專利名稱：櫛孔扇貝血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用單克隆抗體定量檢測櫛孔扇貝(Chlamys farreri)血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒及其制備方法，屬于貝類分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
貝類缺乏免疫球蛋白和特異性免疫，其免疫防御過程是由血細(xì)胞和血淋巴中的體 液因子協(xié)同完成。血細(xì)胞通過自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化殺傷等方式，達(dá)到識別、包 裹和清除外來異物的目的；血細(xì)胞還能通過釋放溶菌素、凝集素、調(diào)理素等物質(zhì)來調(diào)理輔 助體液因子免疫，其在貝類抵御外界環(huán)境刺激及外來病原微生物侵襲的過程中起著關(guān)鍵作用。櫛孔扇貝是我國北方沿海貝類養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類。近年來病害頻發(fā)，已逐漸成 為限制櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的因素之一。目前櫛孔扇貝多采用海上筏式籠養(yǎng)等養(yǎng)殖 方式，但在廣闊的水域中對病害的發(fā)生、預(yù)防和流行的控制困難較大，因而對貝類健康狀況 的監(jiān)測顯得尤為重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子的變化和病原的侵襲可引起扇貝血細(xì)胞數(shù) 量的顯著變化。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，扇貝經(jīng)饑餓、高溫或病原刺激后，其血細(xì)胞數(shù)量要明顯 低于未刺激的正常扇貝；此外，馬洪明等[高技術(shù)通訊，2006 16 (7)，745-751]也報(bào)道扇貝 經(jīng)鹽度突降或細(xì)菌感染后，其血細(xì)胞數(shù)量會驟減；一些國外學(xué)者也在其他貝類研究中發(fā)現(xiàn) 貝類經(jīng)Cu2+、Pb2+，干露，缺氧等刺激后，血細(xì)胞數(shù)量會明顯低于某一正常值，有些甚至死亡。 因此，血細(xì)胞數(shù)量的變動可以作為一個(gè)評估扇貝受病原感染或環(huán)境脅迫等的檢測指標(biāo)。目前檢測血細(xì)胞數(shù)量變動的方法主要有血球計(jì)數(shù)板法和流式細(xì)胞儀法。血球計(jì)數(shù) 板法誤差大、主觀性強(qiáng)、不適用于大規(guī)模樣品檢測；流式細(xì)胞儀法價(jià)格昂貴，耗材費(fèi)用高，需 專門的技術(shù)人員操作、且對樣品的針對性不強(qiáng)，易將雜質(zhì)碎片誤認(rèn)為血細(xì)胞。單克隆抗體 (以下簡稱單抗)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)常被應(yīng)用于免疫細(xì)胞的定位和病原的定 量研究中。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種特異性強(qiáng)、精確度高、靈敏度高、重 復(fù)性好的應(yīng)用抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗來檢測血細(xì)胞數(shù)量變化的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試 劑盒，以期評估養(yǎng)殖扇貝受病原感染或環(huán)境脅迫等的可能，為監(jiān)測扇貝健康狀況提供依據(jù)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述櫛孔扇貝血細(xì)胞ELISA檢測試劑盒的制備方法。本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒包括酶標(biāo)板，封閉液，洗滌液，酶標(biāo)記抗體，pNPP底物 顯色液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，血細(xì)胞抗凝劑，其特征在于所述的試劑盒還包括抗櫛孔扇貝 血細(xì)胞單抗，血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中所述的抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗是通過收集抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆雜交 瘤細(xì)胞1F7的培養(yǎng)上清液，過Protein G-瓊脂糖親和層析柱，濃縮、透析、純化制得，其特征 在于所述的單抗能與櫛孔扇貝各種類型血細(xì)胞(透明血細(xì)胞、顆粒血細(xì)胞)特異性結(jié)合；
