一種檢測(cè)膠孢炭疽菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)膠孢炭疽菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組合 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides)寄主繁多，有2200多種植物，引起炭疽病，給農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。膠孢炭疽菌侵染大豆植株時(shí)，大豆的莖、莢、葉及葉柄均可 受害，并且可以導(dǎo)致大豆種子品質(zhì)降低。發(fā)病植株莖桿病斑深灰色，黑色小點(diǎn)排列不規(guī)則； 莢上病斑不規(guī)則形，褐色至灰白色，上面密生呈輪紋狀排列的小黑點(diǎn)；葉部病斑褐色，產(chǎn)生 明顯凹陷，一般呈輪紋狀排列 [2]。膠孢炭疽菌分生孢子產(chǎn)生在有黏質(zhì)的分生孢子盤上，分生 孢子單細(xì)胞，長(zhǎng)橢圓形，無(wú)色，盤的四周有褐色剛毛 [3]。病原菌主要以菌絲體或分生孢子在 落葉或殘留的病組織中越冬，越冬病原菌于次年產(chǎn)生分生孢子傳播擴(kuò)散，傳播的主要途徑 是昆蟲和風(fēng)雨傳播 [4]，同時(shí)，該病菌亦可隨大豆種子調(diào)運(yùn)進(jìn)行跨區(qū)域遠(yuǎn)距離傳播。為了阻止 大豆膠孢炭疽病菌傳播范圍的不斷擴(kuò)大，使大豆膠孢炭疽病菌病得到控制，需要對(duì)其進(jìn)行 快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)。
[0003] 近年來(lái)，隨著大豆種植面積不斷擴(kuò)大，大豆炭疽病的發(fā)生呈擴(kuò)大蔓延、加重危害的 趨勢(shì)，全國(guó)各大豆產(chǎn)區(qū)均有炭疽病的發(fā)生，對(duì)大豆生產(chǎn)造成很大威脅。為了減少大豆炭疽病 傳播范圍的不斷擴(kuò)大，使大豆炭疽病得到控制，需要對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)田 間早期診斷。
[0004] 大豆炭疽病可由多種炭疽菌侵染引起，迄今中國(guó)已報(bào)道引起大豆炭疽病的炭 疽菌有膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides)、平頭炭疽菌（C. truncatum)、尖孢炭疽菌 (C.acutatum)、辣椒炭疽菌（C.capsici)、黑線炭疽菌（C.dematium)等。其中，膠孢炭疽菌 是炭疽菌屬內(nèi)最大的一個(gè)種 [5]，因此針對(duì)大豆膠孢炭疽菌的分子檢測(cè)我們進(jìn)行了一系列的 研宄。
[0005] 傳統(tǒng)病原菌的分類、鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特性、致病性測(cè)定等[6]，但炭疽菌種間甚 至種內(nèi)菌株間形態(tài)變異大，近似種之間的分類特征差異微小，造成該屬的分類較難操作。膠 孢炭疽菌作為該屬內(nèi)一個(gè)主要種和重要種，從形態(tài)特征來(lái)看，具有集合種群和復(fù)合種的特 征，種內(nèi)菌株間變異大，有多個(gè)專化型或生理小種。由于種內(nèi)菌株從形態(tài)至生理特性存在較 大的變異性，使該種在鑒定上常與一些近似種混淆，為此類病害的有效防治帶來(lái)很多困難 和問(wèn)題。同時(shí)傳統(tǒng)分類鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾 [7]， 不能在病害潛伏期和初發(fā)期做出診斷，很難對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測(cè)和有效控制。
[0006] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已逐步應(yīng)用到膠孢炭疽菌的研宄中。上 世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的普通PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)膠孢炭疽菌 [8]，但普通PCR已 屬較陳舊的技術(shù)且具若干缺陷，例如檢測(cè)耗時(shí)偏長(zhǎng)，大概6?8h ;對(duì)靶基因區(qū)段的識(shí)別位點(diǎn) 少，誤檢率偏高，檢測(cè)特異性與靈敏度偏低；檢測(cè)過(guò)程較繁瑣等，難以滿足需求。
[0007] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 的榮研株式會(huì)社的Notomi等人于2000年開發(fā)的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù) [9]，其特點(diǎn)是針 對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，在鏈置換DNA酶（Bst DNA polymerase)的作用 下，60?65°C恒溫?cái)U(kuò)增，60min左右即可觀察結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物檢 測(cè)便捷等特點(diǎn)。LAMP反應(yīng)只需進(jìn)程結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入熒光染料SYBR Green I觀察顏 色和熒光變化便可直接判斷結(jié)果，大大降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的傷害，并且增加了在田間的應(yīng) 用價(jià)值。