抗櫛孔扇貝c-型凝集素重組蛋白單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體，其是由名稱為：雜交瘤細(xì)胞CfL290-1A2，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC?NO：C201391，保藏日期為：2013年06月17日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。其制備方法如下：首先，通過重組表達(dá)櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段蛋白，經(jīng)純化后作為抗原免疫Balb/c小鼠，采用細(xì)胞融合法制備雜交瘤細(xì)胞；再通過免疫學(xué)檢測篩選方法，篩選出分泌所述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞CfL290-1A2，收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)純化后得到抗櫛孔扇貝C-型凝集素蛋白單克隆抗體。本發(fā)明單抗能與櫛孔扇貝C-型凝集素發(fā)生特異性結(jié)合，可用于凝集素體外檢測。
【專利說明】抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種單克隆抗體,特別涉及一種抗柿孔扇貝/arr6?ri)C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體及其制備方法，屬于扇貝分子免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]C-型凝集素是廣泛存在于細(xì)胞表面和體液中的一類糖結(jié)合蛋白，是典型的模式識別受體之一，其特點(diǎn)是具有大約130個(gè)氨基酸序列的鈣依賴型的糖類識別區(qū)域，該區(qū)域能夠與脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖等病原或細(xì)胞膜表面的病原相關(guān)分子模式結(jié)合，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答信號通路并調(diào)控多種免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)、介導(dǎo)抗原遞呈作用并激活T細(xì)胞免疫、激活補(bǔ)體途徑、介導(dǎo)細(xì)胞粘附及吞噬作用等多種免疫應(yīng)答反應(yīng)。貝類缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，僅具有固有免疫系統(tǒng)，C-型凝集素是貝類免疫防御過程中重要的因子，通常分布于貝類血淋巴、粘液、受精卵、肌肉和消化腺中。游離狀態(tài)的C-型凝集素，能夠與體液中病原體發(fā)生結(jié)合，可使病原體聚集，發(fā)生趨化作用或凝集作用，促使細(xì)胞發(fā)生吞噬或包囊作用。另外，C-型凝集素還能夠激活酚氧化酶原，促進(jìn)呼吸爆發(fā)等多種免疫防御反應(yīng)。目前在貝類中已報(bào)道存在多種C-型凝集素，但主要是基因水平克隆凝集素的基因序列、研究病原感染后基因的表達(dá)情況，在蛋白和細(xì)胞水平對凝集素的檢測還較少。檢測C-型凝集素的分布、凝集活性及病原感染后的變化等，了解C-型凝集素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，也成為近期貝類C-型凝集素研究的熱點(diǎn)問題。利用抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體一方面可以對櫛孔扇貝體內(nèi)C-型凝集素進(jìn)行組織定位，檢測其在櫛孔扇貝不同組織器官內(nèi)的凝集活性、以及病原感染后凝集素含量的變化等，為扇貝C-型凝集素的進(jìn)一步研究提供方法手段和技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體，該抗體能與C-型凝集素特異性結(jié)合。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體的制備方法。
[0005]本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體在C-型凝集素檢測中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:研制了一種抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為:雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號為=CCTCC NO:C201391,保藏日期為:2013年06月17日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。
[0007]本發(fā)明所述的抗櫛孔扇貝凝集素重組蛋白單克隆抗體，能與櫛孔扇貝C-型凝集素發(fā)生特異性結(jié)合。[0008]在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)良好的該雜交瘤細(xì)胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強(qiáng)、細(xì)胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細(xì)胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由橘紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，該培養(yǎng)基中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量的抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體。
