一種負(fù)載bmp微球的3d打印多孔金屬支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種負(fù)載BMP微球的3D打印多孔金屬支架及其制備方法。本發(fā)明在3D打印鈦支架的每一個孔洞中，搭建一個含負(fù)載微球的三維微支架。不僅克服了現(xiàn)有技術(shù)中孔徑過大導(dǎo)致細(xì)胞只能在其孔壁二維空間上攀附生長，難以在整個孔洞內(nèi)三維層次的生長的難題，還通過在三維微支架內(nèi)填充負(fù)載rhBMP-2或rhBMP-7的殼聚糖微球，為細(xì)胞提供了更好的生長、分化環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)骨組織與支架相結(jié)合。本發(fā)明提供的含負(fù)載微球的三維微支架，使眾多由于疾病、事故等原因?qū)е碌墓墙M織缺損患者完全治愈成為可能，也可作為一種新型的椎間融合器，適用于脊柱融合手術(shù)，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
【專利說明】一種負(fù)載BMP微球的3D打印多孔金屬支架及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種含負(fù)載微球的三維微支架及其 制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鈦及其合金由于具有優(yōu)良的力學(xué)性能和生物相容性，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)骨修復(fù) 和骨植入領(lǐng)域。然而，致密的鈦及其合金的彈性模量遠(yuǎn)高于人骨模量，易造成"應(yīng)力屏蔽"效 應(yīng)，引起骨壞死、畸變和植入體松動等問題。多孔鈦及其合金由于具有獨(dú)特的孔隙結(jié)構(gòu)，擁 有與被替換的骨骼硬組織相匹配的性能，能夠有效減弱或消除應(yīng)力屏蔽效應(yīng)。因此，多孔鈦 及其合金具有廣闊的應(yīng)用前景，成為當(dāng)前研究熱點。然而，傳統(tǒng)的多孔金屬材料制備工藝的 影響因素過多、流程復(fù)雜、無法一次成型，并普遍存在孔隙結(jié)構(gòu)不能精確控制、內(nèi)部孔隙連 通率差等問題。
[0003] 3D打印通過CT等掃描數(shù)據(jù)的處理，由計算機(jī)設(shè)計構(gòu)建，可以將鈦合金打印成符合 需求的個性化多孔連通復(fù)雜結(jié)構(gòu)，不僅給骨長入提供了空間，也因為多孔結(jié)構(gòu)降低了鈦合 金的彈性模量，實現(xiàn)了與正常骨組織彈性模量的匹配，且不必?fù)?dān)心降解時間與機(jī)體需求的 不匹配，成為了 3D打印在骨科發(fā)展的重要方向。
[0004] 然而，3D打印多孔鈦合金支架本身卻沒有生物活性，沒有細(xì)胞可以識別的位點，且 目前市面上各種3D打印多孔鈦合金材料，孔徑通常較大，直徑約300-1500um，對于細(xì)胞平 均20-30um直徑來說，顯然過于空曠，細(xì)胞只能在其孔壁二維空間上攀附生長，不能實現(xiàn)在 整個孔洞內(nèi)三維層次的生長，進(jìn)而也無法實現(xiàn)支架內(nèi)長入充足的骨量。
[0005] 本發(fā)明創(chuàng)造性的在多孔鈦的每一個孔洞中，搭建一個含負(fù)載微球的三維微支架， 將給細(xì)胞的增殖、分化提供一個良好的環(huán)境。在這個體系中，多孔鈦結(jié)構(gòu)只負(fù)責(zé)提供力學(xué)強(qiáng) 度，三維微支架則提供細(xì)胞最佳生長環(huán)境，拋棄了傳統(tǒng)觀念中金屬支架的設(shè)計必須滿足最 適合細(xì)胞生長孔徑的限制，盡可能將其制備成大孔洞和高孔隙率結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)了金屬的 最少化和骨長入量的最大化；而內(nèi)部三維微支架則不再受首先滿足力學(xué)強(qiáng)度的限制，盡可 能采用最利于骨生長的材料，營造出結(jié)構(gòu)疏松、具有細(xì)胞識別位點、適合細(xì)胞攀附生長的三 維仿生微支架，為細(xì)胞提供最好的生長微環(huán)境，從而實現(xiàn)兩者的優(yōu)勢互補(bǔ)。