所述的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品是通過收集健康扇貝的血細(xì)胞，經(jīng)重懸、超聲波破碎后制 得；所述的封閉液為含3.0% (w/v)牛血清白蛋白的PBS ；所述的洗滌液為含0. 1 % (v/v) Tween-20的PBS ；所述的酶標(biāo)記抗體為堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體；所述的血細(xì)胞抗凝劑為含0. 02M EDTA的PBS。本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒的制備方法包括下列步驟1.制備血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品取健康的櫛孔扇貝，定量抽取血淋巴，離心后，所得血細(xì) 胞沉淀用等量的血細(xì)胞抗凝劑重懸，經(jīng)超聲波破碎，作為本試劑盒的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品；2.制備抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單抗以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品為抗原免疫小鼠，細(xì)胞融 合，經(jīng)間接免疫熒光法篩選，克隆，得到抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆雜交瘤細(xì)胞，其培養(yǎng)上 清液即含單抗；選取1株免疫熒光反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽性，且能與櫛孔扇貝各種類型血細(xì)胞特 異性結(jié)合的單抗作為本試劑盒的櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗；3.確定抗原與抗體的最佳使用比例將上述血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品和血細(xì)胞單抗分別 用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，通過ELISA棋盤滴定法獲取抗原抗體的適宜反應(yīng)比例，進(jìn) 而確定抗原與抗體的最佳使用比例；4.建立檢測結(jié)果評估標(biāo)準(zhǔn)分別通過高溫和病原的刺激，應(yīng)用血細(xì)胞單抗的 ELISA法檢測各刺激條件下血細(xì)胞的數(shù)量變化；根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，以常溫和高溫刺激 實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果制定扇貝健康狀態(tài)與受環(huán)境脅迫的臨界范圍；以對照和病原感染實(shí)驗(yàn)組的結(jié) 果制定扇貝受環(huán)境脅迫與病原感染的臨界范圍；在二者之間即為受環(huán)境脅迫的范圍；從而 建立評估標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將血細(xì)胞作為抗原包被于酶標(biāo)板，應(yīng)用血細(xì)胞單抗通過高效率的 酶標(biāo)記抗體顯色的方法將待檢樣品的血細(xì)胞含量直觀表達(dá)出來，特異性強(qiáng)，精確度高，靈敏 度高，可用于少量樣品、多個(gè)樣品的平行檢測，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。檢測結(jié)果能夠評估扇貝 受病原感染或環(huán)境脅迫等的可能，起到提前預(yù)警的作用，方便養(yǎng)殖戶及早采取防控措施。


圖1為本發(fā)明的櫛孔扇貝血細(xì)胞懸液與單抗1F7反應(yīng)間接免疫熒光檢測的結(jié)果。圖2為本發(fā)明的水溫為15°C和25°C時(shí)櫛孔扇貝血細(xì)胞樣品的ELISA檢測結(jié)果。圖3為本發(fā)明的水溫為25°C，受病原感染時(shí)櫛孔扇貝血細(xì)胞樣品ELISA檢測結(jié)果。圖4為本發(fā)明的2009年3 12月青島地區(qū)養(yǎng)殖的櫛孔扇貝血細(xì)胞樣品的ELISA 檢測結(jié)果。圖1所示A為暗視野下熒光檢測的結(jié)果；B為明視野下原位微分干涉檢測的結(jié) 果；其中G為顆粒血細(xì)胞；H為透明血細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 櫛孔扇貝血細(xì)胞ELISA檢測試劑盒的制備1.制備血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品
取30 40只活力健康、體質(zhì)正常(適宜的生活環(huán)境水溫15°C，鹽度31ppt，餌料 充足，無病原微生物等)的櫛孔扇貝，從閉殼肌抽取血淋巴50ml，按體積比為1 1與預(yù)冷 的血細(xì)胞抗凝劑(含 0. 02M EDTA 的 PBS 0. 02M EDTA，0. 14M NaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4, 1. 5mM KH2PO4,pH 7.4)混勻，混合液經(jīng)3000r/min，4°C離心lOmin，所得血細(xì)胞沉淀，用50ml 抗凝劑重懸，再經(jīng)超聲波破碎，即為血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品，分裝，-80°C凍存。2.