專利名稱：一種提高雜交種種子純度鑒定效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的種子純度檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提高基于單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP/InDel )-焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)雜交種純度鑒定效率的方法，是一種基于DNA池 (DNA pooling)技術(shù)的pooling數(shù)量確定和數(shù)據(jù)分型在雜交種種子純度鑒定上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
種子純度鑒定的方法有田間試驗(yàn)形態(tài)學(xué)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記、RAPD標(biāo)記、SSR標(biāo)記等技術(shù)，但以上標(biāo)記技術(shù)在操作性、穩(wěn)定性、多態(tài)性等方面不能滿足需要。單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP)，是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，具有密度高，遺傳穩(wěn)定性好、易自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)，已成為繼SSR 標(biāo)記之后的新一代遺傳學(xué)標(biāo)記技術(shù)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于作物分子輔助育種及品種鑒定。 Jin-kee Jung 等(2010)利用 Allele Specific PCR (AS-PCR)Wconserved ortholog set II (COSII) markers中篩選出40個(gè)辣椒SNP位點(diǎn)，能區(qū)分81個(gè)商品種子中的79個(gè)，能鑒定17個(gè)甜辣椒；Wim Deleu等(2009)從甜瓜公共EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)掘SNP標(biāo)記，鑒定獲得45個(gè) SNP位點(diǎn)，豐富了甜瓜基因變異圖譜，并將SNP標(biāo)記用于甜瓜品種鑒定。焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)是應(yīng)用于DNA序列分析的新一代技術(shù)工具。 在遺傳分析中，可以提供核酸序列信息的分子檢測(cè)技術(shù)是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，其權(quán)威性比其他DNA 分析方法如Northern雜交，基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR (Taqman探針)技術(shù)更好。其原理是 在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。該技術(shù)用于測(cè)量短DNA鏈序列，是目前唯一能實(shí)時(shí)得到定量序列結(jié)果的技術(shù)，兼有PCR技術(shù)的靈敏性和測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性，具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)平臺(tái)能夠?qū)δ繕?biāo)SNP/InDel標(biāo)記進(jìn)行分型和等位基因頻率進(jìn)行分析。DNA池技術(shù)(DNA pooling)是指把多個(gè)樣本的DNA按一定比例混合在一起，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增、基因掃描、基因分型等后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析(Sham et al.，2002)，組成DNA池的樣本數(shù)量從幾個(gè)到幾千個(gè)樣本不等。DNA池技術(shù)多結(jié)合DHPLC、Sanger測(cè)序等方法用于SNP位點(diǎn)、 基因頻率分析、基因連鎖等研究。DNA池技術(shù)在不減小檢測(cè)效力的前提下提高研究效率，縮短研究周期，節(jié)省研究經(jīng)費(fèi)，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、動(dòng)物、植物等基因研究工作中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開(kāi)了一種基于DNA池技術(shù)(DNA pooling)的提高雜交種種子純度鑒定效率的方法。通過(guò)數(shù)據(jù)換算分析，獲得種子純度，提高雜交種純度鑒定效率3倍。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
