一種利用多重皺紋盤鮑熒光標(biāo)記微衛(wèi)星進(jìn)行家系識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種利用多重皺紋盤鮑熒光標(biāo)記微衛(wèi) 星進(jìn)行家系識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino)是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的軟體動(dòng)物， 因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，早已成為我國重要的海水養(yǎng)殖對(duì)象之一。隨著人民生活水平的不 斷提高，皺紋盤鮑的需求量日益增大，因此各類遺傳育種技術(shù)也相繼在這個(gè)物種中開展起 來。建立優(yōu)良性狀比較穩(wěn)定的家系是當(dāng)前的主要任務(wù)之一，但由于皺紋盤鮑的生長周期較 長，養(yǎng)殖過程操作頻繁導(dǎo)致繁育和培育過程中易受外源家系的污染，因此需要對(duì)養(yǎng)殖過程 的皺紋盤鮑個(gè)體進(jìn)行親權(quán)鑒定，明確各個(gè)個(gè)體的系譜關(guān)系。
[0003] 目前，國際上普遍認(rèn)可微衛(wèi)星標(biāo)記，特別是多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系是解決該問 題的最優(yōu)方案?？上驳氖?，在長牡蠣（Taris et al.，2005)、美洲牡蠣（Wang et al.，2010)、 亞洲鱸魚（Zhu et al·，2010)、大西洋鮭魚（Olafsson et al·，2010)等海洋水產(chǎn)動(dòng)物中成 功構(gòu)建了多重微衛(wèi)星PCR體系，這些體系通過一組或少量幾組PCR反應(yīng)體系便可以高效、快 捷地進(jìn)行親權(quán)鑒定、系譜分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析等研究。
[0004] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星多重PCR體系構(gòu)建雖已見報(bào)道（聶鴻濤等，2013)，但該體系每個(gè) 組合僅有3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，且利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色，因此，效率 較低、易受主觀影響。為提高工作效率，減少主觀判斷失誤，從皺紋盤鮑遺傳圖譜18個(gè)連鎖 群上挑選合適的微衛(wèi)星標(biāo)記，給各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，構(gòu)建多重微衛(wèi)星PCR 體系，可以高通量、低成本地來進(jìn)行親權(quán)關(guān)系的鑒定。該體系的建立也將使皺紋盤鮑的親權(quán) 鑒定和系譜分析高速快捷，并對(duì)研究皺紋盤鮑遺傳學(xué)數(shù)據(jù)分析更加標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，利于 不同研究者之間的數(shù)據(jù)交流和共享。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的提供一種利用多重皺紋盤鮑熒光標(biāo)記微衛(wèi)星進(jìn)行家系識(shí)別和親權(quán)鑒 定的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0007] 以標(biāo)記熒光基團(tuán)的皺紋盤鮑微衛(wèi)星，采用多重PCR反應(yīng)，進(jìn)而高通量地用于皺紋 盤鮑不同家系的區(qū)分或者皺紋盤鮑親權(quán)鑒定。
[0008] 將熒光基團(tuán)標(biāo)記于從皺紋盤鮑遺傳圖譜的連鎖群上獲得微衛(wèi)星標(biāo)記上，構(gòu)建兩組 多重微衛(wèi)星PCR體系，得到的PCR樣品利用ABI 3730x1全自動(dòng)DNA測序儀進(jìn)行微衛(wèi)星分 型，ROX熒光分子作為內(nèi)標(biāo)，利用GeneMarker VI. 75軟件獲得微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)，并根據(jù)微 衛(wèi)星標(biāo)記的孟德爾分離定律將數(shù)據(jù)通過PAPA (Package for the Analysis of Parental Allocation)軟件，處理無效等位基因位點(diǎn)以及檢測出可能存在的分型失誤，進(jìn)而高通量地 用于皺紋盤鮑不同家系的區(qū)分或者皺紋盤鮑親權(quán)鑒定。
[0009] 所述兩組標(biāo)記熒光基團(tuán)的皺紋盤鮑微衛(wèi)星分別為：
[0010] 組合一為：
[0011] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記HD12
[0012] 正向引物（5, -3'）：FAM-TGGATCTGCTGTTTGTCAC，
[0013] 反向引物（5, -3'）：GGCTAATGTCCACTACTTTC ;
[0014] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhl57
[0015] 正向引物（5, -3'）：FAM-ATAATAAACAGCATTGGCGGACG，
[0016] 反向引物（5, -3'）：CCACCCCTACTCCTAAATATTTTGG ;
[0017] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhKM
[0018] 正向引物（5, -3,）：FAM-TGGCAATGTGGATTTTGTTGATG，
[0019] 反向引物（5, -3'）：GCTTCGATAAGCATTCTACATGGAG ;
[0020] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhO 12
[0021] 正向引物（5, -3'）：HEX-GCAATCTAACCTATTCAGCCACC，
[0022] 反向引物（5' -3'）：GAACATAAGCAACATCACCATCA ;
[0023] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記Awb039
[0024] 正向引物（5, -3'）：HEX-TCGTTGTTCAAAGATAAAGATGTGA，
[0025] 反向引物（5 ' _3 '）： CTTACGTCCAGTGTTATGCGGTCTC ;
[0026] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHd533