制備抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單抗 (1)動物免疫取100 μ 1血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品作為抗原與等體積的弗氏完全佐劑混 勻，完全乳化后，從BALB/c小鼠的腹腔多點(diǎn)注射乳化液共100 μ 1 ；首次免疫兩周后進(jìn)行加 強(qiáng)免疫(佐劑改用弗氏不完全佐劑，免疫劑量和部位同首次免疫)；一周后，進(jìn)行二次加強(qiáng) 免疫(無佐劑的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品ΙΟΟμ 1，尾靜脈注射)；一周后，進(jìn)行擴(kuò)增免疫(免疫物質(zhì)， 劑量和部位同二次加強(qiáng)免疫)；三天后，融合；(2)細(xì)胞融合和血細(xì)胞陽性雜交瘤的篩選將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按 常規(guī)方法[朱立平，陳血清等.免疫學(xué)常用試驗(yàn)方法[Μ].北京人民軍醫(yī)出版社，2000， 23-74]進(jìn)行細(xì)胞融合、培養(yǎng)、及間接免疫熒光法(以未經(jīng)固定的扇貝血細(xì)胞懸液為抗原)篩 選，得到抗扇貝血細(xì)胞的陽性雜交瘤細(xì)胞；再用有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，得 到抗扇貝血細(xì)胞的陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞。收集陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液(即 含單抗)，通過間接免疫熒光法進(jìn)一步篩選出1株免疫熒光結(jié)果為強(qiáng)陽性的單抗1F7，其能 與櫛孔扇貝透明血細(xì)胞和顆粒血細(xì)胞均特異性結(jié)合(圖1)。單抗1F7經(jīng)免疫組化檢測后， 結(jié)果表明其與櫛孔扇貝其它組織細(xì)胞無交叉反應(yīng)；(3)血細(xì)胞單抗的收集與純化收集雜交瘤細(xì)胞1F7的培養(yǎng)上清液250ml，過 AmershamPhamacia Biotech 公司的親禾口層析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column), 濃縮、透析、凍干，PBS重懸，分裝，-80°C凍存。3.確定抗原與抗體的最佳使用比例血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品用PBS按2°，2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6和2_7的梯度稀釋包被于酶標(biāo) 板孔內(nèi)，每孔100μ 1，每個(gè)梯度的樣品加樣6孔，4°C過夜；加封閉液(用PBS配制的3.0% 牛血清白蛋白溶液)封閉Ih ；將血細(xì)胞單抗(一抗)用PBS按2° J-1I2J-3I4和2_5的梯 度稀釋，按棋盤滴定法加入到相應(yīng)的抗原孔中，每孔100μ 1，37°C孵育1. 5h ；再加入酶標(biāo)記 抗體(AP 二抗)100μ 1，37 °C孵育Ih ；最后加pNPP底物顯色液100μ 1，37°C孵育30min，用 酶標(biāo)儀于405nm處讀數(shù)。結(jié)果表明(表1)血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與血細(xì)胞單抗?jié)舛冉M合為 2°2°，^1,^0, Π2，2_22°，2_224時(shí)的OD4tl5nm值普遍高于其他各種組合，為抗原抗體的適宜 反應(yīng)比例?？紤]實(shí)際用量、節(jié)約成本等問題，選擇2、_2(即抗原稀釋2倍，單抗稀釋4倍) 作為試劑盒抗原抗體的最佳使用比例。表1 各個(gè)抗原、抗體梯度組合的OD4tl5nm值，粗體為OD4tl5nm值彡0. 5600。 4.建立檢測結(jié)果評估標(biāo)準(zhǔn)(1)高溫和病原刺激實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)取100只扇貝分別在水溫15°C (常溫)和 250C (高溫)的條件下(每組50只)，養(yǎng)殖7天；取100只扇貝分別注射扇貝急性病毒性壞 死病毒(AVNV)粗提液，每只100 μ 1，另取100只扇貝注射2%的滅菌生理鹽水作為對照組， 在水溫為25°C的條件下各養(yǎng)殖15天。每天觀察各實(shí)驗(yàn)組扇貝的健康狀況，每組采樣5 6只扇貝，定量抽取血淋巴，離心后，所得血細(xì)胞沉淀用等量抗凝劑重懸，經(jīng)超聲波破碎，分 裝，-80°C凍存，待用；(2)ELISA檢測分別將經(jīng)溫度和病原刺激的各天樣品和血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品以2_1稀 釋作為抗原，包被于酶標(biāo)板孔中，每孔100 μ 1，4°C過夜；加封閉液于37°C孵育Ih ；加2-2稀 釋的血細(xì)胞單抗，每孔100 μ 1，37°C孵育1. 5h ；加酶標(biāo)記抗體(AP 二抗)，每孔100 μ 1,37°C 孵育Ih ；最后加pNPP底物顯色液，每孔100μ 1，37°C孵育30min，于405nm處讀數(shù)。待血細(xì) 胞標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD4tl5nm值達(dá)到0. 6時(shí)，即可停止讀數(shù)，讀取各組樣品的OD4tl5nm值；(3)ELISA結(jié)果水溫為15°C的實(shí)驗(yàn)組7天內(nèi)的OD4tl5nm值位于0. 591 0. 625，各值 之間無顯著差異；水溫為25°C的實(shí)驗(yàn)組7天內(nèi)的OD4tl5nm值位于0. 489 0. 586，各值與15°C 組的最低值(0. 