一種提高雜交種種子純度鑒定效率的方法，其特征在于將3個(gè)大小均勻、飽滿的種子或其他組織樣本進(jìn)行DNA提取，用于PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序檢測(cè)SNP/InDel位點(diǎn)的等位基因頻率分析；其中基因頻率與測(cè)試樣本中純度換算數(shù)據(jù)模型的計(jì)算方法如下 SNP位點(diǎn)等位基因頻率換算=Y = -15. 427X + 111. 44，如圖1所示； InDel位點(diǎn)等位基因頻率換算Y =-15. 141Χ + 109. 33，如圖2所示； 其中Y值為等位基因頻率百分?jǐn)?shù)，X值為測(cè)試樣本中雜交種所占比重。本發(fā)明所述的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行
(1)樣本前處理如果為籽粒樣本，取3粒大小均勻、飽滿的種子，研磨至粉碎，充分混勻，取100-200mg進(jìn)行DNA提取；如果為葉片組織樣本，取3株相同部位葉片，疊加放置，使用適合大小的打孔器打取3個(gè)等大小的葉片部分，勻漿混勻，進(jìn)行DNA提取；
(2)SNP/InDel位點(diǎn)等位基因頻率測(cè)定換算針對(duì)作物SNP/InDel位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增所需引物如序列表N01-N08所示；焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，在AQ模式下獲得該SNP/InDel位點(diǎn)不同基因型的等位基因頻率；判斷出3株測(cè)試樣本中的雜交種數(shù)量，進(jìn)而換算成種子純度。本發(fā)明所述的方法中PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物依據(jù)該作物SNP/InDel位點(diǎn)使用 PSQ Assay Designsoftware 進(jìn)行設(shè)計(jì)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)供試雜交種進(jìn)行樣品前處理、SNP/InDel位點(diǎn)等位基因頻率測(cè)定換算，確定雜交種種子純度。供試雜交種前處理方法為每品種取大小均勻、飽滿種子(30株植株，取同一部位葉片)，每3顆種子一起(每3株葉片疊放一起，用打孔器打取等面積葉片)，低溫下粉碎/研磨，提取DNA樣本。DNA提取方法按市售試劑盒進(jìn)行。供試雜交種SNP/InDel位點(diǎn)等位基因頻率測(cè)定換算方法為
針對(duì)作物SNP/InDel位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸測(cè)序引物；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(擴(kuò)增所需引物如序列表N01-N08所示)和焦磷酸測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)AQ模式進(jìn)行分析，獲得測(cè)試樣本的等位基因頻率；通過(guò)數(shù)據(jù)換算數(shù)據(jù)模型計(jì)算出3個(gè)植株的純度
Y= -15. 427X + 111.44 適于SNP位點(diǎn)等位基因頻率換算
Y=-15. 141X + 109. 33 適于InDel位點(diǎn)等位基因頻率換算其中Y值為等位基因頻率百分?jǐn)?shù)，X值為測(cè)試樣本中雜交種所占比重。為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的測(cè)定方法，下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以詳細(xì)的說(shuō)明。1、原理
通過(guò)DNA池技術(shù)(DNA pooling)將3個(gè)樣本等量均勻混合，經(jīng)過(guò)DNA提取、PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序檢測(cè)SNP/InDel位點(diǎn)等位基因頻率，等位基因頻率與3個(gè)樣本中來(lái)自母本污染種子數(shù)量呈線性關(guān)系，經(jīng)數(shù)據(jù)換算，可得出3個(gè)樣本中雜交種數(shù)量。2、SNP/InDel 位點(diǎn)的選擇
適合于雜交種純度鑒定的SNP/InDel位點(diǎn)為父本、母本在該位點(diǎn)分型不同，而Fl代為父本、母本雜交分型的。例如
SNP父本為A，母本為T，雜交種Fl代為A/T
InDel父本為CC，母本為一(CC缺失)，雜交種Fl代為CC/--
本發(fā)明所述的方法中PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物依據(jù)該作物SNP/InDel位點(diǎn)使用PSQ Assay Designsoftware 進(jìn)行設(shè)計(jì)。3、供試樣品前處理
籽粒供試樣品每品種取大小均勻、飽滿種子，每3顆種子一起，低溫下粉碎/研磨，提取DNA樣本。植株供試樣品每品種選取長(zhǎng)勢(shì)平均植株，取同一部位葉片，每3株葉片疊放一起，用打孔器打取等面積葉片，低溫下粉碎/研磨，提取DNA樣本。DNA提取方法按市售試劑盒進(jìn)行。4、供試雜交種SNP/InDel位點(diǎn)等位基因頻率測(cè)定換算
針對(duì)用于作物雜交種純度鑒定的SNP/InDel位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸測(cè)序引物；經(jīng)PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)AQ模式進(jìn)行分析，獲得測(cè)試樣本的等位基因頻率；通過(guò)數(shù)據(jù)換算數(shù)據(jù)模型計(jì)算出3個(gè)植株中雜交種的數(shù)量