[0006] 此外，單純植入體內(nèi)的支架往往不能滿足臨床需要，導(dǎo)致植骨失敗，這是因為支架 植入人體后，其中心部位營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，氧分壓低，不能滿足中心部位的種子細(xì)胞生 長、增殖、分化和成骨的需要，導(dǎo)致種子細(xì)胞停止生長甚至死亡，使成骨效應(yīng)喪失，其根本 原因在于組織工程骨骨誘導(dǎo)效應(yīng)不強(qiáng)；另外，支架的成骨效應(yīng)欠佳也是制約人工骨支架發(fā) 展的一個重要原因。為此，國內(nèi)外研究了三種方法解決其骨化活性：一種是采用聯(lián)合細(xì)胞培 養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞與人工骨支架復(fù)合，將不同類型的細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，通過細(xì)胞間存在著 精細(xì)的相互調(diào)控關(guān)系來促進(jìn)細(xì)胞的生長分化。聯(lián)合細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點是活細(xì)胞能促進(jìn)成骨效 應(yīng)，但操作繁瑣，培養(yǎng)周期長，臨床不易于推廣。另外一種方法就是采用顯微外科手術(shù)來促 進(jìn)其骨誘導(dǎo)效應(yīng)，目前主要有預(yù)購帶血管蒂筋膜瓣包裹人工骨、帶血管蒂肌瓣包裹人工骨 支架。缺點也很明顯，就是先需行預(yù)購手術(shù)，增加了病人的痛苦。還有一種方法就是采用細(xì) 胞生長因子來促進(jìn)其骨誘導(dǎo)效應(yīng)，方法簡便，臨床易于推廣。相對來說，采用細(xì)胞生長因子 促進(jìn)人工骨支架骨化活性具有顯著地臨床應(yīng)用優(yōu)勢。
[0007] 本發(fā)明中為了使三維微支架植入骨組織后能夠更好誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì) 胞分化，促進(jìn)骨組織與支架相結(jié)合，發(fā)明人制備出了一種載藥緩釋三維微支架。所述載藥緩 釋三維微支架采用殼聚糖微球等良好的藥物控釋載體，rhBMP-2等具有較強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)活 性因子，制成緩釋的微球，然后通過膠原將微球充填于帶孔的的三維支架內(nèi)，制備的載藥緩 釋三維微支架為細(xì)胞提供了更好的生長環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)骨組織與支架相結(jié)合。
[0008] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的弊端，提供了一種載藥緩釋三維微支架，提高了現(xiàn)有支 架的性能，使眾多由于疾病、事故等原因?qū)е碌墓墙M織缺損患者完全治愈成為可能，給越來 越多的患者帶來希望，具有重要的臨床應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種含負(fù)載微球的支架，所述支架包括3D打印的金屬支 架、填充在3D打印的金屬支架內(nèi)部的三維微支架以及填充于三維微支架內(nèi)的負(fù)載微球。
