山稻百靈谷2號和19號的分子特異性標(biāo)記引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及山稻百靈谷2號和百靈谷19號的分子特異性標(biāo)記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 山稻在我國具有悠久的栽培歷史，分布廣泛，尤以云南、貴州等少數(shù)民族聚居地為 多，主要采用游耕性質(zhì)的刀耕火種生產(chǎn)方式。長期的自然選擇和人工培育，形成了我國豐富 的山稻種質(zhì)資源。近年來，隨著林下經(jīng)濟的發(fā)展，建設(shè)各種規(guī)模大、效益好、帶動力強的林下 經(jīng)濟發(fā)展模式，已成為國家對發(fā)展林下經(jīng)濟所要實現(xiàn)的主要目標(biāo)。然而長期以來，中國山稻 主產(chǎn)地的山稻生產(chǎn)、銷售一直較為混亂，"異種同名、同種異名"現(xiàn)象普遍存在，特別是一些 優(yōu)良品種頻繁被假冒而出現(xiàn)在山稻種質(zhì)資源市場上，極大地損害了山稻育種者和生產(chǎn)者的 利益。因而對于山稻品種，建立一種簡便、快速、可靠的優(yōu)良品種鑒定技術(shù)尤為迫切。
[0003] 分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為發(fā)展簡便、快 速、準(zhǔn)確的菌種鑒定技術(shù)提供了有效手段。一些基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性 DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）在上個世紀(jì)90年代已用于各類物種的分類鑒定上， 但這些標(biāo)記用于山稻品種的鑒定均不夠理想。SCAR (Sequence CharacterizedAmplified Region，特征性片段擴增區(qū)域）標(biāo)記是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基礎(chǔ)上提出 的，它基于對特異RAro片段的測序，根據(jù)兩端序列設(shè)計一對18?24堿基的引物，在較高的 退火溫度下進行特異擴增實現(xiàn)的，其專一性引物的采用排除了隨機引物結(jié)合位點之間的競 爭，因而它是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供山稻百靈谷2號和百靈谷19號的分子特異性標(biāo)記引物，以及一 種能對山稻百靈谷2號和百靈谷19號進行快速鑒定的方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 山稻百靈谷2號和百靈谷19號的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下：
[0007] 上游引物：5，-AGCGGCCGCATCCTGAGAGA-3，，
[0008] 下游引物：5，-AGCGGCCGCATCCTGAGAG-3，。
[0009] 該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗獲得山稻百靈谷2號和百靈谷19號 的特異性DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物，以 該特異性引物對山稻品種進行PCR擴增，僅山稻百靈谷2號和百靈谷19號可獲得730bp的 特異性片段，其他山稻品種均不能獲得特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記 引物僅限于山稻品種的鑒定（鑒定其是否為山稻百靈谷2號或百靈谷19號之一，后續(xù)再進 行進一步鑒定），即待測樣品僅限于山稻。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標(biāo)記引物對山稻百靈谷2號和百靈谷 19號進行快速鑒定的方法，所述方法為：提取待測山稻品種葉片的基因組DNA作為模板，以 所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳 結(jié)果出現(xiàn)730bp的特異DNA條帶，則待測山稻品種為山稻百靈谷2號或百靈谷19號之一， 反之則否；所述分子特異性標(biāo)記引物序列為：
[0011] 上游引物：5，-AGCGGCCGCATCCTGAGAGA-3，，
[0012] 下游引物：5，-AGCGGCCGCATCCTGAGAG-3，。
[0013] 本發(fā)明方法關(guān)鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。
[0014] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR擴增體系組成如下：
[0015] PCR Buffer 終濃度為Ix dNTPs lmmol/L MgC^ 2.5mmol/L Taq DNA 酶 2.5U 上、下游引物 各1.25μΜ 模板 DNA 60ng 余量為ddH20;
[0016] PCR擴增條件如下：
[0017] 先 94°C 預(yù)變性 6min ;
[0018] 92°C變性 40s、60°C退火 40s、72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)；
[0019] 最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0020] PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應(yīng)體系中的濃度與 IXPCR Buffer相同，通常選用體積為反應(yīng)體系體積1/10的10XPCR Buffer。10XPCR Buffer 成分為：100mM Tris-HCl (pH 8. 5)、500mM KCl、25mM MgCljP 1.0% Triton-X-100， 溶劑為ddH20。
[0021] 具體的，所述方法如下：
[0022] (1)取待測山稻葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測山稻葉片的基因組 DNA ；
[0023] (2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴增引 物，進行PCR擴增：
[0024] PCR擴增體系每20 μ L組成如下：
[0025] IOxPCR Buffer 2μL lOmmol/L dNTPs 2pL 25mmol/L MgC^ 2μ? 5U/pLTaqDNA 酶 0.5μ? 25μΜ上、下游引物 各IpL 20ng/pL 模板 DNA 3μ；? ddH20 補足至 20μ?;
[0026] PCR擴增條件如下：
[0027] 94°C預(yù)變性6min ;92°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)；最后 于72°C補平7min，終止溫度為4°C ;
[0028] (3)取步驟（2)擴增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5 % 的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠 圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)730bp的DNA條帶，則待測山稻品種為山稻百靈谷2號 或百靈谷19號之一，反之則否。
[0029] 本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對山稻百靈谷2號或 百靈谷19號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別山稻品種所不能 替代的分子手段。 (四）
【附圖說明】
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