的基因被陸續(xù)分離鑒定,為通過DNA重組技術(shù)和遺傳工程調(diào)控生產(chǎn)番茄紅素和類胡蘿卜素開辟了道路,特別是通過類胡蘿卜素基因工程獲得“金色水稻”和“金油菜”,極大地增強(qiáng)了人們開展植物類胡蘿卜素基因工程的信心。
[0007]萜類化合物是植物代謝物中數(shù)量最多的一類化合物,由異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元組成。在植物體的呼吸作用、光合作用,以及生長、發(fā)育、繁殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和防御中發(fā)揮著重要作用。某些萜類化合物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,還有些可被用作天然香料和香味化合物或抗腫瘤化療藥。在植物中,萜類化合物的生物合成發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中,其前體物質(zhì)是C5
結(jié)構(gòu)的異戍烯基焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate , IPP )及其同分異構(gòu)體-二甲
基烯丙基焦憐酸酯(Dimeth`ylallyl pyrophosphate ,DMAPP)。經(jīng)由甲輕戍酸(Mevalonicacid, MVA)途徑合成的IPP是合成法呢基焦憐酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP,C15)的前體物,F(xiàn)PP最終在細(xì)胞質(zhì)中合成為倍半萜、三萜以及留醇。在質(zhì)體中甲基赤蘚糖醇憐酸(methyl-erythritol-phosphate, MEP)途徑合成的IPP和DMAPP是生成猶牛兒基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate ,GPP ,C10)的前體物。GPP在單職合成酶的作用下生成單職;在物牛兒基物牛兒焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate Synthase,GGPPS)作用下生成物牛兒基物牛兒焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP, C20),進(jìn)而在酶的作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0010]本發(fā)明的目的還在于提供含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該基因的用途。
[0012]本發(fā)明提供了一種枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因如序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列構(gòu)成。
[0013]本發(fā)明提供了一種上述枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因編碼的蛋白質(zhì),如序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。[0014]本發(fā)明提供了一種上述枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因重組克隆載體 pMD19-T_LMGGPSL。
[0015]含有上述的枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的重組載體,這些重組載體包括質(zhì)粒。
[0016]所述的質(zhì)粒表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體mHGGPSl。
[0017]含有上述的枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的重組載體,這些重組載體包括質(zhì)粒。
[0018]所述的質(zhì)粒表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體pET28a_LmGGPSl。
[0019]所述的質(zhì)粒表達(dá)載體雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-LmGGPSl。
[0020]含有上述枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的完整編碼閱讀框序列的宿主細(xì)胞,如含有上述重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021]所述的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或煙草細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明提供了一種含有LmGGPSl基因的工程菌。
[0023]上述枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LibGGPSI的應(yīng)用包括該基因編碼的蛋白在植物中的應(yīng)用;用所述的重組載體,如植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞;或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與玉米、大豆、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜等細(xì)胞共培養(yǎng),得到轉(zhuǎn)基因的再生植株;或者用所述的LmGGPSl遺傳轉(zhuǎn)化獲得上述物種轉(zhuǎn)基因植株。
[0024]本發(fā)明的技術(shù)方案具體概述如下:
本發(fā)明的克隆方法由下述步驟組成:
從枸杞新鮮葉片中提取總RNA,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組Unigene序列中枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPSl的核苷酸序列設(shè)計(jì)上游引物L(fēng)mGGPSl-Fl: 5’ TAGGTGGCGGGAACGAAGAT-3’,然后利用3’ RACE方法擴(kuò)獲得3’末端序列,設(shè)計(jì)兼并引物 LmGGPSl-F2:5’ ATGAGATCTATGAAYS TTGTYGATTCATGGG 和 GGPS1-R:5’ -TCCCATAAGTTTCGGATACG-3’,PCR擴(kuò)增獲得該基因的5’末端序列,拼接上述所獲得的三致LmGGPSI基因序列,拼接的全長序列為1224bp。設(shè)計(jì)引物GGPS1_F3:5’-ATGAGATCTATGAATGTTGTTGATTC-3’ ; GGPS1-R-FULL: 5’ -CAAGATTCAAATCACAAGCCTG-3’ ;PCR 擴(kuò)增獲得 GGPSl 全長序列。
[0025]本發(fā)明構(gòu)建含有牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPSl的大腸桿菌表達(dá)載體pET28a- LmGGPSl和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300_LmGGPSl,由下述步驟組成:
O構(gòu)建含有牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的中間載體pMD19-T-LmGGPSl。