SYBR Green I只能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位，當(dāng)SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合 的時(shí)候，會(huì)發(fā)出比原先強(qiáng)800-1000倍的熒光，在日光燈下通過(guò)肉眼即可觀察到顏色變化。 如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變?yōu)辄S綠色；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變。此外， 由于核酸是在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，因此可以在簡(jiǎn)單的水浴鍋或保溫瓶條件下完成實(shí)驗(yàn)， 不需要購(gòu)置昂貴的PCR儀，檢測(cè)成本有所降低，易于在基層部門推廣應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷 完善和發(fā)展，會(huì)在病害檢測(cè)、食品檢測(cè)、臨床疾病診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景 [1°'11]。
[0008] 靶標(biāo)基因的選擇是LAMP檢測(cè)的重要因素之一。以PCR技術(shù)檢測(cè)病原菌常用的靶 標(biāo)基因有核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed space, ITS) [12]，但由于核糖體序 列沒(méi)有足夠多的位點(diǎn)來(lái)區(qū)分所有的病原菌，因此尋找出新的檢測(cè)靶標(biāo)成為檢測(cè)的熱點(diǎn)。
[0009] GS(Glutamine Synthetase)基因編碼的谷氨酰胺合成酶是一種控制氮素代謝的 酶。GS的分子生物學(xué)研宄始于1983年，從藍(lán)細(xì)菌Anabaena (glnA)克隆到GS并完全測(cè)序分 析[13]。在生物體代謝過(guò)程中，氮素是影響生物生命活動(dòng)的重要因素之一。就生物體的生長(zhǎng) 和發(fā)育過(guò)程，無(wú)機(jī)氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機(jī)氮才能為生物體所吸收和利用。 谷氨酰胺合成酶（GS)是參與這一同化過(guò)程中的關(guān)鍵酶。GS可分為三大類：GSI分布于原核 生物，GSII主要分布于真菌生物和少量細(xì)菌，GSIII只在少量細(xì)菌中有發(fā)現(xiàn)。在膠孢炭疽菌 中控制氮素調(diào)控的為GSII。
[0010] 已知的膠孢炭疽菌分子檢測(cè)靶標(biāo)ITS不能滿足LAMP引物設(shè)計(jì)的需要，現(xiàn)有基于普 通PCR對(duì)該病原菌的分子檢測(cè)技術(shù)已較落后，且具有檢測(cè)耗時(shí)偏長(zhǎng)、對(duì)靶基因區(qū)段識(shí)別位 點(diǎn)少、誤檢率偏高、檢測(cè)特異性與靈敏度偏低、檢測(cè)過(guò)程較繁瑣等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種檢測(cè)膠孢炭疽菌的環(huán)介導(dǎo)等 溫?cái)U(kuò)增引物組合物。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供該引物組合物的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的又一目的是提供一種檢測(cè)膠孢炭疽菌的LAMP試劑盒。
[0014] 本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0015] SEQ ID NO. 1所示的膠孢炭疽菌的谷氨酰胺合成酶編碼基因序列作為檢測(cè)靶標(biāo)在 檢測(cè)膠孢炭疽菌中的應(yīng)用，優(yōu)選在LAMP檢測(cè)膠孢炭疽菌中的應(yīng)用。
[0016] -種檢測(cè)膠孢炭疽菌的LAMP引物組合物，由SEQ ID NO. 2所示的正向外引物 GS-F3，SEQ ID NO. 3所示的反向外引物GS-B3，SEQ ID NO. 4所示的正向內(nèi)引物GS-FIP，SEQ ID NO. 5所示的反向內(nèi)引物GS-BIP，SEQ ID NO. 6所示的環(huán)引物GS-LF，SEQ ID NO. 7所示 的環(huán)引物GS-LB組成。
[0017] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在檢測(cè)膠孢炭疽菌中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在制備膠孢炭疽菌檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0019] 一種用于檢測(cè)膠孢炭疽菌的LAMP試劑盒，包含本發(fā)明所述的引物組合物。
[0020] 本發(fā)明所述的LAMP試劑盒，優(yōu)選包含檢測(cè)溶液，每毫升所述的檢測(cè)溶液通過(guò)以下 方法制備得到：〇. 8μΜ正向內(nèi)引物GS-FIP、0. 8μΜ反向內(nèi)引物GS-BIP、0. 1 μ M正向外引物 GS-F3、0. 1 μΜ反向外引物GS-B3、0. 1 μΜ環(huán)引物GS-LF、0. 1 μΜ環(huán)引物GS-LB、1. 4mM dNTPs、 8mM MgS04、0. 8M 甜菜堿、0.8M Tris-HCl (pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、4% Triton X-100、8U· UL-1Bst DNA聚合酶，加入超純水制備成Iml檢測(cè)溶液。
[0021] 所述的試劑盒還含有染料S