專利名稱：三嗪衍生物、含所述衍生物的組合物以及使用所述衍生物治療癌癥和自身免疫性疾病的方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2007年4月30日遞交的臨時申請60/924,111的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及下式的化合物
其中X是氟或氯；Y是氧、硫或亞氨基；R是氨基、羥基、氨磺?；蝓０被蚱銷-一甲基或N-二甲基類似物；m是2至6的整數(shù)；且n是0至2的整數(shù)。所述化合物可用于治療某些癌癥和自身免疫性疾病。

背景技術(shù)：
癌癥指具有一百多種臨床不同形式的疾病。幾乎機(jī)體的每個組織都能產(chǎn)生癌癥，一些甚至能夠產(chǎn)生幾種類型的癌癥。癌癥以能夠侵襲原組織或擴(kuò)散至其他部位的細(xì)胞異常生長為特征。事實上，特定癌癥的嚴(yán)重程度或其惡性程度基于癌細(xì)胞侵襲鄰近組織和擴(kuò)散的傾向。也就是說，各種人類癌癥(例如惡瘤)在它們從原發(fā)部位或腫瘤擴(kuò)散以及通過機(jī)體轉(zhuǎn)移的能力方面明顯不同。的確，正是腫瘤轉(zhuǎn)移的過程對癌癥患者長期生存有害。外科醫(yī)生能夠去除原發(fā)腫瘤，但是轉(zhuǎn)移的癌癥通常到達(dá)太多地方而不允許進(jìn)行外科治愈。為成功轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞必需從它們的原發(fā)部位脫離，侵入血管或淋巴管，在循環(huán)中行進(jìn)到新的部位，并在該處建立腫瘤。
十二種主要的癌癥是前列腺、乳房、肺、結(jié)直腸、膀胱、非何杰金氏淋巴瘤、子宮、黑色素瘤、腎、白血病、卵巢和胰腺癌。黑色素瘤是主要癌，并因其轉(zhuǎn)移至體內(nèi)包括淋巴結(jié)、肺、肝臟、腦和骨在內(nèi)的大多數(shù)器官的能力而成為增長的全球健康問題。具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的臨床結(jié)果比在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移看到的結(jié)果要顯著的較差。具有肺轉(zhuǎn)移的患者的平均生存時間是11個月，而具有肝臟、腦和骨轉(zhuǎn)移的患者為四個月。四種類型的治療法用于黑色素瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移手術(shù)、放療、化療和免疫治療。手術(shù)最通常用于改善患者的生活質(zhì)量，例如去除阻塞胃腸道的轉(zhuǎn)移。放療在轉(zhuǎn)移的局部控制中具有一定程度的效果，但是主要限于皮膚和/或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。已評價了許多化療藥用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。不過，僅兩種細(xì)胞毒性藥物能夠獲得10％或更高的反應(yīng)率。這些藥物是達(dá)卡巴嗪(DTIC)和亞硝基脲。在大多數(shù)國家中僅僅DTIC被批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤。后來，用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的手術(shù)、放療和化療的臨床顯著的、有益的、長期的效果的缺乏導(dǎo)致使用免疫治療。迄今，對細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2和干擾素α給予了最多的關(guān)注。臨床試驗用白細(xì)胞介素2獲得了較好的結(jié)果，但是平均僅15％的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者表現(xiàn)出對應(yīng)白細(xì)胞介素2的腫瘤負(fù)荷的顯著降低。