[0009]一種所述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟:首先，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則及克隆獲得的GenBank (DQ209290)中公布的櫛孔扇貝C-型凝集素全長cDNA序列，設(shè)計(jì)含特定酶切位點(diǎn)的C-型凝集素成熟肽段的特異性擴(kuò)增引物，以從櫛孔扇貝整體組織中抽提的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA鏈作為模板，經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段編碼基因；將目的基因經(jīng)雙酶切后插入pET32a質(zhì)粒，構(gòu)建表達(dá)融合蛋白的載體pET32a-lec290 ;轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，PCR和測序驗(yàn)證無誤后，將篩選到的陽性克隆菌放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)親和層析法純化；以該純化的融合蛋白作為抗原免疫Balb/c小白鼠，采用細(xì)胞融合技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過免疫學(xué)檢測篩選方法，篩選出分泌抗櫛孔扇貝C-型凝集素Lec290成熟肽段單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞CfLec290-lA2，然后采用常規(guī)方法培養(yǎng)上述所得到的雜交瘤細(xì)胞株CfLec290-lA2，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)純化后得到抗櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段單克隆抗體。
[0010]所述的免疫學(xué)檢測篩選方法是:間接酶聯(lián)免疫法，間接免疫熒光法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法。其中所述的間接酶聯(lián)免疫法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法綜合確定該單抗與櫛孔扇貝C-型凝集素成熟段特異性結(jié)合反應(yīng)真實(shí)存在；間接免疫熒光結(jié)果同樣顯示該單抗可以與櫛孔扇貝多種組織發(fā)生特異性結(jié)合，這與C-型凝集素在櫛孔扇貝體內(nèi)廣泛存在的事實(shí)相符。
[0011]本發(fā)明的單抗經(jīng)轉(zhuǎn)印免疫印跡檢測結(jié)果顯示其能特異性與42 kDa重組表達(dá)的櫛孔扇貝C-型凝集素融合蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
`[0012]所述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體在凝集素體外檢測中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:由于本發(fā)明制備了抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體，為研究櫛孔扇貝C-型凝集素在櫛孔扇貝非特異性免疫應(yīng)答及其它生理功能提供了重要工具。由于本發(fā)明重要的制備技術(shù)路線是:通過重組表達(dá)櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段融合蛋白，經(jīng)純化后免疫小鼠，采用細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，再經(jīng)過免疫學(xué)檢測篩選方法篩選出抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體。這樣的制備技術(shù)路線設(shè)計(jì)新穎，嚴(yán)密而合理。
[0014]由于使用的間接酶聯(lián)免疫技術(shù)，通過包被純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白于酶標(biāo)板上，使得確認(rèn)該發(fā)明單抗與櫛孔扇貝C-型凝集素發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)真實(shí)存在。本發(fā)明將間接免疫熒光法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法結(jié)合起來，能夠更加直觀的顯示該發(fā)明單抗與非變性的和變性后的櫛孔扇貝C-型凝集素發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為表達(dá)櫛孔扇貝C-型凝集素的表達(dá)質(zhì)粒pET32a-lec290構(gòu)建示意圖。
[0016]圖2為櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白的表達(dá)鑒定圖。
[0017]其中條帶M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；條帶I表示誘導(dǎo)表達(dá)前的大腸桿菌電泳圖譜；條帶2表示誘導(dǎo)表達(dá)4h后的大腸桿菌電泳圖譜；條帶3表示分離純化的櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段重組蛋白。
[0018]圖3為櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白的凝集活性分析圖。
[0019]其中A表示櫛孔扇貝重組蛋白與鰻弧菌發(fā)生凝集反應(yīng)出表示櫛孔扇貝重組蛋白與金黃色葡萄球菌發(fā)生凝集反應(yīng)；C表示櫛孔扇貝重組蛋白與枯草芽孢桿菌發(fā)生凝集反應(yīng)；D表示重組表達(dá)標(biāo)簽蛋白與鰻弧菌反應(yīng)結(jié)果；E表示重組表達(dá)標(biāo)簽蛋白與金黃色葡萄球菌反應(yīng)結(jié)果；F表示重組表達(dá)標(biāo)簽蛋白與枯草芽孢桿菌反應(yīng)結(jié)果，即D、E和F為陰性對照。