[0010] 進(jìn)一步，通過將CT圖像導(dǎo)入三維圖像軟件，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，在計算 機(jī)中建立多孔結(jié)構(gòu)的三維模型，3D打印制得金屬支架；三維圖像軟件優(yōu)選Mimics或CAS。 優(yōu)選的，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，以平均孔柱為lOO-lOOOum、孔徑為300-3000um，以正 六面體、正十二面體結(jié)構(gòu)單位充填、擴(kuò)展該圖像，得到個性化的多孔連通三維數(shù)字模型。優(yōu) 選孔柱為300um、孔徑為1500um的正十二面體結(jié)構(gòu)單位充填、擴(kuò)展該圖像，得到個性化的多 孔連通三維數(shù)字模型。所述3D打印制得金屬支架選自多孔純鈦支架、多孔純鎂支架、多孔 鈦合金支架、多孔鉭鈮合金中的一種或幾種，優(yōu)選多孔鈦支架。
[0011] 所述三維微支架由明膠溶液、羥基磷灰石形成的凝膠組成。所述羥基磷灰石粉末 優(yōu)選為納米羥基磷灰石粉末。
[0012] 進(jìn)一步，輕基磷灰石被替換為磷酸|丐、硫酸|丐、聚酯（polyesters),聚二氧 六環(huán)酮（polydioxanone),聚富馬酸二輕丙酯（propylene fumarate，PPF)、聚原酸酯 (polyorthoesters)、聚酐（polyanhydrides)以及聚氨酯（polyurethanes)等的一種或幾 種。
[0013] 進(jìn)一步，明膠被替換為膠原、葡萄糖胺聚糖、纖維蛋白、真絲、殼聚糖、海藻酸鈉、透 明質(zhì)酸一種或幾種。
[0014] 進(jìn)一步，以戊二醛溶液或EDC/NHS作為交聯(lián)劑加入明膠溶液、羥基磷灰石形成的 混合液中。
[0015] 負(fù)載微球即"負(fù)載物"與微球載體連接制備的"負(fù)載物-載體結(jié)合物"?？梢愿纳坪?控制負(fù)載物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，實現(xiàn)附著物的緩釋和定向，提高生物利用度和治療指數(shù)。
[0016] 進(jìn)一步，所述"負(fù)載物"選自一種或幾種細(xì)胞和/或一種或幾種藥物和/或一種或 幾種生長因子和/或一種或幾種基因。
[0017] 所述細(xì)胞選自下列中的一種或幾種：軟骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0018] 所述因子選自下列中的一種或幾種：生長因子：TGFP，表皮生長因子（EGF)，血小 板衍生生長因子（PDGF)，神經(jīng)生長因子（NGF)，血管生長因子（VEGF)、集落刺激因子（CSF)， 肝細(xì)胞生長因子，胰島素樣生長因子，胎盤生長因子）；分化因子；細(xì)胞因子，例如白介素 (如 IL1，IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11，IL-12, IL-13， IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 或 IL-21，每種或 α 或 β)，干擾素（例 如IFN-α，IFN-β和IFN-γ )，腫瘤壞死因子（TNF)，IFN-Y誘導(dǎo)因子（IGIF)，骨形成蛋白 (BMP);趨化因子（如MIPs (巨噬細(xì)胞炎性蛋白），例如MIPla和MIPl β ;MCPs (單核細(xì)胞 趨化蛋白），例如MCPl，2或3 ;RANTES (調(diào)控正常T-細(xì)胞表達(dá)和分泌的激活））和營養(yǎng)因子。 例如，生長因子可選自TGF-β 1，TGF-P2, TGF-P3, TGF-P4, TGF-βδ或TGF-β超家族的 任何其他成員包括激活素類，抑制素類，以及骨形成蛋白包括BMP I，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5， BMP6, BMP7組成的組。
[0019] 所述藥物選自下列中的一種或幾種：抗感染、鎮(zhèn)痛的藥物、抗癌藥物、促進(jìn)骨愈合 藥物、防止骨溶解的藥物。進(jìn)一步的，所述藥物選自：美福仙、兩親酶素、新霉素、莫匹羅星、 多粘菌素 B、抗真菌藥、喳諾酮類、常規(guī)的鎮(zhèn)痛劑（撲熱息痛、曲馬多、可待因、奈福泮等）、非 類固醇類抗炎藥（NSAID)、AINS(酮基布洛芬、吲哚美辛）、嗎啡衍生產(chǎn)品一種或幾種。