與黑色素瘤類似，其他癌癥也是一旦轉(zhuǎn)移發(fā)生，則變得嚴(yán)重威脅生命。胰腺癌癥在轉(zhuǎn)移(例如第一次診斷)發(fā)生后具有3％的超過一年的生存機(jī)會。當(dāng)用細(xì)胞毒性藥物吉西他濱治療時這僅僅增加到18％，當(dāng)用吉西他濱、特羅凱和EGFr激酶抑制劑治療時為24％。前列腺癌癥只要癌癥局限于前列腺則能夠通過手術(shù)或放射成功地控制。但是一旦轉(zhuǎn)移發(fā)生，尤其是如果雄激素剝奪治療失敗，則獲得小的有效治療。
其他癌癥可以比黑色素瘤、胰腺或前列腺癌癥更有效地用化療藥治療。不過，化療藥具有兩個主要的限制。第一，化療藥對癌細(xì)胞是非特異性的，特別是在高劑量時，它們對正常的快速分裂細(xì)胞具有毒性。第二，隨著時間癌細(xì)胞對化療藥產(chǎn)生耐藥，從而不再對患者提供益處。如對黑色素瘤所述，已開發(fā)了其他治療形式以解決由使用化療藥引起的限制。雖然如此，但是這些其他治療法對于其他癌癥的治療具有有限的成功。其他癌癥治療法及其限制的實例包括手術(shù)(不能完全去除廣泛轉(zhuǎn)移)，放射(不能選擇性遞送放射至癌細(xì)胞)，以及免疫治療(毒性細(xì)胞因子的使用具有有限的效果)。因此。其他較新的治療方法正在開發(fā)(例如抗血管生成劑、凋亡劑、基因治療)，但是這些治療相對而言處于其幼年期。因此，仍需要由新的化療藥所例證的新的方法，所述化療藥是有效的(例如降低腫瘤大小或轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散)、對于癌癥的治療具有有限的毒性、延長產(chǎn)生藥物耐藥的時間以及它們的任何組合。
發(fā)明概述 在一個實施方案中，提供化合物、含有所述化合物的組合物以及制備藥物的方法。
在另一個實施方案中，它們可以通過對至少一些癌癥的治療具有降低的毒性的有用的作用機(jī)制起作用。盡管它們可以單獨(dú)用于治療癌癥，但是更有效的治療可以包括使用所述化合物與其他抗癌藥物或療法的組合。所述化合物和化療藥的組合的使用可以提供有潛力的方法，該方法解決上述使用化療引起的限制藥物毒性和藥物耐藥。因此，所述化合物可以比其他化療藥具有相對小的毒性，如由細(xì)胞毒性和動物數(shù)據(jù)所證明，以及特別是如果當(dāng)與本發(fā)明的化合物組合使用化療藥的劑量能被降低時，它們的不同作用機(jī)制應(yīng)減少化療藥的耐藥。所述化合物可以用在制備用于治療癌癥的藥物中。
在另一個實施方案中，它們可以通過對至少一些自身免疫性疾病的治療具有降低的毒性的有用的作用機(jī)制來起作用。盡管它們可以單獨(dú)治療自身免疫性疾病，但是更有效的治療可以包括使用所述化合物與其他抗炎藥物或療法的組合。所述化合物可以用在制備用于治療自身免疫性疾病的藥物中。
從以下描述和權(quán)利要求書以及其中的概括，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的其他方面將是清楚的。
附圖的簡要說明

圖1顯示化合物V對PC-3細(xì)胞對多種基質(zhì)(A)層粘連蛋白，(B)MATRIGELTM基底膜基質(zhì)或(C)膠原的粘附的效果。
圖2顯示不同化合物對B16F10原發(fā)性黑色素瘤的抗腫瘤效果。在圖2A中比較化合物I、化合物II或阿霉素的作用。在圖2B中比較化合物V或環(huán)磷酰胺的作用。
圖3顯示化合物II、化合物IV、化合物V或環(huán)磷酰胺靜脈內(nèi)給予對DA-3乳房腫瘤的抗腫瘤效果。
圖4顯示化合物組合靜脈內(nèi)給予對DA-3乳房腫瘤的抗腫瘤效果。在圖4A中比較化合物II、環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺+化合物II的效果。在圖4B中比較化合物I、環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺+化合物的效果。在圖4C中比較化合物V、環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺+化合物V的作用。
圖5顯示與化合物VII和順鉑組合相比，單獨(dú)口服給予順鉑對DA-3乳房腫瘤的抗腫瘤功效。
圖6顯示化合物I、化合物II、化合物V或乙酰水楊酸對P815肥大細(xì)胞瘤的抗腫瘤功效。
