雙峰駝多態(tài)性引物及其篩選方法和鑒定親子關系的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方法和用 于鑒定親子關系的方法，屬于動物分子生物學技術領域。具體講，本發(fā)明設及一種從雙峰駝 轉錄組數(shù)據(jù)中挑選出18個SSR(簡單重復序列，Simple Sequence R巧eat,簡稱SSR)分子 標記，并分別合成其多態(tài)性引物，并將所述多態(tài)性引物用于雙峰駝親子關系的鑒定中。
【背景技術】
[0002] 準確、快速進行哺乳動物親子關系鑒定，對于哺乳動物親子關系審定、親緣關系保 護、真假親子辨別、親子關系的產(chǎn)權糾紛等方面均有重要作用。目前已經(jīng)利用已有的SSR 分子標記對牛、馬、羊等哺乳動物進行了親子鑒定實驗化D Schn油el等，2000, Animal Genetics, 31 (6) ;360-366;Teruaki TOZAKI 等，2001，J Vet Med Sci，63(ll) ;1191-1197; G Lu 化 art 等，1999，Animal Genetics, 30(6) ;431-438)。簡單重復序列 SSR 又叫作微衛(wèi)星 (Microsatellites)序列，是由1-6個核巧酸為重復單位組成的長達幾十個核巧酸的重復 序列。與其他分子標記相比，SSR標記具有多態(tài)信息含量豐富、W孟德爾方式遺傳、呈共顯 性、技術簡單、重復性好、特異性強等特點。
[0003] 在上世紀九十年代中后期，研究者們已從美洲駝中篩選出了 54個微衛(wèi)星分子標 記（Lang 等.1996 ;15 個位點；Obreque 等.1998, 1999 ;23 個位點；Penedo 等.1999a，b ; 14個位點；McPartlan等.1998 ;2個位點）。2007年J. Agopito等研究人員從W上的54 個微衛(wèi)星位點中挑選了 10 個位點（LCA19、LCA37、YWLL40、YWLL29、YWLL36、LCA5、LCA66、 YWLL08、LCA08、YWLL44)用于羊駝的親子鑒定中；2010年P. B. S. Spencer等研究人員挑選 了 17 (V0LP03、V0LP10、V0LP32、V0LP67、LCA37、LCA56、LCA65、LCA66、LCA70、LCA77、CMS16、 CMS50、YWLL08、YWLL38、YWLL44、CV化01、CV化07)個位點用于單峰駝的親子鑒定中。2003 年，D. evdotchenko等從一峰雄性雙峰駝的基因組中篩選出了 32個微衛(wèi)星分子標記，其中 14個位點有詳細說明。本發(fā)明從一峰雄性野生雙峰駝的公開的轉錄數(shù)據(jù)中篩選SSR分子標 記，并檢驗該些位點在親子鑒定中的應用，在雙峰駝親緣關系的審定和辨別、親緣關系的保 護、產(chǎn)權糾紛等領域具有廣闊的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對目前對雙峰駝親子關系鑒定方法只能用傳統(tǒng)的方法記錄，工作量大且易丟失 等一系列問題，本發(fā)明提供了一種雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方 法，和所述多態(tài)性引物用于鑒定親子關系的方法。
[0005] 一方面，本發(fā)明提供了一種雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物， 包括；XM_006194104_5177-5222 正、反向引 物，XM_006191380_10：M-1055 正、反向 引物，XM_006186221_4890-4933 正、反向引物，XM_006185105_1253-1274 正、反向 引 物，XM_006184182_1654-1697 正、反向引 物，XM_006183662_2012-2041 正、反向 引物，XM_006182535_1080-1115 正、反向引物，XM_006182052_4595-4622 正、反向 引物，XM_006180554_882-917 正、反向引物，XM_006177721_2115-2144 正、反向引 物，XM_006177716_989-1008 正、反向引物，XM_006173968_3405-3428 正、反向引物， XM_006173207_3661-3682 正、反向引物，XM_006172972_1548-1587 正、反向引物。
[0006] 上述14對多態(tài)性引物的具體信息如下；
[0007] 表 1 [000引
【主權項】
1. 一種雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物，包括： XM_006194104_5177-5222 正、反向引物，XM_006191380_1034-1055 正、反向 引物，XM_006186221_4890-4933 正、反向引物，XM_006185105_1253-1274 正、反向 弓丨物，XM_006184182_1654-1697 正、反向弓丨物，XM_006183662_2012-2041 正、反向 引物，XM_006182535_1080-1115 正、反向引物，XM_006182052_4595-4622 正、反向 引物，XM_006180554_882-917 正、反向引物，XM_006177721_2115-2144 正、反向引 物，XM_006177716_989-1008 正、反向引物，XM_006173968_3405-3428 正、反向引物， XM_006173207_3661-3682 正、反向引物，XM_006172972_1548-1587 正、反向引物。
2. 如權利要求1所述的多態(tài)性引物，其特征在于所述引物的具體信息如下（5'到3'）： XM_006194104_5177-5222 正向引物序列 F:GAAACAAGCCTTACTCAT，反向引物序列 R:AAGGTGCTATACTTCTGTGA,207-219bp ； XM_006191380_1034-1055 正向引物序列 F:GTCATCACGACGGACTGC，反向引物序列 R:CAAGGAGACGCAAGCATT，334-357bp ; XM_006186221_4890-4933 正向引物序列 F:TTCTGGGCAATGATGGGATG，反向引物序列 R:AGGAAGGAGGTTCTTTGTCT，203-243bp ; XM_006185105_1253-1274 正向引物序列 F:TGACCACCAAGGAGAAGC，反向引物序列 R:CCACGATGGCATAAGGAA，314-320bp ; XM_006184182_1654-1697 正向引物序列 F:CAATCCCGCCTGATTCCT，反向引物序列 R:CATTGAGAAGAATAGAGGTGGA，170-196bp ; XM_006183662_2012-2041 正向引物序列 F:AACGTCTGCGTGTATGGC，反向引物序列 R:CCCTAAAGTAAAGCAAACCC，237-249bp ; XM_006182535_1080-1115 正向引物序列 F:CAGATAATCAGACCAGCGTTAC，反向引物序列 R:AAGCCTTCAATAGTCTTCATC，256-296bp ; XM_006182052_4595-4622 正向引物序列 F:AGTTCAAATCAGTCGTCCTT，反向引物序列 R:TGGTAACTCCCTTTGGTA，307-315bp ; XM_006180554_882-917 正向引物序列 F:AAGCAGGTGTTTGATTTGT，反向引物序列 R:CCAGGGAGAATGGAGAATA，128-153bp ; XM_006177721_2115-2144 正向引物序列 F:TCTGTGCCACGCCCTTAC，反向引物序列 R:AAGGACACCAGGGAAACTAG，181-192bp ; XM_006177716_989-1008 正向引物序列 F:ACTGGCACAACTGGAAGC，反向引物序列 R:ATTGGTGGAAACAGAACA，251-256bp ; XM_006173968_3405-3428 正向引物序列 F:CCTGGACGGCAGTGATAG，反向引物序列 R:TAATCCCTTACTCCCTGAAAA，389-410bp ; XM_006173207_3661-3682 正向引物序列 F:ATAGAAGCATGTCGGTAG，反向引物序列 R:CCCTCTGCTGGCACTGAA，321-378bp ; XM_006172972_1548-1587 正向引物序列 F:CGCTGGGACAGCTAAGAC，反向引物序列 R:CTTTCTGGTAAAGGCAAC，170-233bp。
3. 權利要求1所述的多態(tài)性引物的篩選方法，包括： 通過雙峰駝的轉錄組序列篩選SSR位點，得到雙峰駝微衛(wèi)星分子序列，設計引物，通過 瓊脂糖凝膠電泳篩獲得粗選的雙峰駝微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物并進行熒光標記； 采用核酸提取試劑盒法（磁珠法）提取不同群體雙峰駝基因組DNA ; 將所述粗選的的多態(tài)性引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； 再將所述變性的混合液采用3730x1設備進行毛細管電泳，用GeneMapper 4. O軟件進 行分子量標準校對和微衛(wèi)星基因型分型，篩除等位基因數(shù)小于等于4或出現(xiàn)極端分布的引 物，得到權利要求1所述的雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR引物為正向引物5'端帶有熒光標記 的熒光引物，其熒光標記選自HEX-綠色、FAM-藍色或TAM-黃色；
5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增體系包括：模板基因組DNA lμL，10XTaqBuffer，10mMdNTPs，25mMMgCl2,5UTaqDNA聚合酶，10μM所述雙峰駝轉 錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物，所述PCR擴增體系的總體積為25 μ L ; 所述PCR擴增程序為： 95°C預變性3min ;95°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s，10個循環(huán)，每個循環(huán)降 溫0.5°0，最后72°0延伸61^11;95°0預變性31^11，95°0變性3〇8,58°0退火3〇8,72°0延伸 30s，20個循環(huán)，最后72°C延伸6min。
6. 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述電泳條件為：lwt%瓊脂糖凝膠、150V、 IOOmA 電泳 20min。
7. -種利用權利要求1所述的多態(tài)性引物鑒定雙峰駝親子關系的方法，包括： 利用EDTA抗凝管采集具有親子關系的雙峰駝全血樣品，然后采用核酸提取試劑盒法 (磁珠法）提取雙峰駝基因組DNA ; 將所述雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物和所述基因組DNA混合并進行PCR 擴增，得到擴增產(chǎn)物； 吸取所述擴增產(chǎn)物〇. 5-1. 0 μ L與990 μ L HIDI和10 μ L LIZ500的混合物10 μ L進行 混合，并將混合液在98°C、變性5min后置于冰水混合物上急速冷卻，得到變性的混合液； 再將所述變性的混合液采用3730x1設備進行毛細管電泳，用GeneMapper 4. 0軟件進 行分子量標準校對和微衛(wèi)星基因型分型，最后對所述結果進行雙峰駝親子關系的分析。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于所述親子關系的分析方法為：利用cervus 4. 0軟件中的Parentage Analysis程序計算每個蛇蓋與其親生母親或父親之間的LOD值。
9. 如權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述親子關系的判斷標準為：當LOD值 大于3時，假定的母駝或公駝是駝羔親生父親或母親的概率為大于95%，當LOD小于-2時， 假定的公駝或母駝與駝羔沒有親緣關系。
10. 權利要求1或2所述的雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物在雙峰駝遺傳 多樣性分析中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物設計及其篩選方法和用于鑒定雙峰駝親子關系的方法。所述的多態(tài)性引物鑒定雙峰駝親子關系的方法包括：利用EDTA抗凝管采集具有親子關系的雙峰駝全血樣品，然后采用核酸提取試劑盒法(磁珠法)提取雙峰駝基因組DNA；將所述雙峰駝轉錄組微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；將所述PCR產(chǎn)物進行3730XL型儀器毛細管電泳檢測SSR分子標記；對所述結果進行親子關系分析。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104630383
【申請?zhí)枴緾N201510114950
【發(fā)明人】吉日木圖, 明亮
【申請人】內蒙古農業(yè)大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年3月17日