[0020]圖4為ELISA方法分析單克隆抗體對櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白的特異性結(jié)合圖。
[0021]其中I表示單克隆抗體與重組表達(dá)標(biāo)簽蛋白結(jié)合的OD值，即陰性對照；2表示單克隆抗體與櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的OD值。
[0022]圖5為轉(zhuǎn)印免疫印跡法分析單抗與櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白的特異性結(jié)合圖。
[0023]其中條帶M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；條帶I表示誘導(dǎo)表達(dá)后的陽性大腸桿菌SDS-PAGE圖譜；條帶2表示單抗與櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)；條帶3表示陰性對照。
[0024]圖6為間接免疫熒光法分析單抗與櫛孔扇貝多種組織的特異性結(jié)合反應(yīng)圖。
[0025]其中A表示在40倍物鏡下觀察的單抗與血細(xì)胞表面特異性結(jié)合反應(yīng)；C表示在20倍物鏡下觀察的單抗與鰓組織發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，E表示在20倍物鏡下觀察的單抗與外套膜組織發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，G表示20倍物鏡下單抗與肝胰腺組織發(fā)生特異性反應(yīng)，熒光信號呈點(diǎn)狀分散排布；B、D、`F和H分別為骨髓瘤上清與血細(xì)胞、鰓、外套膜和肝胰腺反應(yīng)，為陰性對照。
[0026]圖7為櫛孔扇貝感染鰻弧菌后血細(xì)胞中凝集素含量隨時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0028]實(shí)施例1:構(gòu)建表達(dá)櫛孔扇貝C-型凝集素的重組質(zhì)粒與蛋白表達(dá)
(I)以抗凝劑(27 mM 檸檬酸鈉，336 mM NaCl, 115 mM 葡萄糖，9 mM EDTA, pH 7.2)1:I的比例抽取櫛孔扇貝血細(xì)胞，離心分離獲取櫛孔扇貝血細(xì)胞，并分別解剖獲得櫛孔扇貝其他主要組織器官，包括鰓、外套膜、肝胰腺、性腺、腎臟以及肌肉，將血細(xì)胞以及其他組織混合，組織勻漿后，以Trizol法分別抽提總RNA。
[0029](2)根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則及公布的一種櫛孔扇貝C-型凝集素全長cDNA序列(GenBank:DQ209290),利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0,結(jié)合pET32a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)，選擇I和Afoi I的酶切位點(diǎn)處作為目的基因的插入位置，設(shè)計(jì)C-型凝集素成熟肽段表達(dá)引物:
上游引物:5 ’ -CGCGGATCCTATATTTCAAAGCATGGTACGGGAGATG-3 ’ 劃線部分為 BawR I 酶切位點(diǎn)；
下游引物:5 ’ -CGCGCGGCCGCTTAGCGTACAATCTCGCAGATATAGAAC-3 ’ 劃線部分為 ? I 酶切位點(diǎn)。
[0030](3)以提取的總RNA為模板，先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94 °C變性5 min ； 94 ° C變性，30 S，65 ° C退火30 S，72 ° C延伸60 S，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10 min, PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用DNA片段回收試劑盒對目的基因進(jìn)行純化回收。
[0031 ] (4 )將質(zhì)粒pET32a和純化回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶I和?I進(jìn)行雙酶切，連接后構(gòu)建質(zhì)粒pET32a-lec290 (圖1)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，然后把大腸桿菌BL21涂布于含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基平板表面,37 °(3培養(yǎng)過夜,挑取菌落后經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增檢測確認(rèn)有目的基因插入后，陽性菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見經(jīng)I和Afoi I雙酶切后，成為兩個(gè)片段，分別為pET32a和櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段編碼基因(基因序列如下)，與理論值相符。經(jīng)DNA序列測定結(jié)果正確。