圖7顯示化合物II對LL/2肺腫瘤的抗腫瘤功效。在圖7A中比較化合物II和順鉑的效果。在圖7B中比較化合物II單獨(dú)、環(huán)磷酰胺單獨(dú)、環(huán)磷酰胺+化合物II的組合的效果。
圖8顯示化合物II、化合物III、化合物VII或環(huán)磷酰胺對LL/2肺腫瘤的抗腫瘤功效。
圖9顯示化合物I、化合物V或吉西他濱對PAN02胰腺腫瘤的抗腫瘤功效。
圖10顯示化合物化合物II單獨(dú)(圖10A)、環(huán)磷酰胺+化合物II的組合(圖10B)對PC-3前列腺腫瘤的抗腫瘤功效，并比較化合物V和環(huán)磷酰胺+化合物V的組合(圖10C)。
圖11顯示化合物V對從J774A.1細(xì)胞由LPS誘導(dǎo)釋放的PGE2抑制的效果。
圖12顯示化合物I對NZB x NZW小鼠死亡率的效果。
圖13顯示靜脈內(nèi)給予化合物I對遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)發(fā)展的效果初次激發(fā)(圖13A)和第二次激發(fā)(圖13B)。
圖14顯示靜脈內(nèi)給予化合物II對遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)發(fā)展的效果初次激發(fā)(圖14A)和第二次激發(fā)(圖14B)。
圖15顯示由DTH后的耳厚來測定的口服給予化合物IV或化合物V對炎癥的效果。
圖16顯示口服給予化合物III對遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)發(fā)展的效果初次激發(fā)(圖16A)和第二次激發(fā)(圖16B)。
圖17顯示由DTH后的耳厚來測定的靜脈內(nèi)給予化合物X或化合物XI對炎癥的效果。
圖18顯示口服給予化合物I、化合物IV或化合物V對佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(AIA)的效果。
圖19顯示靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的血白細(xì)胞計數(shù)的效果。
圖20顯示靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后兩小時大鼠氣囊模型中不同可溶性介質(zhì)TNFα(圖20A)、PGE2(圖20B)、LTB4(圖20C)或MCP-1(圖20D)的產(chǎn)生的效果。
圖21顯示靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后十二小時大鼠氣囊模型中不同可溶性介質(zhì)TNFα(圖21A)或PGE2(圖21B)的產(chǎn)生的效果。
圖22顯示化合物V對遠(yuǎn)端結(jié)腸大體損傷的抑制。
圖23顯示化合物V對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的臨床癥狀的效果。
發(fā)明的某些實施方案的描述 本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物通過下式描述
其中X是F或Cl； Y是NH、O或S； R是NH2、OH、SO2NH2、SO2N(CH3)H、SO2N(CH3)2或CONH2； m是2、3、4、5或6；且 n是0、1或2，其中二碳片段(n＝2)可以由 Z＝H或OH的

代表。
在優(yōu)選的實施方案中，可以使用以下的一個或多個 X＝F；和/或 Y＝NH或O；和/或 R＝NH2、OH、SO2NH2或SO2N(CH3)2；和/或 m＝4、5或6；和/或 n＝2。
特別優(yōu)選的是具有以下結(jié)構(gòu)的化合物I-XI
