專利名稱：一種檢測作物種子純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測作物種子純度的方法，特別涉及SDS-PAGE微量蛋白電泳，結(jié)合超敏感銀染檢測作物種子純度的方法。
目前蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)具有分辨率高、多態(tài)性強(qiáng)，并且具重演性、高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，因此能鑒別生物個(gè)體之間的微小差異，故能用于種子的真?zhèn)魏图兌辱b定。蛋白質(zhì)指紋圖譜中的同工酶和貯藏蛋白如谷蛋白、醇溶蛋白，作為生化指標(biāo)檢測作物種子真?zhèn)闻c純度在我國有很多的報(bào)導(dǎo)，但同工酶由于其蛋白質(zhì)譜帶少，多態(tài)性少，已不能滿足農(nóng)業(yè)上作物種子純度檢測的需要，而貯藏蛋白如醇溶蛋白用于種子純度鑒定，1986年國際種子檢驗(yàn)協(xié)會已制定出標(biāo)準(zhǔn)程序，規(guī)定應(yīng)用pH 3.2的PAGE，并建立了小麥、大麥等禾谷類作物種子醇溶蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。美國、加拿大、法國已把這一技術(shù)運(yùn)用于種子真?zhèn)魏图兌葯z測。但在我國利用該方法檢測作物種子純度還存在困難，原因是該方法復(fù)雜、技術(shù)難度大、成本昂貴。
RAPD技術(shù)方法，這是一種分子生物學(xué)的方法，即利用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性來檢測種子純度及真假。這種方法用于某種作物真假種子的鑒定方面有積極的意義，但用于種子純度的檢測同樣存在實(shí)驗(yàn)技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求高、費(fèi)用昂貴等特點(diǎn)，所以在生產(chǎn)上推廣受到一定的限制。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用作物種子所含蛋白質(zhì)種類的不同，根據(jù)每一種作物都有各自特定的蛋白質(zhì)指紋圖譜的原理，通過分析單株幼苗間蛋白質(zhì)指紋圖譜可能存在的差異可鑒別作物種子的真?zhèn)闻c純度。具體方法是采用微量蛋白電泳和超敏感銀染技術(shù)鑒定種子純度，該方法包括作物種子處理、SDS-PAGE微量蛋白電泳、超敏感銀染、結(jié)果分析步驟。
作物種子處理是將禾本科作物或蔬菜豆類種子，用10％安替福民消毒10min，蒸餾水徹底沖洗后，在27℃下浸種24h，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，在(24±1)℃下避光培養(yǎng)2-3d，取黃化幼苗子葉、根、胚軸為實(shí)驗(yàn)材料。
蛋白質(zhì)樣品制備與SDS-PAGE微量蛋白電泳是通過分析單株幼苗間蛋白質(zhì)指紋圖譜可能存在的差異可見別作物種子的真?zhèn)闻c純度，具體是取作物種子幼苗鮮嫩組織即實(shí)驗(yàn)材料0.1g，剪碎，加1ml0.1 M/L pH7.0磷酸緩沖液，勻漿后置冷凍離心機(jī)內(nèi)5000r/min離心5min，取上清0.2ml，加等體積蛋白變性液，沸水浴中變性3min后冷卻，取10ul，進(jìn)行微量蛋白SDS-PAGE分析。濃度分離膠濃度為12.5％，濃縮膠濃度為2.5％，首先灌分離膠，待分離膠凝固后，插入塑料梳，然后再灌濃縮膠在120mA條件下電泳7h，凝膠配方如下分離膠配方蒸餾水8.3ml30％丙烯酰胺 10.0ml1.5mol/lTris 0.3ml10％SDS 0.25ml10％AP0.25mlTEMED 0.01ml濃縮膠配方蒸餾水2.54ml30％丙烯酰胺 1.0mlA液 1.25ml10％SDS 0.10mlTEMED 0.005ml10％AP0.10ml