[0032](5 )將陽性克隆菌和含pET32a空載體的菌株分別放入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C恒溫條件下振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100稀釋培養(yǎng)過夜的菌液，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到0D_=0.6時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ -D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度為I mmol/L，未加IPTG誘導(dǎo)的菌液作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0033]結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的菌液蛋白在相對分子質(zhì)量#r=42 kDa處有明顯的條帶，而未誘導(dǎo)的菌液蛋白無相應(yīng)條帶(圖2)。序列分析顯示，C-型凝集素理論分子量約為23.5 kDa,而重組蛋白帶有的pET32a載體組氨酸等標(biāo)簽蛋白的理論分子量約為21 kDa，所以構(gòu)建的C-型凝集素重組蛋白分子量約為42 kDa,與SDS-PAGE凝膠顯示的目的蛋白分子量一致。
[0034](6)采用上述方法，進(jìn)行大量誘導(dǎo)。收集菌液，將菌體細(xì)胞用緩沖液B (50 mMTris-HCl, I mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8.0)重懸后，反復(fù)凍融 5 次后置于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎 8 min (Sonics & Materials ;振幅 39% ;pulse on,4 s.；pulseoff, I s.),1500 g離心30 `min收集包涵體沉淀；以Ni離子螯合的親和層析柱(HisTrapHP I ml, GE)對重組蛋白進(jìn)行純化，純化獲得的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測純化情況，剩余的用PBS緩沖液(NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HP04 10 mmol/L, KH2PO4 2 mmol/L，pH 7.2)重懸，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0035]結(jié)果顯示，經(jīng)親和層析純化后的目的重組蛋白條帶單一，分子量為42 kDa左右，無其他明顯蛋白條帶(圖2)。
[0036]實(shí)施例2:櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白活性檢測 一、制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記菌體
(I)分別培養(yǎng)大腸桿菌Transl-Tl、遲緩愛德華氏菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母。
[0037](2)調(diào)整菌體濃度至IO9 cells/mL，加入含有4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液至終濃度為1%，振蕩固定30 min ；6000 g離心5 min,去除上清。
[0038](3)菌體沉淀經(jīng)TBS緩沖液重懸洗滌3次后，加入10 mg/mL異硫氰酸熒光素(FITC，溶解于DMS0)至終濃度為10 μ g/mL，振蕩孵育3 h ；6000 g離心5 min，去除上清，菌體沉淀經(jīng)TBS緩沖液重懸洗滌3次，調(diào)整菌體濃度至IO8 cells/mL,4 °(:避光保存?zhèn)溆谩?br> [0039]二、凝集活性測定
(I)在96孔U型培養(yǎng)板上進(jìn)行，2倍比濃度系列稀釋櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白。[0040](2)20 μ g/mL櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白分別與等體積FITC標(biāo)記的9種菌體(大腸桿菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母)混勻，20 °(:避光靜置I h，熒光倒置顯微鏡觀察。
[0041]結(jié)果顯示，櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白可以與鰻弧菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌發(fā)生凝集反應(yīng)，表現(xiàn)為，熒光倒置顯微鏡下菌體成團(tuán)成簇聚集，呈現(xiàn)為斑塊狀強(qiáng)烈熒光信號，陰性對照未發(fā)生凝集反應(yīng)，菌體則成彌散狀，為均勻散點(diǎn)熒光信號(圖3)。
[0042]實(shí)施例3:小鼠抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體的制備 一、免疫 用純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白作為抗原。每次的免疫劑量為0.lmL，免疫共分4次進(jìn)行，前2次免疫間隔為2周，后3次免疫間隔為I周，前兩次為腹腔注射，后兩次為尾靜脈注射:
(1)基礎(chǔ)免疫:純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白lmg/mL與福氏完全佐劑等量(V/V)混勻作為抗原；
(2)加強(qiáng)免疫:純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白lmg/mL與福氏不完全佐劑等量(V/ν)混勻作為抗原；
(3)二次加強(qiáng)免疫:純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白0.5 mg/mL作為抗原；
(4)融合前三天的擴(kuò)增免疫:純化的rLec290融合蛋白作為抗原。
[0043]二、細(xì)胞融合
(1)脫頸椎處死免疫小鼠，無菌取出脾臟和胸腺后，分別過100目網(wǎng)篩，用RPM1-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；
