櫻花八重紅枝垂、咲耶姬和雨情枝垂的特異性標(biāo)記引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及櫻花品種"八重紅枝垂"、"咲耶姬"和"雨情枝垂"的分子特異性標(biāo)記 引物，以及利用該引物對櫻花品種"八重紅枝垂"、"咲耶姬"和"雨情枝垂"進(jìn)行快速鑒定的 方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 櫻花隸屬于薔薇科（Rosaceae)櫻屬（Cerasus)，是世界著名的觀賞植物。目前已 知櫻花品種有300多個，因其株型優(yōu)美、花色艷麗、整個花期延續(xù)期長，在園林上有極大的 應(yīng)用價值。近年來，我國各地大規(guī)模種植櫻花并應(yīng)用于公園、學(xué)校、街道、庭院等綠地中，成 為早春主要觀賞花木之一。北京、武漢、青島、上海等城市每年紛紛舉辦櫻花節(jié)，櫻花產(chǎn)業(yè)得 到迅猛發(fā)展，這對于建設(shè)美麗中國，促進(jìn)農(nóng)民增收，推進(jìn)山區(qū)綜合開發(fā)和建設(shè)社會主義新農(nóng) 村，都具有十分重要的意義。
[0003] 我國櫻屬植物資源豐富，分布廣泛，且櫻屬植物表型具有較強(qiáng)可塑性，種間雜交容 易，品種數(shù)量眾多，有些品種間性狀差異較小，傳統(tǒng)形態(tài)分類很難快速、準(zhǔn)確有效評價與區(qū) 分。學(xué)術(shù)界對目前種植櫻花品種的名稱和描述都很混亂，"同物異名"或"同名異物"現(xiàn)象較 為嚴(yán)重，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的名稱及科學(xué)系統(tǒng)的分類體系，不便于品種鑒定、推廣、交流及新品 種的培育，因此亟需建立一個科學(xué)合理的櫻花品種分類鑒定系統(tǒng)。
[0004] 目前就全國范圍內(nèi)的櫻花品種調(diào)查和分類還僅僅是通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征、過氧 化物酶和酯酶同工酶技術(shù)、電鏡掃描花粉粒和Q型聚類分析等方法，這些方法盡管有用，但 很難對櫻花品種進(jìn)行正確的鑒定和應(yīng)用。而近年來在植物分類界已廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo) 記技術(shù)迄今尚未在櫻花品種分類、品種間親緣關(guān)系及遺傳多樣性等研宄上得以應(yīng)用。因此， 有必要利用分子標(biāo)記技術(shù)手段，對我國現(xiàn)有的櫻花品種進(jìn)行科學(xué)鑒別，不僅有助于櫻花品 種分類鑒定系統(tǒng)的建立，也為櫻屬植物資源的進(jìn)一步研宄提供分子依據(jù)。
[0005] 目前國內(nèi)引進(jìn)大量的櫻花品種，在北京、青島、武漢、上海等各大公園內(nèi)廣泛栽植， 觀賞價值極高，其中以晚櫻品種居多，普遍具有花量大、花色艷麗、花瓣多、花期長、抗性 強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點。我們經(jīng)過長期的調(diào)查工作，發(fā)現(xiàn)20個晚櫻品種包括紅笠 （Cerasus serrulata iBenigasai)、紅華（C. serrulata iKoukai)、一葉（C. serrulata iHisakurai)、 福綠壽（C. serrulata 'Contorta'）、普賢象（C. serrulata 'Albo-rosea'）、 松月（C. serrulata 'Superba'）、郁金（C. serrulata 'Grandifora'）、紅豐 (CerasusXsieboldii iBeni - yutaka'）、御衣黃(C. serrulata 'Gioiko'）、關(guān) 山（C. serrulata 'Kanzan'）、大提燈（C. serrulata 'Ojochin'）、八重紅枝垂 (C. spachiana 'Plena Rosea'）、市原虎尾（C. serrulata 'Albo Plena'）、咲耶 姬（CerasusXyedoensis 'Sakuyahime'）、朱雀（C. serrulata 'Shujaku'）、楊貴 妃（C. serrulata 'Mollis'）、雨情枝垂（C. spachiana 'Ujou-shidare'）、菊垂 樓（C. serrulata 'Plena-pendula'）、平野妹背（C.serrulata 'Imose'）、旭山樓 (C. serrulata 'Asahiyama'）在園林中的應(yīng)用極其廣泛，但這些品種的"同名異物"、"同物 異名"現(xiàn)象也異常嚴(yán)重，從表型特征方面很難鑒別，給園林植物應(yīng)用、推廣以及新品種選育 帶來很多困難，因此著力從分子水平上開發(fā)出這些品種穩(wěn)定、特異的DNA指紋標(biāo)記才是實 現(xiàn)櫻花品種準(zhǔn)確快速鑒定的科學(xué)途徑。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供櫻花品種"八重紅枝垂"、"咲耶姬"和"雨情枝垂"的分子特異 性標(biāo)記引物，以及一種能對櫻花品種"八重紅枝垂"、"咲耶姬"和"雨情枝垂"進(jìn)行快速鑒定 的方法。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 櫻花品種"八重紅枝垂"、"咲耶姬"和"雨情枝垂"的分子特異性標(biāo)記引物，所述引 物序列如下：