591)相比，除第7天的值(0. 586)無顯著差異外，第1 6天的各值均顯著 低于0. 591 (圖2)。在25°C水溫條件下，對照組(注射生理鹽水)15天內(nèi)的OD4tl5nm值位于 0. 486 0. 621 ；病原感染組在第2 9天內(nèi)扇貝急劇死亡，最終存活率為44% ；15天內(nèi)的 OD4tl5nm值位于0. 261 0. 571，其中第3 9天的各值(0. 261 0. 446)特別低，顯著低于 對照組的最低值(0. 486)(圖3)；(4)分析檢測結(jié)果，建立評估標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合圖2的結(jié)果，在25°C實(shí)驗(yàn)組的第1 6天 各值中選取最大值(0. 549),0. 549與0. 591之間即為環(huán)境脅迫與健康狀態(tài)的臨界范圍；結(jié) 合圖3的結(jié)果，在病原感染組的第3 9天各值中選取最大值(0. 446)，0. 446與0. 486之 間即為環(huán)境脅迫與病原感染的臨界范圍。經(jīng)差異顯著性以及統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析，本試劑盒的 環(huán)境脅迫與健康狀態(tài)的臨界范圍為0. 57士0. 025，高于本范圍時(shí)扇貝為健康狀態(tài)；環(huán)境脅 迫與病原感染的臨界范圍為0. 47士0.019，低于本范圍時(shí)扇貝為病原感染狀態(tài)。位于二者之 間的范圍時(shí)扇貝為環(huán)境脅迫狀態(tài)。實(shí)施例2 櫛孔扇貝血細(xì)胞ELISA檢測試劑盒的具體使用方法1.待檢樣品前處理用滅菌注射器從閉殼肌中定量抽取血淋巴，立即與預(yù)冷血細(xì) 胞抗凝劑按體積比為1 1混勻?；旌弦河?000r/min，4°c離心lOmin，所得血細(xì)胞沉淀用 與血淋巴等量的抗凝劑重懸，經(jīng)超聲波破碎后，即為待檢樣品；
2.包被抗原將上述待檢樣品和血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品用PBS以2—1稀釋，加到酶標(biāo)板孔 中，每孔100μ 1，4°C包被過夜；3.封閉棄去孔內(nèi)液體，每孔中加200 μ 1洗滌液(PBST)，輕輕搖晃5min，倒掉洗 滌液，反復(fù)3次。洗完后，在每孔中加入200 μ 1封閉液，37°C孵育Ih ；4. 一抗孵育棄去孔內(nèi)液體，每孔中加200 μ 1洗滌液，5min/次，洗3次。洗完后， 每孔中加入100μ 1用PBS以2_2稀釋的血細(xì)胞單抗，37°C孵育1. 5h ； 5. 二抗孵育棄去孔內(nèi)液體，每孔中加200 μ 1洗滌液，5min/次，洗3次。洗完后， 每孔中加入100 μ 1酶標(biāo)記抗體，37°C孵育Ih ；6.顯色讀數(shù)棄去孔內(nèi)液體，每孔中加200 μ 1洗滌液，5min/次，洗3次。洗完后， 每孔中加入100μ 1 ρΝΡΡ底物顯色液，于37°C孵育30min后用酶標(biāo)儀于405nm波長下讀數(shù)。 待血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD4tl5nm值達(dá)到0. 6時(shí)，即可停止讀數(shù)，讀取待檢樣品的OD4tl5nm值；7.檢測結(jié)果的判定按試劑盒所附的評估標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)待檢樣品的OD4tl5nm值低于 0. 47士0. 019時(shí)判定為受病原感染狀態(tài)；位于0. 47士0. 019與0. 57士0. 025之間時(shí)判定為 受環(huán)境脅迫狀態(tài)；高于0. 57士0. 025時(shí)判定為健康狀態(tài)。實(shí)施例3.應(yīng)用本試劑盒檢測青島地區(qū)養(yǎng)殖的櫛孔扇貝其血細(xì)胞的季節(jié)性變化1.樣品采集和處理選取山東省青島市沙子口地區(qū)，2009年3至12月份間每月中 旬隨機(jī)采集扇貝100只，每次取樣后從所采集的扇貝中又隨機(jī)取20只扇貝按實(shí)施例2中待 檢樣品前處理的方法處理樣品；2.樣品檢測按實(shí)施例2中所提供的本試劑盒的具體使用方法對每月份所采集的 血細(xì)胞樣品進(jìn)行ELISA檢測；3.結(jié)果分析(圖4) :2009年3至12月份沙子口養(yǎng)殖地區(qū)的櫛孔扇貝其血細(xì) 胞 ELISA 檢測的 OD4tl5nm 值分別為 0. 623，0. 648，0. 598，0. 685，0. 634，0. 402，0. 385，0. 476， 0. 487和0. 542。其中3 7月份的各值均高于0. 57士0. 025 (環(huán)境脅迫與健康狀態(tài)的臨界 范圍)，該時(shí)期水溫適宜，餌料充足，扇貝生長快速，性腺飽滿，尤其是6月份，扇貝處于健康 狀態(tài)；8，9月份的各值均低于0. 47士0. 019 (環(huán)境脅迫與病原感染的臨界范圍)，該時(shí)期扇 貝繁殖期結(jié)束，體質(zhì)較為虛弱，加之水溫升高，病原增殖加快，極易處于受病原感染的狀態(tài)； 10 12月份的各值均位于0. 47士0. 019與0. 57士0. 025之間，該時(shí)期扇貝處于一個(gè)病原感 染后的恢復(fù)期，加之餌料食物的日漸缺乏，基本處于環(huán)境脅迫狀態(tài)。本發(fā)明通過對櫛孔扇貝 血細(xì)胞季節(jié)性變化的檢測，其檢測結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)的扇貝狀況基本吻合，適用于生產(chǎn)實(shí)踐 中扇貝健康狀況的評估。