盡管以上通式描述了一些化合物，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在所述式之外但是是顯而易見的某些結(jié)構(gòu)修飾落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，可能合成苯環(huán)上不含鹵素取代的上述化合物。制備了這些化合物，但是觀察到它們通常比一氯-或氟苯基-取代的三嗪化合物更具毒性。類似地，二鹵代苯基取代的三嗪化合物落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，盡管所述通式描述了對位取代(氨基、羥基、氨磺酰等)的苯乙基化合物，但是可能這些取代還能在苯乙基基團(tuán)的苯環(huán)部分的鄰位或間位上。最后，取代的苯乙基基團(tuán)的乙烯基部分能夠被具有苯環(huán)的不飽和乙烯基部分或稠環(huán)(五或六元環(huán))結(jié)構(gòu)所替代，以引入具有比苯乙基基團(tuán)小的自由度的結(jié)構(gòu)或更大的硬化。
治療癌癥的一個新方法在于有效降低腫瘤大小和/或轉(zhuǎn)移擴(kuò)散并且還能夠減少炎癥的新化合物的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的化合物可以滿足這一類用于治療癌癥的新化合物的要求。也就是，同時表現(xiàn)顯著的抗癌和抗炎特征的化合物提供有潛力的雙管齊下的方法，該方法靶向遺傳不穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞(高突變率和隨后的化療耐受)和在炎癥組織中存在的遺傳正常細(xì)胞兩者。
該治療癌癥的雙管齊下的方法因?qū)β匝装Y和之后的癌癥的發(fā)生之間存在的聯(lián)系的增加的認(rèn)識而更引人注目。該慢性炎癥通常又是持續(xù)的非生命威脅的(當(dāng)時)病毒或細(xì)菌感染的結(jié)果。的確，許多特定的癌癥的病因可能與特定病原體直接相關(guān)。例如，人乳頭瘤病毒、乙肝或丙肝病毒和E-B病毒(Epstein-Barr virus)分別是子宮頸癌、肝細(xì)胞癌和淋巴增殖性障礙的危險因素。幽門螺桿菌是胃癌的主要原因之一。最近發(fā)現(xiàn)與口腔中較高數(shù)量的細(xì)菌存在相關(guān)的慢性炎癥性病癥牙周(齒齦)疾病與顯著更高的發(fā)生胰腺癌的危險相關(guān)。
癌癥和炎癥之間的聯(lián)系看起來具有其分子水平的根源。與炎癥或促炎免疫反應(yīng)相關(guān)的分子與癌癥的進(jìn)展相關(guān)。例如，因為其調(diào)節(jié)其他促炎細(xì)胞因子(例如IL-I、IL-6、IL-8和GM-CSF)的產(chǎn)生，腫瘤壞死因子(TNFα)可看作是最重要的促炎細(xì)胞因子。有趣的是，給予帶有腫瘤的動物高劑量的TNFα顯示抗癌活性。不過，由重組TNFα進(jìn)行的I期臨床試驗所證實，這在人中沒有轉(zhuǎn)變?yōu)轱@著的抗癌活性。更重要的是，TNFα在一些人腫瘤中表達(dá)，其存在通常與差的預(yù)后相關(guān)。的確，看起來在腫瘤微環(huán)境中慢性產(chǎn)生的相對低濃度的內(nèi)源性TNFα增加了腫瘤發(fā)生和播散。也就是，TNFα的抗癌活性僅在該細(xì)胞因子的超生理濃度時觀察到。最近被假設(shè)在癌癥和炎癥之間提供聯(lián)系的另一個分子或一組蛋白分子是轉(zhuǎn)錄因子NFκB。DNA結(jié)合蛋白家族NFκB可能是哺乳動物細(xì)胞中最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活因子。該轉(zhuǎn)錄因子激活包括幾種促炎細(xì)胞因子(包括TNFα)和趨化因子在內(nèi)的多種蛋白的生物合成。如以上對TNFα所述，許多癌癥增加了NFκB活性。用許多小鼠模型的工作闡述了NFκB的持續(xù)性激活可能將炎癥與腫瘤促進(jìn)和進(jìn)展聯(lián)系起來的機(jī)制。該工作最近由Karin & Greten(Nature Immunology，5749-759，2005)所綜述?？梢灾委煹淖陨砻庖咝约膊〉膶嵗P(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性或銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、銀屑病、克隆氏病、炎癥性腸病、強(qiáng)直性脊柱炎、干燥綜合征、斯蒂爾病(巨噬細(xì)胞活化綜合征)、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎、硬皮病、肌炎、賴特綜合征、韋格納綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)、腎小球腎炎和血管炎。
