YBR Green L·
[0022] 一種LAMP檢測膠孢炭疽菌的方法，包括取21 μ L所述的檢測溶液，加入4 μ L待檢 DNA溶液，總體積為25 μ L進行LAMP反應；反應程序為：64°C，70min ;擴增后加入0. 25 μ L 染料SYBR Green I作為反應指示劑，肉眼觀察，以SYBR Green I的顏色變化和熒光強弱做 為結(jié)果判定標準：在常光下，黃綠色表示檢測為陽性，即有膠孢炭疽菌存在，橙色表示檢測 結(jié)果為陰性，即不含有膠孢炭疽菌，或所含膠孢炭疽菌未達檢測限。
[0023] 本發(fā)明詳述：
[0024] 1、引物的設計及篩選
[0025] 新型靶標基因的選取和引物的篩選是LAMP檢測的關鍵因素。首先查找相關文獻 選取了 CHS (幾丁質(zhì)合成酶）、S0D2 (錳氧化物歧化酶）、GS (谷氨酰胺合成酶）、ITS (核糖體 基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）、EFla (翻譯延伸因子）、RPB1(RNA聚合酶II大亞基）、Tefl-a (轉(zhuǎn)錄延 伸因子）等供選擇性靶標。以靶標GS為例，在NCBI網(wǎng)站查找并下載膠孢炭疽菌及其相近 種所含的GS序列，然后使用Bioedit軟件進行序列比對，在膠孢炭疽菌的GS序列中選取一 段其特有的的序列作為目標序列（200?400bp)，用PrimeM在線設計引物，合理設置各組 引物的GC含量、發(fā)夾結(jié)構形成傾向、自身配對傾向等指標，選擇比較優(yōu)化的組合進行設計。
[0026] 通過進行通用性、特異性、靈敏度實驗篩選合適的檢測膠孢炭疽菌的引物。
[0027] 1)通用性實驗：以篩選能與所有膠孢炭疽菌反應的LAMP引物為目的。選擇膠孢 炭疽菌標準菌株，以及來自不同寄主的膠孢炭疽菌的DNA作為模板，取4 μ I DNA溶液，加入 21 μ L不同靶標設計出的LAMP引物所配制反應液進行LAMP反應，反應程序為：64°C 70min ; 擴增后加入〇. 25 μ L染料SYBR Green I作為反應指示劑，反應后觀察反應管顏色變化。常 光下，含有膠孢炭疽菌的樣品在常光下應變?yōu)辄S綠色，陰性對照在常光下為橙色。若反應結(jié) 束后能使所有含有膠孢炭疽菌的樣品變?yōu)辄S綠色，則該引物符合通用性實驗要求，可繼續(xù) 進行下一步篩選實驗；若不能使所有含有膠孢炭疽菌的樣品變?yōu)辄S綠色，則該引物不符合 實驗要求，廢棄。
[0028] 2)特異性實驗：以篩選能特異性檢測膠孢炭疽菌的LAMP引物為目的。選擇膠孢 炭疽菌標準菌株，與其相近種平頭炭疽菌和尖孢炭疽菌，以及其他不同屬的病原菌（球黑 孢、大豆疫霉病菌、玉蜀黍平臍蠕孢、立枯絲核菌、黑附球菌、菊池尾孢、鏈格孢菌、尖孢鐮刀 病菌、米曲霉、殼二孢、菜豆殼球孢、葡萄座腔菌、擬莖點種腐病菌、大豆莖褐腐病菌）的DNA 作為模板，取4 μ I DNA溶液，加入21 μ L經(jīng)1)篩選出的不同靶標設計出的LAMP引物所配 制反應液進行LAMP反應，反應程序為：64°C 70min ;擴增后加入0. 25 μ L染料SYBR Green I 作為反應指示劑，反應后觀察反應管顏色變化。若反應結(jié)束后，除膠孢炭疽菌為黃綠色，其 他樣本為橙色，則該引物符合特異性的實驗要求，可進行下一步篩選實驗；否則，該引物不 符合實驗要求，廢棄。
[0029] 3)靈敏度實驗：以篩選能高靈敏度檢測膠孢炭疽菌的引物為目的。將標準膠孢 炭疽菌菌株基因組稀釋為不同的濃度梯度，分別為：100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、 10(^8、1(^8。分別取不同濃度0嫩4^1作為模板，加入21 1^經(jīng)實驗2)篩選出的不同靶 標設計出的LAMP引物所配制檢測溶液進行LAMP反應，反應程序為：64°C 70min ;擴增后加 入0. 25 μ L染料SYBR Green I作為反應指示劑，反應后觀察反應管顏色變化，以確定不同 引物配制的反應液所達到的靈敏度，篩選出反應靈敏度最高的引物，進行最終篩選。
