一種基于srap標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度 鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞麻屬于亞麻科一年生草本植物，是重要的纖維作物和油料作物。亞麻為自花授 粉作物，雄性不育系是雜優(yōu)利用的關(guān)鍵。1998年，我國發(fā)現(xiàn)了具有溫光敏特性、隱性遺傳的 核雄性不育系，利用溫敏特性和隱性遺傳特性，可以實現(xiàn)不育性的保持和恢復，并且容易配 制組合，在亞麻雜種優(yōu)勢利用上顯示了巨大的應(yīng)用價值（黨占海，張建平，佘新城.溫敏 型雄性不育亞麻的研宄[J].作物學報，2002, 28(6) :861?864)，并相繼選育成功了世界首 批胡麻雜交種隴亞雜1號，隴亞雜2號等胡麻雜交種。
[0003] 目前，鑒定亞麻雜交種純度主要依靠田間種植檢測法。雖然傳統(tǒng)的田間形態(tài)學鑒 定仍是目前最為普遍使用的品種真實性和種子純度鑒定方法，但由于其受環(huán)境和基因顯隱 性等的影響頗大，人們對其可靠性已產(chǎn)生了置疑。特別在種子貿(mào)易仲裁檢驗中，對不發(fā)芽的 種子和形態(tài)相近的材料，僅靠傳統(tǒng)鑒定的方法是很難提供可靠證據(jù)的。
[0004] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展及其在作物育種中應(yīng)用的不斷深入，科學家們提出了應(yīng)用分 子標記技術(shù)進行農(nóng)作物品種的遺傳和真實性鑒定?；贒NA基礎(chǔ)的分子標記不受環(huán)境限制 和影響、無表型效應(yīng)，具有客觀、穩(wěn)定、快速、高效等特點，因此，分子標記技術(shù)在雜交種純度 檢測中得到了快速應(yīng)用。
[0005] 近年來關(guān)于分子標記在種子純度檢測中的應(yīng)用已有很多，例如西瓜、瓠瓜、 花生等作物的運用，但是，尚未見應(yīng)用分子標記進行亞麻雜交種種子純度檢驗報道。 SRAP (Sequence一related amplified polymorphism)，相關(guān)序列擴增多態(tài)性，是一種新型 的基于PCR的標記系統(tǒng)，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros于2001年提出，SRAP的 原理是利用獨特的引物設(shè)計對〇RFs(open reading frames)進行擴增，上游引物長17 bp， 5'端的前10 bp是一段填充序列，緊接著是CCGG，它們組成核心序列及3'端3個選擇堿 基，對外顯子進行特異擴增。下游引物長18 bp，5'端的前10?11 bp是一段填充序列，緊 接著是AATT，它們組成核心序列及3'端3個選擇堿基，對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子域進行特異擴 增，因個體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP操作簡便， 使用長17-18 bp的引物以及50°C的退火溫度，保證了結(jié)果的穩(wěn)定性。通過改變SRAP引物 3'端3個選擇堿基可得到更多的引物，由于上游與下游引物可自由組配，因此用少數(shù)的引 物可進行多種組合，大大減少了合成引物的費用，同時也提高了引物的使用率。SRAP操作簡 便、擴增結(jié)果穩(wěn)定、高效、重復性好等優(yōu)點，已經(jīng)被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學、遺傳多 樣性分析和標定基因的研宄中。
[0006] 迄今為止，尚未見應(yīng)用SRAP標記成功進行亞麻雜交種種子純度檢驗的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于公開了一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方 法。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種基于SRAP標記的亞麻雜交種 種子純度鑒定的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)提取亞麻總基因組DNA ;
[0010] 2)利用SRAP引物組合M10/E3,以"隴雜1號"基因組DNA為模板進行PCR擴增， 或利用SRAP引物組合M2/E5,以"隴雜2號"基因組DNA為模板進行PCR擴增；
[0011] 3)將擴增后的DNA片段，利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測SRAP擴增產(chǎn)物；
[0012] 4)對電泳結(jié)果進行分析，將同時具有雙親特異性標記條帶的單株判定為真正的雜 交種，計算種子遺傳純度，計算方法為，通過計算供試種子樣品中雜交種數(shù)量占總樣品數(shù)量 的比例確定種子純度。
[0013] 進一步的，上述的一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法，所述 SRAP引物組合M10/E3序列為：
[0014] 正向引物 MlO :SEQ ID No. 1 ;
[0015] 反向引物 E3 :SEQ ID No. 2 ;
[0016] 所述SRAP引物組合M2/E5序列為：
[0017] 正向引物 M2 :SEQ ID No. 3 ;
[0018] 反向引物 E5 :SEQ ID No. 4。
[0019] 分別運用兩對SRAP引物以提取的隴雜1號和隴雜2號與其父母本單株基因組為 模板進行PCR擴增，應(yīng)用非變性聚丙烯凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物；只有同時具有親本特異 條帶的單株才為真正的雜交種，缺少任一親本條帶均為假雜交種；所述的鑒定隴雜1號雜 交種種子純度的SRAP引物對M10/E3 ;鑒定隴雜2號雜交種種子純度的SRAP引物對M2/E5。
[0020] 上述用于鑒定隴雜1號種子純度的SRAP引物組合M10/E3中，上游引物序列MlO : 5' -TGA GTC CAA ACC GGA AA-3'，下游引物序列 E3 :5' -GAC TGC GTA CGA ATT GAC-3'。
[0021] 上述用于鑒定隴雜2號種子純度的SRAP引物組合M2/E5中，上游引物序列： M2:5'-TGA GTC CAA ACC GGA GC-3'，下游引物序列E5:5'-GAC TGC GTA CGA ATT AAC-3'。
[0022] 進一步的，上述的一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法，所述 SRAP-PCR 反應(yīng)體系的總體積為 25 yL，體系包含 10XPCR Buffer 2 yL、25mmol/LMg2+2 yL、 2· 5 mmol/L dNTPs 3 μ L、2. 5 U Taq 酶 0· 5 μ L、30ng/ μ L 模板 DNA 2 μ L 及 25ng/ μ L 引物 各1 μ L，其余用ddH20補足；
[0023] PCR擴增程序為：94°C預變性 3 min，94°C變性45 S，34. 5°C退火20 S，72°C延伸 60 S，共5個循環(huán)；然后，再94°C變性45 S，50°C退火20 S，72°C延伸60 S，共38個循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0024] 擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，每孔上樣量定為6.0yL，電壓100 V(4V/ cm)電泳60 min，電極緩沖液為I X TBE。0. 05% EB染色，紫外凝膠呈像系統(tǒng)下觀察、照相和 分析。用IOObp DNA Marker作為分子量的標準。
[0025] 通過分析