[0020] -般來說，主要的載體物質(zhì)包括：（1)天然來源的聚合物，如膠原、纖維蛋白、 透明質(zhì)酸、大豆或藻類衍生物、殼聚糖、羥基化烷烴的聚合物等。在哺乳動物的結(jié)締組 織與骨頭的非礦物質(zhì)成分中，膠原是最常見的蛋白質(zhì)，并且在細(xì)胞浸潤和創(chuàng)傷修復(fù)中 具有一定的地位。藻酸鹽是一種在海藻表面大量存在的非免疫原性的多糖，因為其具 有凝膠性質(zhì)，在組織工程中運(yùn)用較廣。殼聚糖（chitosan)是一種由乙酰氨基葡萄糖 (N-acetyl-D-glucosamine)和甲殼質(zhì)的N-脫乙酰作用制備而成的帶正電荷的多糖，它因 具有良好的生物相容性、螯合性及可降解性而著稱。透明質(zhì)酸是另一種天然高分子，在創(chuàng)傷 修復(fù)中起著重要的作用，透明質(zhì)酸及其衍生物已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用中大范圍被 研究，其形式有凝膠、海綿、填充物和眼外科手術(shù)中的皮下注射粘膠。纖維蛋白就是一種與 凝血有關(guān)的蛋白質(zhì)，纖維蛋白膠是利用纖維蛋白原和凝血酶的反應(yīng)制成具有強(qiáng)大點合力的 纖維蛋白凝塊，其本身具有促進(jìn)毛細(xì)血管形成的作用，可以加速創(chuàng)傷的愈合。其他天然聚 合物有明膠、葡聚糖、纖維素等。（2)無機(jī)物質(zhì)和陶瓷，如羥基磷灰石、磷酸三鈣與硫酸鹽、還 有生物玻璃與金屬等。輕基磷灰石（hydroxyapatite, HA)具有骨傳導(dǎo)性，能與骨形成直接 的鍵合，從1970年開始被廣泛地用作臨床的骨替代材料，其中僅有多孔狀的羥基磷灰石被 研發(fā)為支架作為BMPs的緩釋載體（微粒、粉末、顆粒、薄片以及塊體）。無機(jī)材料中的磷酸 鈣骨水泥，陶瓷與涂層被證明為多功能的載體，被研發(fā)為可植入和可注射的載體，它們能在 體內(nèi)原位固化并且可用于傳遞生物活性生長因子（在低溫條件下避免了蛋白質(zhì)的變性）， 具有顯著的成骨效應(yīng)。生物活性玻璃是一種具有硬的、以致密硅為基礎(chǔ)的生物活性物質(zhì)，因 其良好的骨傳導(dǎo)和骨融合性能可以直接與骨形成鍵合，研究發(fā)現(xiàn)生物玻璃在體外可引導(dǎo)大 量的局部的骨形成，在體內(nèi)可增加 BMPs的效力，支持成骨細(xì)胞的生長，通過刺激表型的合 成（以堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣蛋白來標(biāo)記）促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。（3)人工合成可生 物降解聚合物，如聚乳酸、聚乙醇酸及它們的共聚物、聚乙醇酸與聚乙二醇的共聚物和生物 降解材料聚已內(nèi)酯等；聚乳酸，又稱聚丙交酯，是由單個含有羧基和羥基的聚乳酸分子脫水 縮合而成的聚合物，其降解產(chǎn)物為乳酸，可直接參與體內(nèi)代謝。（4)結(jié)合了各種材料或其他 生物分子的的復(fù)合載體材料。
[0021] 優(yōu)選殼聚糖微球負(fù)載骨形成蛋白。更優(yōu)選的，殼聚糖微球負(fù)載rhBMP-2或 rhBMP-7。
[0022] 根據(jù)不同的反應(yīng)介質(zhì)和體系特性，殼聚糖微球的制備方法可分為乳化-交聯(lián)法、 復(fù)凝聚法、噴霧干燥法和乳化-溶劑蒸發(fā)法等。此外，還有復(fù)乳法、膜乳化法、pH值調(diào)節(jié)法、 超聲-浸泡-研磨法等方法。
[0023] 乳化-交聯(lián)法
[0024] 乳化-交聯(lián)法是將殼聚糖的稀酸溶液加入到含有乳化劑的油相中，通過機(jī)械攪 拌、超聲或勻相乳化等方式得到W/0型乳液，再加入一定量的交聯(lián)劑，交聯(lián)劑擴(kuò)散到水相 中，將殼聚糖交聯(lián)成微球，經(jīng)過濾、溶劑洗滌、干燥得到最終的殼聚糖微球。
[0025] 復(fù)凝聚法