[0027] 正向引物（5, -3'）：HEX-TCGTATCTCAGTAGGCTGGCAT，
[0028] 反向引物（5，-3，）： TTGTTCATTCTTGATTATTATCGTG ;
[0029] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記KHdh86
[0030] 正向引物（5, -3,）：TAM-AGTTGTTGAACCTTTCTGTTG，
[0031] 反向引物（5, -3'）：GAAAACTTCACCCACTACTTG ;
[0032] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHh 139
[0033] 正向引物（5, -3,）：TAM-TTTGCTAAAGCTGCGACATCGTATC，
[0034] 反向引物（5 ' -3 '）： CTTCTGTATTTCATGGTGTCCGTGG ;
[0035] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhOOl
[0036] 正向引物（5, -3,）：TAM-GAAGCAAAACCAGATGCCAAGGAGG，
[0037] 反向引物（5 ' -3 '）： TTCAAGGTAGCAGCAACAGCAACGAC ;
[0038] 組合二為：
[0039] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhO 11
[0040] 正向引物（5, -3,）：FAM-GATCTTTAITTGGCAAACTAA，
[0041] 反向引物（5 ' -3 '）： TGAAACCTGATACTGGTAAGC ;
[0042] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記Eab630
[0043] 正向引物（5, -3'）：FAM-GTACTTGTTGTTACCTTGGCATTC，
[0044] 反向引物（5, -3,）：ACGTAGACTTACGATAGTCATAGC ;
[0045] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhl65
[0046] 正向引物（5, -3,）：FAM-CGTACCCCCTGTTGTGGTAGTAGAT，
[0047] 反向引物（5 ' -3 '）： TGTAGTGTTATACCAGTAGACGGCG ;
[0048] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhl07
[0049] 正向引物（5, -3,）：HEX-GGTCCTCTGTGGTCTGAAGCAAC，
[0050] 反向引物（5，-3，）： TCAAGCATATCATACTTTGTACTACGCAC ;
[0051] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHh036
[0052] 正向引物（5, -3'）：HEX-GCTTAGTCAGACCTGAAGGATACC，
[0053] 反向引物（5, -3'）：GTTCTACTCACTGTAAAACAATCAATG ;
[0054] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHhl93
[0055] 正向引物（5, -3,）：HEX-TAACACCTGCGTCGTCTTCGTC，
[0056] 反向引物（5 ' -3 '）： TATCACAATTATTCCACAACCTTATGT ;
[0057] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記TrOOl
[0058] 正向引物（5, -3,）：TAM-ATGTGAATGCACGTCACTATG，
[0059] 反向引物（5, -3'）：ATAACTGTCTTAGCACTAGGATTG ;
[0060] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHh 170
[0061] 正向引物（5, -3'）：TAM-GGTATCCCAAAACATTTTCTGAGCA，
[0062] 反向引物（5, -3'）：GTTAGTGACCCCAAAAGTTCATCCA ;
[0063] 皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記CHh 175
[0064] 正向引物（5, -3'）：TAM-TTTACTGGATGTGAAACAGTGACAC，
[0065] 反向引物（5, -3'）：ATTGACTAGGAAGATGAGAAGCTGA。
[0066] 所述多重 PCR 反應(yīng)條件為 Platinum? Taq DNA Master Mix (ABI) 7. 5ul, Primer Mix lul，GC Enchaner I. 5ul，模板 DNA(40_80ng/ul)lul，雙蒸水補(bǔ)齊至 15ul。PCR 反應(yīng)條 件為94°C變性4min，然后進(jìn)行13個(gè)循環(huán)（94°C變性30s ;退火溫度從59°C降至53°C，每I 個(gè)循環(huán)退火溫度降低0. 5°C，退火時(shí)間為45s ;72°C延伸45s)，緊接著進(jìn)行22個(gè)循環(huán)（94°C 變性30s ;53°C退火45s ;72°C延伸45s)，最后，72°C延伸10min，4°C保存。
[0067] 其具體步驟如下：
[0068] (1)提取皺紋盤鮑雙親與子代個(gè)體的基因組DNA ;
[0069] (2)根據(jù)皺紋盤鮑遺傳連鎖圖譜18個(gè)連鎖群中微衛(wèi)星標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物長度、反應(yīng) 溫度等特點(diǎn)，挑選出18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，標(biāo)記三種熒光基團(tuán)（分別為FAM、HEX和ΤΑΜ)。
[0070] (3)獲得兩組微衛(wèi)星標(biāo)記的特異性引物及標(biāo)記熒光基團(tuán)。
[0071] (4)優(yōu)化皺紋盤鮑微衛(wèi)星多重PCR反應(yīng)條件。
[0072] (5)PCR產(chǎn)物利用ABI 3730x1全自動(dòng)DNA測序儀進(jìn)行微衛(wèi)星分型，ROX熒光分子作 為內(nèi)標(biāo)。利用GeneMarker VI. 75軟件對(duì)微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取。
[0073] (6)根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記的孟德爾分離定律，把數(shù)據(jù)輸入到EXCEL中，利用軟件中的宏 函