[0026]以GGPS1-F3/GGPS1-R-FULL為引物,以枸杞cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接于PMD19-T載體,獲得含有序列表中SEQ ID N0.1所示的LmGGPSl基因的中間載體 pMD19-T-LmGGPSl。
[0027]2)構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET28a- LmGGPSl
以GGPS1-F3/GGPS1-R-FULL為引物,以枸杞cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接于PMD19-T載體,并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌T0P10中,菌落PCR驗(yàn)證后,提取質(zhì)粒,用BamHI和SalI雙酶切該質(zhì)粒,將pET28a空載體用BamHI和SalI雙酶切,分別純化后進(jìn)行連接,得到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a- LmGGPSl。[0028]3)構(gòu)建植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300_LmGGPSl
以GGPS1-F3/GGPS1-R-FULL為引物,以枸杞cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接于PMD19-T載體,并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌T0P10中,菌落PCR驗(yàn)證后,提取質(zhì)粒,用BamHI和SalI雙酶切該質(zhì)粒,將pCAMBIA2300-35S_0CS空載體用BamHI和SalI雙酶切,分別純化后進(jìn)行連接,得到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-LmGGPSl。
[0029]本發(fā)明提供了一種用于改善植物抗逆性的枸杞基因及該基因的重組載體,首次從枸杞中分離出編碼牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的完整cDNA,連接到大腸桿菌表達(dá)載體上,利用外源表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證枸杞LmGGPSl基因的表達(dá)蛋白;然后連接到植物表達(dá)載體上,利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草,獲得轉(zhuǎn)基因植株,通過研究表明轉(zhuǎn)基因植株的類胡蘿
卜素含量有所提高,即本發(fā)明在增強(qiáng)植物類胡蘿卜素含量等方面具有廣泛應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明所述的枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因ZffiGGPSl可望用于制備轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜植株。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1.為 3’ RACE PCR 電泳圖。
[0032]圖2.為5 ’末端PCR產(chǎn)物的電泳圖。
[0033]圖3?為LmGGPSl全長PCR擴(kuò)增電泳圖。
[0034]圖4.為 pMD19-T_LmGGPSl 載體示意圖。
[0035]圖5.為 pET-28a_LmGGPSl 載體示意圖。
[0036]圖6.為 pCAMBIA2300_LmGGPSl 載體示意圖。
[0037]圖7.為轉(zhuǎn)基因煙草基因組PCR。
[0038]圖8.為轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、小麥、大麥、棉花基因組PCR。
[0039]圖9.為轉(zhuǎn)基因月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶蘭基因組PCR。
[0040]圖10.為轉(zhuǎn)基因楊樹、香花槐基因組PCR。
[0041]
【具體實(shí)施方式】
[0042]實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0043]實(shí)施例1
枸杞中牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPSl的克隆 GGPSl 3’末端克隆:
利用Trizol試劑,從IOOmg的新鮮的枸杞葉片中提取totalRNA,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組
的Unigene序列設(shè)計(jì)上游引物,枸杞中牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPSl的`上游引物為 LmGGPSl-Fl: 5’ TAGGTGGCGGGAACGAAGAT-3’,利用 3’ FULLRACE Core Set
Ver.2.0 (TaKaRa, Japan)試劑盒擴(kuò)增得到完整的基因序列。具體步驟:①以totalRNA為
模板,利用3’ RACE Adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成1st Strand cDNA,反應(yīng)體系如下:
MA|2ti L.
【權(quán)利要求】
1.一個(gè)枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因,其特征在于該基因?yàn)镾EQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因編碼的蛋白質(zhì),其特征在于所述的蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
3.—種重組載體,其特征在于含有權(quán)利要求1所述的枸杞牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因的全序列或部分片段。
4.一種權(quán)利要求3所述的重組載體,其特征在于它是質(zhì)粒表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-LmGGPSl。
5.一種權(quán)利要求3所述的重組載體,其特征在于它是重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-LmGGPSl。
6.一種宿主細(xì)胞,其特征在于含有權(quán)利要求1所述的牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因全序列或部分片段。
7.—種權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞,其特征在于它是農(nóng)桿菌細(xì)胞,煙草細(xì)胞。
8.—種權(quán)利要求1所述的牦牛兒基牦牛兒焦磷酸合成酶基因應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬 鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜植株。
【文檔編號】C12N15/54GK103757034SQ201310555829
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】季靜, 王罡, 賈翠翠, 田小衛(wèi), 刁進(jìn)進(jìn), 曹海燕 申請人:天津大學(xué)