適于SNP位點(diǎn)等位基因頻率換算(圖1)Y = -15.427X + 111.44 ； 適于InDel位點(diǎn)等位基因頻率換算(圖2) Y =-15. 141X + 109. 33 ； 其中Y值為等位基因頻率百分?jǐn)?shù)，X值為測(cè)試樣本中雜交種所占比重。本發(fā)明公開(kāi)的一種提高雜交種種子純度鑒定效率的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果
(1)提高檢測(cè)效率原來(lái)的檢測(cè)方法是單粒單株提取DNA、PCR及焦磷酸測(cè)序，應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)，可提高效率3倍；
(2)降低檢測(cè)成本。


圖1為SNP位點(diǎn)等位基因頻率換算圖；其中Y = "15. 427X + 111. 44 ；Y值為等位基因頻率百分?jǐn)?shù)，X值為測(cè)試樣本中雜交種所占比重；
圖2為InDel位點(diǎn)等位基因頻率換算；其中Y =-15. 141X + 109. 33Y值為等位基因頻率百分?jǐn)?shù)，X值為測(cè)試樣本中雜交種所占比重。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。其中使用的生物粉碎儀購(gòu)買于RECHI， 為型號(hào)M400。實(shí)施例1
DNA pooling技術(shù)用于黃瓜雜交種種子純度快速鑒定
(1)供試黃瓜品種為雜交品種津優(yōu)38，屬于地黃瓜品種，產(chǎn)地天津。(2)用于純度鑒定的InDel位點(diǎn)為TT/一位點(diǎn)，該位點(diǎn)在津優(yōu)38親本材料分別為 TT/TT (TT插入)和一/— (TT缺失)，在雜交Fl代中為TT/—。PCR引物和焦磷酸測(cè)序引物根據(jù)位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)合成 PCR引物(F1/R1)及焦磷酸測(cè)序引物(Si)見(jiàn)下表
權(quán)利要求
1.一種提高雜交種種子純度鑒定效率的方法，其特征在于將3個(gè)大小均勻、飽滿的種子或其他組織樣本進(jìn)行DNA提取，用于PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序檢測(cè)SNP/InDel位點(diǎn)的等位基因頻率分析；其中基因頻率與測(cè)試樣本中純度換算數(shù)據(jù)模型的計(jì)算方法如下SNP位點(diǎn)等位基因頻率換算=Y = -15. 427Χ + 111. 44，如圖1所示；InDel位點(diǎn)等位基因頻率換算Y =-15. 141Χ + 109. 33，如圖2所示；其中Y值為等位基因頻率百分?jǐn)?shù)，X值為測(cè)試樣本中雜交種所占比重。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行(1)樣本前處理如果為籽粒樣本，取3粒大小均勻、飽滿的種子，研磨至粉碎，充分混勻，取100-200mg進(jìn)行DNA提??；如果為葉片組織樣本，取3株相同部位葉片，疊加放置，使用適合大小的打孔器打取3個(gè)等大小的葉片部分，勻漿混勻，進(jìn)行DNA提?。?2)SNP/InDel位點(diǎn)等位基因頻率測(cè)定換算針對(duì)作物SNP/InDel位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增所需引物如序列表N01-N08所示；焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，在AQ模式下獲得該SNP/InDel位點(diǎn)不同基因型的等位基因頻率；判斷出3株測(cè)試樣本中的雜交種數(shù)量，進(jìn)而換算成種子純度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高雜交種種子純度鑒定效率的方法，它是將3個(gè)大小均勻、飽滿的種子或其他組織樣本進(jìn)行DNA提取，用于PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序檢測(cè)SNP/InDel位點(diǎn)的等位基因頻率與測(cè)試樣本中純度換算數(shù)據(jù)模型的計(jì)算如下SNP位點(diǎn)等位基因頻率換算Y=-15.427X+111.44，如圖1所示；InDel位點(diǎn)等位基因頻率換算Y=-15.141X+109.33，如圖2所示；本發(fā)明的方法結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)和SNP/InDel技術(shù)進(jìn)行雜交種種子純度檢測(cè)，能夠提高鑒定效率3倍，有效降低檢測(cè)成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間，具有很好地市場(chǎng)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102358911SQ20111035215
公開(kāi)日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者于景會(huì), 蘭青闊, 朱珠, 王永, 程奕, 趙新, 郭永澤, 陳銳 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室