超敏感銀染與結(jié)果分析是將凝膠置20％三氯乙酸中浸泡過夜，以除去SDS，ddH2O沖洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中搖動4h以上，棄去戊二醛，加ddH2O沖洗3次，每次10min，棄去ddH2O，備染、顯色；染液配方NaOH 0.1mmol\L 20ml濃氨水 1.4ml硝酸銀 15％4ml把4ml硝酸銀溶液慢慢滴入混合液中，邊滴加邊搖動，全部滴完后用無離子水定溶至200ml在洗凈的蛋白質(zhì)凝膠中加染液100ml，搖動染色10-30min。棄去氨銀染液，加ddH2O100ml沖洗3-5min，加顯色液100ml，不斷搖動10-30min至顯色條帶清晰為止，棄去顯色液，加ddH2O100ml沖洗3-5min；顯色液配方甲醛40％ 50ul檸檬酸1％0.5ml無離子水定溶至100ml本發(fā)明的有益效果是克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本研究中建立的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)，采取微量蛋白質(zhì)電泳和超敏感銀染方法，此法可以檢出ng級的極微量蛋白，提高了檢測方法上敏感性，因此能鑒別生物個(gè)體之間的微小差異，具有分辨率高、多態(tài)性強(qiáng)，并且具重演性、高度的個(gè)體特異性和和環(huán)境穩(wěn)定性，與以往用醇溶蛋白指紋圖譜、同工酶指紋圖譜檢測作物種子純度相比較，是一種具有簡單易行、靈敏度高、蛋白質(zhì)譜帶多、高效、快速、費(fèi)用低的作物種子純度的測定方法。在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用是很有價(jià)值的。
實(shí)施例1將黃瓜種子，用10％安替福民消毒10min，蒸餾水徹底沖洗后，在27℃下浸種24h，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，在(24±1)℃下避光培養(yǎng)2-3d，取黃化幼苗胚軸為實(shí)驗(yàn)材料。蛋白質(zhì)樣品制備與SDS-PAGE微量蛋白電泳是通過分析單株幼苗間蛋白質(zhì)指紋圖譜可能存在的差異可鑒別作物種子的真?zhèn)闻c純度，具體是取作物種子幼苗鮮嫩組織即實(shí)驗(yàn)材料0.1g，剪碎，加1ml0.1M/LpH7.0磷酸緩沖液，勻漿后置冷凍離心機(jī)內(nèi)5000r/min離心5min，取上清0.2ml，加等體積蛋白變性液，沸水浴中變性3min后，冷卻，取10ul，進(jìn)行微量蛋白SDS-PAGE分析。分離膠濃度為12.5％，濃縮膠濃度為2.5％，首先灌分離膠，待分離膠凝固后，插入塑料梳，然后再灌濃縮膠，在120mA條件下電泳7h，凝膠配方如下分離膠配方蒸餾水8.3ml30％丙烯酰胺 10.0ml1.5mol/lTris 0.3ml10％SDS 0.25ml10％AP0.25mlTEMED 0.01ml濃縮膠配方蒸餾水2.54ml30％丙烯酰胺 1.0mlA液 1.25ml10％SDS 0.10mlTEMED 0.005ml10％AP0.10ml超敏感銀染與結(jié)果分析是將凝膠置20％三氯乙酸中浸泡過夜，以除去SDS，ddH2O沖洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中搖動4h以上，棄去戊二醛，加ddH2O沖洗3次，每次10min，棄去ddH2O，備染、顯色；染液配方NaOH 0.1mmol\L20ml濃氨水 1.4ml
硝酸銀 15％ 4ml把4ml硝酸銀溶液慢慢滴入混合液中，邊滴加邊搖動，全部滴完后用無離子水定溶至200ml在洗凈的蛋白質(zhì)凝膠電泳中加染液100ml，搖動染色10-30min。棄去氨銀染液，加ddH2O100ml，沖洗3-5min，加顯色液100ml，不斷搖動10-30min至顯色條帶清晰為止，棄去顯色液，加ddH2O100ml沖洗3-5min；顯色液配方甲醛40％ 50ul檸檬酸1％ 0.5ml無離子水定溶至100ml

圖1展示了11粒黃瓜種子的全蛋白SDS-PAGE銀染圖譜，所檢測到的譜型及譜帶數(shù)完全一致，各譜帶的著色性也基本相同， 證明我們所用的黃瓜種子比較純。
實(shí)施例3將菜豆種子進(jìn)行處理，其方法同實(shí)施例1，選取菜豆胚根為實(shí)驗(yàn)材料。其它同實(shí)施例1。圖3展示了菜豆胚根的微量蛋白SDS-PAGE銀染指紋圖譜。菜豆幼苗內(nèi)蛋白質(zhì)比較豐富，胚根中含有60多條譜帶，個(gè)體間在譜帶數(shù)、譜型、譜帶著色性上完全一致，說明種子純度高。
實(shí)施例4將小麥種子進(jìn)行處理，其方法同實(shí)施例1。選取小麥葉片為實(shí)驗(yàn)材料，其它同實(shí)施例1。圖4是小麥葉片的微量蛋白SDS-PAGE銀染指紋圖譜。圖4中左面兩個(gè)泳道是硬粒小麥、右面三個(gè)泳道是普通小麥葉片的微量蛋白SDS-PAGE銀染指紋圖譜。結(jié)果檢測到的蛋白質(zhì)譜帶，硬粒小麥和普通小麥均有40條，比較清晰的有17條，如115kD、75kD、32kD、16kD，其中兩種小麥的蛋白質(zhì)圖譜在47kD、35kD出現(xiàn)不同。從總體看兩種小麥蛋白質(zhì)指紋圖譜都比較穩(wěn)定，個(gè)體間在譜帶數(shù)、譜型、譜帶著色性上完全一致，說明種子純度高。