[0009] 上游引物：5，-AGCGGCCGCCGCTAGATGAG-3，；
[0010] 下游引物：5，-AGCGGCCGCCGAGACAAAGA-3，。
[0011] 該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗獲得櫻花品種"八重紅枝垂"、"咲耶 姬"和"雨情枝垂"的特異性DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ) 設(shè)計特異性引物，以該特異性引物對櫻花品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅"八重紅枝垂"、"咲耶姬"和 "雨情枝垂"可獲得519bp大小的特異性片段，其他櫻花品種均不能獲得特異性片段。需要 說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物僅限于櫻花品種的鑒定（鑒定其是否為"八重紅枝 垂"、"咲耶姬"或"雨情枝垂"之一，后續(xù)再進(jìn)行進(jìn)一步鑒定），即待測樣品僅限于櫻花。
[0012] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標(biāo)記引物對櫻花品種"八重紅枝垂"、 "咲耶姬"和"雨情枝垂"進(jìn)行快速鑒定的方法，所述方法為：提取待測櫻花品種葉片的基因 組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)519bp的特異DNA條帶，則待測櫻花品種為櫻花品種"八重紅 枝垂"、"咲耶姬"或"雨情枝垂"之一，反之則否；所述分子特異性標(biāo)記引物序列為：
[0013] 上游引物：5，-AGCGGCCGCCGCTAGATGAG-3，；
[0014] 下游引物：5，-AGCGGCCGCCGAGACAAAGA-3，。
[0015] 本發(fā)明方法關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的選擇、DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。
[0016] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系組成如下：
[0017] PCR Buffer 終濃度 A lx dN TPs I mmol/L MgCh 2.5 mmol/L Taq DNA 酶 1.0 U/反應(yīng) 上、下游引物 各0.4μΜ 模板DNA 60 ng/反應(yīng) 余量為ddH20。
[0018] 所述PCR擴(kuò)增條件如下：95°C預(yù)變性3min ;95°C變性40s，68°C退火40s，72°C延伸 2min，共35個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。
[0019] PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應(yīng)體系中的濃度與 IXPCR Buffer相同，通常選用體積為反應(yīng)體系體積1/10的10XPCR Buffer。10XPCR Buffer 成分為：100mM Tris-HCl (pH 8. 5)、500mM KCl、25mM MgCljP 1.0% Triton-X-100， 溶劑為ddH20。
[0020] 具體的，所述方法如下：
[0021] (1)取待測櫻花葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測櫻花葉片的基因組 DNA ；
[0022] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)
[0023] 記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0024] PCR擴(kuò)增體系每25 μ L組成如下：
[0025] IOxPCR Buffer 2.5gL 10 mmol/L dNTPs 2.5μ? 25 mmol/L MgCL· 2.5\\L 5U4iLTaqDNA 酶 0.2pL 10 μΜ上、下游引物 各叫 20 ng/pL 模板 DNA 3μL CldH2O 補(bǔ)足至 25μ?;
[0026] PCR擴(kuò)增條件如下：
[0027] 95°C預(yù)變性3min ;95°C變性40s，68°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環(huán)；最后 于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ;
[0028] (3)取步驟（2)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5 % 的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠 圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)519bp的DNA條帶，則待測櫻花品種為"八重紅枝垂"、 "咲耶姬"或"雨情枝垂"之一，反之則否。