本發(fā)明的化合物作用于上述癌癥和炎癥之間分子連接中的至少之一的能力的一個指標(biāo)，TNFα，在實施例21和22中闡述。在這些實施例中，顯示在基于細(xì)胞的測定(WEHI-13VAR和J774A.1細(xì)胞)中本發(fā)明的化合物可以拮抗TNFα的促炎活性。也就是說，由它們抑制TNFα誘導(dǎo)的WEHI-13VAR細(xì)胞系中的凋亡或細(xì)胞毒性以及抑制J774A.1細(xì)胞系中LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的能力所證實，這些化合物可以抑制TNFα的效果。
本發(fā)明的化合物作用于上述癌癥和炎癥之間其他分子連接的能力的另一個指標(biāo)，花生四烯酸代謝物，在實施例28中闡述。在該實施例中，在LPS誘導(dǎo)的氣囊模型中表明，本發(fā)明的化合物誘導(dǎo)對前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)的產(chǎn)生的抑制。另外關(guān)于它們的促炎特性，已有文獻(xiàn)很好地報道，在前列腺癌、乳癌和結(jié)腸癌中類花生酸途徑被激活。環(huán)氧合酶(COX；前列腺素)和脂氧合酶(LOX；白三烯)代謝物通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、移動、侵入以及血管生成來參與疾病的進(jìn)展。也就是說，由它們在氣囊模型中抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥的能力所證實，這些化合物可以通過它們對PGE2和LTB4產(chǎn)生的抑制作用來抑制癌癥和炎癥性疾病。
本發(fā)明的化合物包括全部藥學(xué)上可接受的衍生物，例如其鹽和前藥形式以及類似物和任何幾何異構(gòu)體和對映異構(gòu)體?？梢灾苽浠钚曰衔锏闹苿┮员阋赃m合于腸道、粘膜(例如舌下、肺和直腸)、腸胃外(例如肌內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))或局部(例如軟膏、乳膏和洗劑)給藥的形式提供藥物組合物。特別地，本發(fā)明的組合物可以溶解在醇或多元醇溶劑(例如來自BASF的

HS 15 12-羥基硬脂酸的聚氧乙烯酯、甘油、乙醇等)，單糖或二糖的水性溶液或任何其他生物相容的溶劑例如二甲基亞砜(DMSO)或CREMOPHOR

聚乙氧基蓖麻油(也來自BASF)中。適宜地，所述制劑可以方便地存在于分開的劑量單元中，并可以通過藥物制劑領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。全部方法，包括將活性藥物成分與液體載體或微細(xì)固體載體或者根據(jù)需要規(guī)定與兩者置于一起的步驟。適宜地，調(diào)整上述制劑以提供活性藥物組分的緩釋。本領(lǐng)域熟知的緩釋制劑包括使用團(tuán)注、連續(xù)輸注、生物相容性聚合物或脂質(zhì)體。
可以進(jìn)行給藥劑量和時間、制劑和給藥途徑的合適選擇，實現(xiàn)在哺乳動物中的有利反應(yīng)的目標(biāo)(即功效)以及避免對其產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)亩拘曰蚱渌麚p害(即安全性)。因此，“有效的”是指這樣的選擇，其包括對病癥的常規(guī)操作以實現(xiàn)期望的效果例如降低癌癥或自身免疫性疾病患者的發(fā)病率或死亡率；降低癌細(xì)胞生長或轉(zhuǎn)移；改變細(xì)胞周期或凋亡；降低或者改善與對機(jī)體成分(器官和組織例如腎上腺、眼、腎、肝、肺、胰腺、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、滑膜關(guān)節(jié)、甲狀腺等)的免疫反應(yīng)相關(guān)的組織損傷；恢復(fù)免疫狀態(tài)或使哺乳動物的病理性障礙/病癥(抗體滴度、免疫細(xì)胞亞型、通過細(xì)胞因子或趨化因子的信號傳導(dǎo)、抗體-抗原免疫復(fù)合物等)正?；?；從循環(huán)中去除游離抗體和/或抗體-抗原免疫復(fù)合物；改善自身免疫性疾病的實驗室指標(biāo)(炎癥可溶性介質(zhì)的濃度或絕對量、自身抗體的存在、細(xì)胞增殖等)；增加常規(guī)化療或抗炎癥藥物治療的功效；以及它們的組合。特別地，常規(guī)化療或抗TNFα治療的有害作用可以避免。哺乳動物可以是動物或人患者。