[0030] 4)經(jīng)過依次篩選并進行體系、時間等優(yōu)化，選擇出一組以靶標GS設計的通用性 好、特異性強、靈敏度高、能快速檢測出膠孢炭疽菌的引物，即為本發(fā)明中檢測膠孢炭疽菌 的LAMP引物組合物，見表1。
[0031] 表 1
[0032]
【主權項】
1. SEQ ID NO. 1所示的膠孢炭疽菌的谷氨酰胺合成酶編碼基因序列作為檢測靶標在檢 測膠孢炭疽菌中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于SEQ ID NO. 1所示的膠孢炭疽菌的谷氨酰 胺合成酶編碼基因序列作為檢測靶標在LAMP檢測膠孢炭疽菌中的應用。
3. -種檢測膠孢炭疽菌的LAMP引物組合物，其特征在于由SEQ ID NO. 2所示的正向外 引物65+3,5￡〇10勵.3所示的反向外引物65-83,5￡〇10勵.4所示的正向內(nèi)引物65+1卩， SEQ ID NO. 5所示的反向內(nèi)引物GS-BIP，SEQ ID NO. 6所示的環(huán)引物GS-LF，SEQ ID NO. 7 所示的環(huán)引物GS-LB組成。
4. 權利要求3所述的LAMP引物組合物在檢測膠孢炭疽菌中的應用。
5. 權利要求3所述的LAMP引物組合物在制備膠孢炭疽菌檢測試劑中的應用。
6. -種用于檢測膠孢炭疽菌的LAMP試劑盒，其特征在于包含權利要求3所述的LAMP 引物組合物。
7. 根據(jù)權利要求6所述的LAMP試劑盒，其特征在于包含檢測溶液，每毫升所述的檢 測溶液通過以下方法制備得到：〇. 8 y M正向內(nèi)引物GS-FIP、0. 8yM反向內(nèi)引物GS-BIP、 0. 1 y M正向外引物GS-F3、0. 1 y M反向外引物GS-B3、0. 1 y M環(huán)引物GS-LF、0. 1 y M環(huán)引 物65-1^、1.4禮（1階1^、811111^504、0.811甜菜堿、0.811?118.8的1'1^8-11(：1、0.411111((：1、 0? 4mM(NH4)2S04、4% Triton X-KKK8U ? y List DNA 聚合酶，加入超純水制備成 lml 檢測 溶液。
8. 根據(jù)權利要求6或7所述的LAMP試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還含有染料SYBR Green 1〇
9. 一種LAMP檢測膠孢炭疽菌的方法，其特征在于包括取21 y L權利要求7所述的檢測 溶液，加入4 y L待檢DNA溶液，總體積為25 y L進行LAMP反應；反應程序為：64°C，70min ; 擴增后加入〇? 25 y L染料SYBR Green I作為反應指示劑，肉眼觀察，以SYBR Green I的顏 色變化和熒光強弱做為結(jié)果判定標準：在常光下，黃綠色表示檢測為陽性，即有膠孢炭疽菌 存在，橙色表示檢測結(jié)果為陰性，即不含有膠孢炭疽菌，或所含膠孢炭疽菌未達檢測限。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測膠孢炭疽菌的環(huán)介導等溫擴增引物組合物及其應用。以谷氨酰胺合成酶基因為靶標基因，設計并篩選出可用于LAMP檢測膠孢炭疽菌的特異性強、靈敏度高的引物，由SEQ ID NO.2所示的正向外引物GS-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物GS-B3，SEQ ID NO.4所示的正向內(nèi)引物GS-FIP，SEQ ID NO.5所示的反向內(nèi)引物GS-BIP，SEQ ID NO.6所示的環(huán)引物GS-LF，SEQ ID NO.7所示的環(huán)引物GS-LB組成。本發(fā)明引物組合物主要用于膠孢炭疽菌的快速檢測，完成一次檢測僅需2h。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-04, C12N15-11, C12R1-645
【公開號】CN104611428
【申請?zhí)枴緾N201510030095
【發(fā)明人】鄭小波, 王帥帥, 陸辰晨, 田擎, 張海峰, 王源超
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月21日