(2)分別將脾細(xì)胞懸液和胸腺細(xì)胞懸液1000rpm離心3 min，棄去上清液，脾細(xì)胞沉淀用RPM1-1640溶液重懸，胸腺細(xì)胞沉淀用含有1% HAT的RPM1-1640 (含10%胎牛血清)選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。
[0044](3)取3X107個(gè)處于對數(shù)生長期的P3-X63-Ag8Ul骨髓瘤細(xì)胞，1000 rpm離心3min，去上清液后，用RPM1-1640溶液重懸；
(4)將脾細(xì)胞懸液與瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，1000rpm離心3 min，完全吸去上清液，輕彈離心管底，使兩種細(xì)胞沉淀充分混勻成糊狀；用吸管吸取預(yù)溫到37 0C的聚乙二醇(PEG)溶液I mL，滴加到離心管內(nèi)，在I min內(nèi)加完；然后在37 °(:水浴靜置5 min ；
(5)繼續(xù)滴加已經(jīng)預(yù)溫到37°C的RPM1-1640溶液15 mL,使PEG稀釋而失去作用；
(6)補(bǔ)加RPM1-1640溶液至40mL,經(jīng)1000 rpm離心3 min,棄去上清液；
(7)將沉淀的細(xì)胞用3mL 37 °(:的RPM1-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，凍存2 mL ；
(8)將剩下的ImL細(xì)胞懸液加入(2)制成的胸腺細(xì)胞懸液，混合均勻后滴加到96孔培養(yǎng)板中；
(9)將培養(yǎng)板放入37°C, CO2濃度為4.5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，大約兩周后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測。
[0045]三、篩選和克隆
(O篩選:融合后，待雜交瘤細(xì)胞群長到96孔培養(yǎng)板的孔底面積1/3時(shí)開始檢測，采用間接酶聯(lián)免疫技術(shù)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。[0046]①包被抗原:將純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白用碳酸鹽包被液(pH 9.6)1:10稀釋，加入96孔酶標(biāo)板中(50 μ?7孔)，4 °C包被過夜;
②吸出包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，每次5 min，洗三
次；
③每孔加入200μ? 3%的牛血清白蛋白(PBS配)，37 °C封閉I h;
④同②法洗漆二次；
⑤將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50PL加入至酶標(biāo)板，37 °(:溫箱孵育
I h ；
⑥同②法洗漆二次；
⑦堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50 PL加入至酶標(biāo)板，37 °(:溫箱孵育I h;
⑧同②法洗滌三次；然后每孔加入100μ? 4-硝基酚磷酸鹽(ρΝΡΡ)應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5-20 min，每孔加入50 μ? 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3-5 min即可用405 nm工作波長測定OD值。
[0047]以包被含pET32a空載體的菌落表達(dá)的標(biāo)簽蛋白作為陰性對照，測波長為405nm時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔與陰性對照光吸收值之比(P/N)，當(dāng)P/N3 2.1時(shí)該孔為陽性。
[0048](2)克隆:采用有限稀釋法對檢測出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，步驟如下:` ①脫頸椎處死小鼠，無菌取出胸腺，在100目網(wǎng)篩上研磨，用RPM1-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；
②把胸腺細(xì)胞懸液1000rpm離心3 min，棄去上清液，胸腺細(xì)胞沉淀用10 mLRPM1-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸；
③把要克隆的陽性細(xì)胞孔中的細(xì)胞用血球記數(shù)板記數(shù)，然后用培養(yǎng)液以10倍梯度稀釋，取出100個(gè)雜交瘤細(xì)胞，放入胸腺細(xì)胞懸液中；
④細(xì)胞懸液用滴管吹打均勻，滴加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100PL，平均每個(gè)孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞；
⑤放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑥兩周后通過間接酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測各孔雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，把所得陽性克隆孔的雜交瘤細(xì)胞按上述方法再克隆一次，以保證形成單克隆。
[0049]四、凍存