[0026] 凝聚法又稱沉淀法，在殼聚糖的稀酸溶液中邊攪拌邊緩慢滴加陰離子的沉淀劑， 如海藻酸鈉、梭甲基纖維素鈉等，降低殼聚糖的溶解度，繼續(xù)攪拌一段時間后，殼聚糖微球 即從稀酸溶液中析出。復(fù)凝聚法是利用兩種帶有相反電荷的高分子聚合物與殼聚糖以離子 間相互作用交聯(lián)形成復(fù)合微球，材料的溶解度降低，自溶液中析出，共沉淀成微球。此種方 法不需要有機(jī)溶劑，而且制備的微球載藥率高。
[0027] 噴霧干燥法
[0028] 噴霧干燥法是將殼聚糖溶液經(jīng)噴霧，霧化成微小的液滴，再與惰性的熱氣流接觸， 液滴中水分和溶劑瞬間蒸發(fā)形成殼聚糖微球。噴霧干燥法制備的殼聚糖微球主要作為藥物 載體。此方法制備快速、可重復(fù)性高，但是殼聚糖微球往往呈多孔結(jié)構(gòu)，小分子的藥物釋放 過快，再加上殼聚糖溶液經(jīng)高溫處理，容易使藥物變性或溶劑爆炸危險，因此，噴霧干燥法 一般不適用于緩釋藥物體系。
[0029] 乳化-溶劑蒸發(fā)法
[0030] 乳化-溶劑蒸發(fā)法又稱油相干燥法，在制備W/0型乳液或0/W/C)型乳液后，通過 加熱或減壓方法除去殼聚糖溶液中的有機(jī)溶劑使微球固化，也可在溶劑蒸發(fā)后對微球進(jìn)行 化學(xué)交聯(lián)。
[0031] 更優(yōu)選的，3D打印多孔鈦支架；支架內(nèi)部填充的三維微支架由I型膠原和納米級 別的羥基磷灰石形成，通過膠原將負(fù)載rhBMP-2或rhBMP-7的殼聚糖微球填充三維微支架 內(nèi)。
[0032] 進(jìn)一步的，得到含負(fù)載微球三維微支架具有多孔疏松結(jié)構(gòu)，平均直徑為 50-100 μ m〇
[0033] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種含負(fù)載微球的三維微支架的制備方法，所述制 備方法包括：
[0034] 1)將CT圖像導(dǎo)入三維圖像軟件，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，在計算機(jī)中建立多 孔結(jié)構(gòu)的三維模型；
[0035] 2)依據(jù)步驟1)中的三維模型打印支架；
[0036] 3)將明膠用去離子水溶解后，將包載有負(fù)載物的殼聚糖微球加入到膠原溶液中， 再加入納米羥基灰石粉形成濃度為5-10mg/ml的濃度，以EDC/NHS為交聯(lián)劑，將以上混合液 充分混合；
[0037] 4)將步驟3)得到的混合液滴加到支架上，并進(jìn)行冷凍干燥，得到負(fù)載微球的三維 微支架。
[0038] 進(jìn)一步，所述制備方法還包括，在得到含負(fù)載微球的三維微支架后，將含負(fù)載微球 的三維微支架進(jìn)行滅菌，獨(dú)立分裝處理。優(yōu)選將含負(fù)載微球的三維微支架放入環(huán)氧乙烷滅 菌箱中進(jìn)行滅菌。
[0039] 進(jìn)一步，明膠用去離子水溶解后，配制成0. 5_20g/ml的濃度，將包載有負(fù)載物的 殼聚糖微球按l_20mg/ml加入到膠原溶液中。
[0040] 優(yōu)選的，本發(fā)明提供的一種含負(fù)載微球的三維微支架的制備方法，所述制備方法 包括：
[0041] 1)將CT圖像導(dǎo)入Mimics或CAD等三維圖像軟件，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，平 均孔柱為lOO-lOOOum、孔徑為300-3000um，以正六面體、正十二面體結(jié)構(gòu)單位充填、擴(kuò)展該 圖像，得到個性化的多孔連通三維數(shù)字模型；
[0042] 2)采用EOS M280金屬材料3D打印機(jī)，以鈦合金（Ti-6A1-4V)為原料，依據(jù)設(shè)計模 型打印多孔鈦支架；
[0043] 3)將明膠用去離子水溶解后，配制成0. 5-20g/ml的濃度，然后將包載有rhBMP-2 或rhBMP-7的殼聚糖微球按l-20mg/ml加入到膠原溶液中，再加入納米羥基灰石粉形成濃 度為5-10mg/ml的濃度，以EDC/NHS為交聯(lián)劑，將以上混合液充分混合；
[0044] 4)將步驟3)得到的混合液滴加到支架上，并進(jìn)行冷凍干燥，得到負(fù)載微球的三維 微支架；