權(quán)利要求
1.一種檢測作物種子純度的方法，其特征在于采用微量蛋白電泳和超敏感銀染技術(shù)鑒定種子純度，該方法包括作物種子處理、SDS-PAGE微量蛋白電泳、超敏感銀染，結(jié)果分析步驟。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢測作物種子純度的方法，其特征在于作物種子處理是將禾本科作物或蔬菜豆類種子，用10％安替福民消毒10min，蒸餾水徹底沖洗后，在27℃下浸種24h，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，在(24±1)℃下避光培養(yǎng)2-3d，取黃化幼苗子葉、根、胚軸為實(shí)驗(yàn)材料。
3.按照權(quán)利要求1所述的檢測作物種子純度的方法，其特征在于蛋白質(zhì)樣品制備與SDS-PAGE微量蛋白電泳是通過分析單株幼苗間蛋白質(zhì)指紋圖譜可能存在的差異可鑒別作物種子的真?zhèn)闻c純度，具體是取作物幼苗鮮嫩組織即實(shí)驗(yàn)材料0.1g，剪碎，加1ml0.1M/LpH7.0磷酸緩沖液，勻漿后置冷凍離心機(jī)內(nèi)5000r/min離心5min，取上清0.2ml，加等體積蛋白變性液，沸水浴中變性3min后，冷卻，取10ul，進(jìn)行微量蛋白SDS-PAGE分析，分離膠濃度12.5％，濃縮膠濃度2.5％，首先灌分離膠，待分離膠凝固后，插入塑料梳，然后再灌濃縮膠在，在120mA條件下電泳7h，凝膠配方如下分離膠配方蒸餾水 8.3ml30％丙烯酰胺10.0ml1.5mol/lTris0.3ml10％SDS 0.25ml10％AP 0.25mlTEMED 0.01ml濃縮膠配方蒸餾水 2.54ml30％丙烯酰胺1.0mlA液 1.25ml10％SDS 0.10mlTEMED 0.005ml10％AP 0.10ml
4.按照權(quán)利要求1所述的檢測作物種子純度的方法，其特征在于超敏感銀染與結(jié)果分析是將凝膠置20％三氯乙酸中浸泡過夜，以除去SDS，ddH2O沖洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中搖動4h以上，棄去戊二醛，加ddH2O沖洗3次，每次10min，棄去ddH2O，備染、顯色；染液配方NaOH 0.1mmol\L 20ml濃氨水 1.4ml硝酸銀 15％ 4ml把4ml硝酸銀溶液慢慢滴入混合液中，邊滴加邊搖動，全部滴完后用無離子水定溶至200ml；在洗凈的蛋白質(zhì)電泳凝膠中加染液100ml，搖動染色10-30min，棄去氨銀染液，加ddH2O100ml，沖洗3-5min，加顯色液100ml，不斷搖動10-30min至顯色條帶清晰為止，棄去顯色液，加ddH2O100ml沖洗3-5min；顯色液配方甲醛40％50ul檸檬酸1％ 0.5ml無離子水定溶至100ml。
全文摘要
一種檢測作物種子純度的方法，涉及SDS－PAGE微量蛋白電泳結(jié)合超敏感銀染檢測作物種子純度的方法。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)的田間種植檢測費(fèi)工費(fèi)時(shí)、檢測結(jié)果易受環(huán)境影響；RAPD技術(shù)方法實(shí)驗(yàn)技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求高、費(fèi)用昂貴；同工酶和貯藏蛋白質(zhì)譜帶少，方法復(fù)雜、技術(shù)難度大、成本高的問題。該方法利用作物種子所含蛋白質(zhì)種類的不同，采用微量蛋白電泳和超敏感銀染技術(shù)鑒定種子純度。該方法包括作物種子處理、SDS－PAGE微量蛋白電泳、超敏感銀染、結(jié)果分析步驟。本發(fā)明的檢測方法與現(xiàn)有方法相比，具有簡單易行、靈敏度高、蛋白質(zhì)譜帶多、高效、快速、費(fèi)用低、便于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK1430058SQ0310188
公開日2003年7月16日 申請日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月29日
發(fā)明者陳宏 , 程羅根, 王振英, 彭永康 申請人:天津師范大學(xué)