權(quán)利要求
一種櫛孔扇貝血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括酶標(biāo)板，封閉液，洗滌液，酶標(biāo)記抗體，pNPP底物顯色液，磷酸鹽緩沖液，血細(xì)胞抗凝劑，其特征在于所述的試劑盒還包括抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單克隆抗體，血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的 抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單克隆抗體是通過收集抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆雜交瘤細(xì)胞1F7的 培養(yǎng)上清液，過Protein G-瓊脂糖親和層析柱，濃縮、透析、純化制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的 櫛孔扇貝血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品是通過抽取健康櫛孔扇貝的血淋巴，離心得到血細(xì)胞，重懸，超聲 波破碎制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的 封閉液為含3.0% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的 洗滌液為含0. 1% (v/v)Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的 酶標(biāo)記抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的 血細(xì)胞抗凝劑為含0. 02M EDTA的磷酸鹽緩沖液。
8.—種權(quán)利要求1所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于所述的方法包括以下步驟制備櫛孔扇貝血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品；以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品為抗原 免疫小鼠，制備血細(xì)胞單克隆抗體；選取1株免疫熒光反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽性，且能與各種類型 血細(xì)胞特異性結(jié)合的單克隆抗體作為權(quán)利要求1所述的試劑盒的抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單克 隆抗體；優(yōu)化抗原與抗體的最佳使用比例；建立檢測結(jié)果的評估標(biāo)準(zhǔn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于所述的1株免疫熒光反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽性，且能與各種類型血細(xì)胞特異性結(jié)合的單克隆 抗體是單抗1F7。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的櫛孔扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征 在于所述的檢測結(jié)果評估標(biāo)準(zhǔn)是通過高溫和病原的刺激，采集各刺激條件下的血細(xì)胞樣 品，酶聯(lián)免疫吸附法檢測其血細(xì)胞的數(shù)量變化，所得結(jié)果通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，獲得受病原 感染和環(huán)境脅迫的臨界范圍確定而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種櫛孔扇貝血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法，該試劑盒包括酶標(biāo)板、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)記抗體、pNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細(xì)胞抗凝劑、櫛孔扇貝血細(xì)胞單克隆抗體、血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品；所述試劑盒的制備方法包括以下步驟櫛孔扇貝血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備，血細(xì)胞單抗的制備，抗原與抗體最佳使用比例的優(yōu)化，以及檢測結(jié)果評估標(biāo)準(zhǔn)的建立。本發(fā)明的檢測結(jié)果可通過所建立的評估標(biāo)準(zhǔn)的判定，評估待檢扇貝受病原感染或環(huán)境脅迫等的可能，從而為監(jiān)測扇貝健康狀況提供依據(jù)。
文檔編號G01N33/531GK101846685SQ20101019109
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 林聽聽, 繩秀珍, 邢婧 申請人:中國海洋大學(xué)