[0045] 5)將上述三維微支架放入環(huán)氧乙烷滅菌箱中進(jìn)行滅菌，獨(dú)立分裝處理。
[0046] 本發(fā)明的目的在于還提供上述三維微支架在骨缺損修復(fù)、及骨界面（骨一骨； 骨一支架）的融合中的應(yīng)用。當(dāng)三維微支架負(fù)載細(xì)胞和/或藥物和/或生長因子和/或基 因時，所述三維微支架還可以用于預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，減輕疼痛，有利于骨早日恢復(fù)負(fù)重功能， 促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，提高生活質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1.依據(jù)三維數(shù)字模型打印的多孔鈦支架
[0048] 圖2.負(fù)載微球的三維微支架
[0049] 圖3.負(fù)載微球的三維微支架電鏡掃描圖（3000 X)

【具體實施方式】
[0050] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實施檢測。
[0051] 實施例1制備鈦合金-明膠/HA三維微支架
[0052] 制備鈦合金-明膠/HA三維微支架：
[0053] 1)將CT圖像導(dǎo)入Mimics或CAS三維圖像軟件，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，以孔 柱為300um、孔徑為1500um的正十二面體結(jié)構(gòu)單位充填、擴(kuò)展該圖像，得到個性化的多孔連 通三維數(shù)字模型；
[0054] 2)采用EOS M280金屬材料3D打印機(jī)，以鈦合金為原料，依據(jù)設(shè)計模型打印多孔鈦 支架（見圖1);
[0055] 3)將牛膠原用去離子水溶解后，配制成lg/ml的濃度，然后將包載有rhBMP-2的殼 聚糖微球按5mg/ml加入到膠原溶液中，再加入納米輕基灰石粉形成濃度為5-10mg/ml的濃 度，用EDC/NHS為交聯(lián)劑，將以上混合液充分混合；
[0056] 4)將步驟3制得的殼聚糖微球膠原溶液滴加到支架上，并進(jìn)行冷凍干燥，得到負(fù) 載微球的三維微支架（見圖2);
[0057] 5)將上述支架放入環(huán)氧乙烷滅菌箱中進(jìn)行滅菌，獨(dú)立分裝處理。
[0058] 實施例2三維微支架的表征
[0059] 1、三維微支架孔隙率的測定
[0060] 采用改良液體位移法測量人工骨支架的孔隙率。在量筒中置入體積為Vl無水乙 醇，將三維人工骨支架材料放入量筒中，Smin后負(fù)壓抽吸空氣，使無水酒精完全充滿于支架 材料的空隙中，記錄此時的體積為VZ，再將材料取出記錄這時的酒精體積為Vs。按以下公 式計算三維仿生人工骨支架的孔隙率：
[0061] 孔隙率=(V1-V3V(V2_V3) X100%
[0062] 2、三維微支架力學(xué)性能分析
[0063] 采用萬能力學(xué)機(jī)測定支架材料的壓縮力學(xué)性能。以BAM人工骨作為對照。加載速 度為5mm/min，支架材料壓扁的最大壓力為F (N)，根據(jù)公式P = F/A (A為受壓面積），求得抗 壓強(qiáng)度。根據(jù)公式E= σ/ε求得彈性模量。為應(yīng)力，ε為應(yīng)變）。
[0064] 結(jié)果見表1。
[0065] 表1三維微支架的表征

【權(quán)利要求】
1. 一種三維微支架，所述支架包括3D打印的金屬支架、填充在3D打印的金屬支架內(nèi)部 的三維微支架以及填充于三維微支架內(nèi)的負(fù)載微球。