取生長旺盛，形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，200 g離心5 min，去上清，加凍存液(9份RPM1-1640培養(yǎng)基+ 1份二甲亞砜)，使最終細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，將I mL細(xì)胞懸液裝于2 mL凍存管中，擰緊螺蓋，然后將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，放于-80 °(:超低溫冰箱內(nèi)過夜(8-12小時(shí))后，再浸入液氮內(nèi)長期保存。本發(fā)明獲得的生長旺盛，形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，其名稱為:雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2，保藏號為:CCTCC NO:C201391，保藏日期為:2013年06月17日。
[0050]實(shí)施例4:本發(fā)明單抗的間接酶聯(lián)免疫法鑒定:
(1)包被抗原:將純化的櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白用碳酸鹽包被液(pH9.6)1:10稀釋，加入96孔酶標(biāo)板中(50 μ?7孔)，4 ° C包被過夜；
(2)吸出包被液，用PBST洗滌，每次5min，洗三次；
(3)每孔加入200μ? 3%的牛血清白蛋白(溶解于PBS)，37 °C封閉I h;(4)同(2)法洗滌三次；
(5)將雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50μ?加入至酶標(biāo)板，37°(:溫箱孵育I h ；
(6)同(2)法洗滌三次；
(7)堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50 PL加入至酶標(biāo)板，37 °(:溫箱孵育I h;
(8)同(2)法洗滌三次；然后每孔加入100μ? ρΝΡΡ應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5-20 min，每孔加入50 μ? 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3_5 min即可用405 nm工作波長測定OD值。
[0051]用包被同等濃度的純化的pET32a空載體菌落表達(dá)的標(biāo)簽蛋白作為陰性對照，包被PBS作為空白對照，測波長為405 nm時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算陽性血清與PBS光吸收值之比(P/N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)為陽性。
[0052]結(jié)果:陽性:0.6226 ;陰性對照:0.0815。此結(jié)果證實(shí)本發(fā)明單抗能與櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)(圖4)。
[0053]實(shí)施例5:本發(fā)明單抗的轉(zhuǎn)印免疫印跡法鑒定
(I)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳:
①將收集的陽性大腸桿菌等比例加入含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮3_5min ；
②將①處理過的樣品加入上樣孔中，每孔內(nèi)加樣品ΙΟμ?，在恒流條件下，起始時(shí)用低電流(30-40mA)，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，加大電流(50-70mA)，電泳至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，取出凝膠；
③剪取一塊與電泳凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(孔徑0.22 Mm)以電轉(zhuǎn)移緩沖液(電轉(zhuǎn)移緩沖液:25 mmol/L Tris-Base, 192 mmol/L甘氨酸,20%甲醇,pH 8.3)潤濕,放在電泳后的凝膠上。在硝酸纖維素膜上剪掉一個(gè)角，以標(biāo)志樣品順序的起始端。用潤濕的濾紙支持，將第二塊潤濕的濾紙貼在凝膠片的另一面；按上述放置順序，使膠塊與硝酸纖維素膜及濾紙形成一套夾心的〃三明治〃；
④將"凝膠三明治"置入盛有電轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽內(nèi)，將硝酸纖維素膜面向陽極；電泳恒流200 mA，通電5小時(shí)；
⑤轉(zhuǎn)移完畢，取出硝酸纖維素膜。
[0054](2)免疫印跡:
①將硝酸纖維素膜用PBS洗10分鐘，然后置3%的牛血清白蛋白溶液(PBS配)中封閉I h，37 0C ；
②用PBST洗3次，每次5分鐘；
③將硝酸纖維素膜置于雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2培養(yǎng)上清中，37 °C緩慢搖動(dòng)I h ;以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育硝酸纖維素膜作為陰性對照；
④同②法洗漆二次；
⑤將硝酸纖維素膜加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig抗體(1:4000稀釋)中，37°C緩慢搖動(dòng)I h ；
⑥同②法洗漆二次；
⑦把硝酸纖維素膜放入堿性磷酸酶發(fā)色液(NBT-BCIP發(fā)色液)中發(fā)色，直到顏色清晰為止;
⑧用去離子水洗滌，以終止反應(yīng)。將硝酸纖維素膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。
[0055]結(jié)果:本發(fā)明單抗與櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白分子量為42kDa蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖5)，而陰性對照無條帶顯示。
[0056]實(shí)施例6:本發(fā)明單抗在櫛孔扇貝各組織中C-型凝集素分布檢測中的應(yīng)用:
(I)血細(xì)胞底片的制備:將離心獲取的櫛孔扇貝血細(xì)胞以0.01 M PBS重懸，將濃度調(diào)整到I X IO7個(gè)/mL ;將血細(xì)胞懸液滴在干凈的載玻片上，每滴20 μ?，在室溫下濕盒中沉降I小時(shí)后取出放入丙酮中固定10分鐘，取出風(fēng)干，-20 ° C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0057](2)組織冰凍切片的制備:取櫛孔扇貝鰓、外套膜、肝胰腺、性腺、腎臟以及肌肉組織，切成不大于5 mm X 5 mm X 5 mm的小塊,用無菌PBS溶液清洗干凈后，置于OCT冷凍包埋劑中包埋，將包埋塊置于-80 ° C速凍后，-20 ° C保存；使用冷凍切片機(jī)將-20 °C保存的組織包埋塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為7 μ m，將貼片后的載玻片丙酮浸泡固定10 min后取出，-20 ° C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0058](3)取扇貝血細(xì)胞滴片和各組織冰凍切片，在每張載玻片上滴加雜交瘤細(xì)胞上清，使之均勻覆蓋在血細(xì)胞或組織切片區(qū)域上，于37 °(:濕盒中避光孵育I h。
[0059](4)傾斜玻片，去除多余液體，并迅速將載玻片置于PBST緩沖液中浸泡洗滌3次，每次5 min。
[0060](5)以異硫氰酸熒光素標(biāo) 記的羊抗小鼠抗體為第二抗體，加在組織樣品上，37 0C濕盒中避光孵育45 min。
[0061](6)同(4)洗滌玻片，滴加90%甘油進(jìn)行封片。
[0062]( 7 )熒光顯微鏡下觀察。
[0063]結(jié)果:本發(fā)明單抗與櫛孔扇貝血細(xì)胞、鰓、外套膜以及肝胰腺發(fā)生特異性結(jié)合，呈現(xiàn)熒光陽性信號，而陰性對照則沒有觀察到熒光信號(圖6)。
[0064]實(shí)施例7:本發(fā)明單抗在鰻弧菌感染后櫛孔扇貝C-型凝集素含量變化檢測中的應(yīng)用:
(1)健康櫛孔扇貝分7組暫養(yǎng)于連續(xù)充氣海水中，分別注射50μ L PBS緩沖液、IOVmL鰻弧菌后，于0、3、6、9、12、24、36、48、96小時(shí)后，抽取血淋巴，離心，收集血細(xì)胞沉淀；
(2)將血細(xì)胞沉淀用PBS緩沖液重懸，離心洗滌2次，用適量PBS重懸血細(xì)胞沉淀；
(3)將血細(xì)胞樣品用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎(振幅39%,pulseon 3 s,pulse off 3 s)后，10000 g離心，收集上清，用改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定并調(diào)整蛋白濃度到 100 μ g/mL ；
(9)將100μ L各血細(xì)胞蛋白粗提液樣品包被于96孔酶標(biāo)板(50 μ?7孔)，4 °C包被過夜；
(10)吸出包被液，用PBST洗滌， 每次5min，洗三次；
(11)每孔加入200μ? 3%的牛血清白蛋白(溶解于PBS)，37 °C封閉I h;
(12)同(10)法洗滌三次，將雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50KL加入至酶標(biāo)板，37 °(:溫箱孵育I h ；
(13)同(10)法洗滌三次，堿性 磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50 μ?加入至酶標(biāo)板，37 °(:溫箱孵育I h;(14)同(10)法洗滌三次；然后每孔加入100 μ? ρΝΡΡ應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5_20 min,每孔加入50 μ? 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3_5 min即可用405 nm工作波長測定OD值。
[0065]用包被同等濃度的牛血清白蛋白(溶解于PBS)作為陰性對照，包被PBS作為空白對照，測波長為405 nm時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算陽性血清與PBS光吸收值之比(P/N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)為陽性。
[0066]結(jié)果:本發(fā)明單抗檢測發(fā)現(xiàn)，注射鰻弧菌后，櫛孔扇貝血細(xì)胞中C-型凝集素的含量呈現(xiàn)先快速上升而后逐漸下降的趨勢，一直顯著高于對照組(圖7)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體，其特征在于:所述的單克隆抗體是由保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為=CCTCC NO:C201391，保藏日期為:2013年06月17日的雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2分泌的。
2.一種如權(quán)利要求1所述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟:首先，通過重組表達(dá)櫛孔扇貝C-型凝集素成熟肽段蛋白，經(jīng)純化后作為抗原免疫Balb/c小鼠,采用細(xì)胞融合法制備雜交瘤細(xì)胞；再通過免疫學(xué)檢測篩選方法，篩選出分泌所述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞CfL290-lA2，收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)純化后得到抗櫛孔扇貝C-型凝集素蛋白單克隆抗體。
3.—種如權(quán)利要求1所述抗櫛孔扇貝C-型凝集素重組蛋白單克隆抗體在凝集素體外檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/577GK103554255SQ201310435928
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】邢婧, 戰(zhàn)文斌, 談艷苗, 唐小千, 繩秀珍 申請人:中國海洋大學(xué)