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述金屬支架選自多孔純鈦支架、 多孔純鎂支架、多孔鈦合金支架、多孔鉭鈮合金中的一種或幾種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述三維微支架由明膠溶液、納米 羥基磷灰石組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述負(fù)載微球中的負(fù)載物選自一 種或幾種細(xì)胞和/或一種或幾種藥物和/或一種或幾種生長因子和/或一種或幾種基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的三維微支架，其特征在于，所述細(xì)胞選自下列中的一種或 幾種：軟骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；所述因子選自下 列中的一種或幾種：生長因子、細(xì)胞因子、分化因子、趨化因子、MCPs單核細(xì)胞趨化蛋白、 RANTES和營養(yǎng)因子；所述藥物選自下列中的一種或幾種：抗感染、鎮(zhèn)痛的藥物、抗癌藥物、 促進(jìn)骨愈合藥物、防止骨溶解的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的三維微支架，其特征在于，所述因子選自下列中的一種或幾 種：TGFP，表皮生長因子EGF，血小板衍生生長因子TOGF，神經(jīng)生長因子NGF，血管生長因子 VEGF、集落刺激因子CSF，肝細(xì)胞生長因子，胰島素樣生長因子，胎盤生長因子；白介素，干 擾素，腫瘤壞死因子TNF，IFN-y誘導(dǎo)因子IGIF，骨形成蛋白BMP ;MIPs巨噬細(xì)胞炎性蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述微球選自天然來源的聚合物、 無機(jī)物質(zhì)和陶瓷、人工合成可生物降解聚合物或結(jié)合了各種材料或其他生物分子的的復(fù)合 載體材料中的一種或幾種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述微球選自下列中的一種或幾 種：膠原、透明質(zhì)酸、大豆或藻類衍生物、羥基化烷烴的聚合物、殼聚糖、明膠、葡聚糖、纖維 素；羥基磷灰石、磷酸三鈣、硫酸鹽、生物玻璃；聚乳酸、聚乙醇酸及它們的共聚物、聚乙醇 酸與聚乙二醇的共聚物、生物降解材料聚已內(nèi)酯。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述負(fù)載微球為負(fù)載rhBMP-2或 rhBMP-7的殼聚糖微球。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微支架，其特征在于，所述三維微支架具有多孔疏松結(jié) 構(gòu)，平均直徑為50-100 iim。
11. 一種三維微支架的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括： 1) 將CT圖像導(dǎo)入三維圖像軟件，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，在計算機(jī)中建立多孔結(jié) 構(gòu)的三維模型； 2) 依據(jù)步驟1)中的三維模型打印支架； 3) 將明膠用去離子水溶解后，將包載有負(fù)載物的負(fù)載微球加入到膠原溶液中，再加入 納米羥基灰石粉形成濃度為5-10mg/ml的濃度，并加入EDC/NHS為交聯(lián)劑來交聯(lián)明膠，將以 上混合液充分混合； 4) 將步驟3)得到的混合液滴加到支架上，并進(jìn)行冷凍干燥，得到負(fù)載微球的三維微支 架。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法中明膠溶用去離子 水溶解后，配制成〇. 5-20g/ml的濃度，然后將包載有負(fù)載物rhBMP-2或rhBMP-7的殼聚糖 微球按l-20mg/ml加入到膠原溶液中。
13.權(quán)利要求1-10任意一項所述的三維微支架或權(quán)利要求11-12任意一項所述的制備 方法在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/46GK104353121SQ201410682987
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】吳貴, 尹博, 王海, 吳志宏, 邱貴興 申請人:吳志宏