給予的化合物的量取決于多種因素，例如化合物的生物活性和生物利用度(例如體內(nèi)半衰期、穩(wěn)定性和代謝)；所述化合物的化學(xué)性質(zhì)(例如分子量、疏水性和溶劑度)；給藥途徑和方案；等等。還要理解對于任何具體患者要達(dá)到的特定劑量水平可能取決于多種因素，包括年齡、健康、醫(yī)療史、體重、與一種或多種其他化合物的組合以及疾病的嚴(yán)重程度。
術(shù)語“治療”特別是指降低或減輕癌癥或自身免疫性疾病的一個或多個癥狀。對于給定患者，癥狀的改善、其惡化、消退或進(jìn)展可以通過客觀或主觀測量確定。
最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解，本文對治療所指包括預(yù)防以及確立的癌癥或自身免疫性疾病的治療。因此，例如，本發(fā)明的化合物可以在手術(shù)去除原發(fā)腫瘤后或在手術(shù)或侵襲性化療之前或甚至在患者緩解時使用。當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療法相比，在體內(nèi)小鼠研究中觀察到的所述化合物的相對缺乏毒性(例如如在以下的實施例中所觀察到的)允許具有比用常規(guī)療法可取得的更大的預(yù)防應(yīng)用。類似地，本發(fā)明的化合物可以與其他現(xiàn)有的癌癥或自身免疫性疾病治療模式或用于治療癌癥的試劑(例如細(xì)胞毒性藥物、血管生成抑制劑、免疫刺激劑、蛋白激酶抑制劑)或自身免疫性疾病的試劑(例如抗炎皮質(zhì)類固醇、非甾體抗炎藥、甲氨蝶呤、DMARDs、生物劑例如重組蛋白或單克隆抗體)組合使用?？捎糜谂c一個或多個本發(fā)明的化合物一起使用的化療藥的實例包括達(dá)卡巴嗪、阿霉素、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、長春堿、長春新堿、博萊霉素、足葉乙甙、托泊替康、伊立替康、泰索帝、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、賽特鉑和苯丁酸氮芥。可以與一個或多個本發(fā)明的化合物一起使用的治療劑的實例包括阻斷TNFα與其受體結(jié)合或之后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的那些(例如特異性地與TNFα、抗TNFα抗體、可溶性TNFα受體、小于1000MW的非蛋白質(zhì)化合物結(jié)合的重組蛋白)。要給予的化合物的劑量最終由腫瘤專家、風(fēng)濕病專家或其他醫(yī)生所決定。不過，一般而言，劑量在約1至約75mg/kg/日的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，范圍為約2至約50mg/kg/日。
以下的實施例進(jìn)一步例示本發(fā)明的實踐，但是無意于限制本發(fā)明。
實施例 用于制備可用于本發(fā)明中的化合物的一般合成順序概括在途徑1和途徑2(路線1)中。途徑1例示氰尿酰氯與鹵代苯胺反應(yīng)得到二氯-三嗪中間體。然后，加入芳基或芳烷基胺，之后烷基胺。途徑2例示如途徑1中所述的二氯-三嗪中間體的制備，然后首先與烷基胺反應(yīng)，然后加入芳基或芳烷基胺。最后步驟是除去保護(hù)基。
路線1
試劑(a)鹵代苯胺，丙酮/水，-10℃→r.t.；(b)烷基二胺或烷醇胺或硫代烷基胺，NaHCO3/H2O/THF/丙酮，r.t.；(c)

NaHCO3，丙酮/H2O；(d)烷基二胺或烷醇胺或硫代烷基胺，THF/MeOH，130℃/10min，微波；(e)

Et3N，THF，65℃；(f)去除保護(hù)基(當(dāng)適用時)。
儀器 所有的HPLC色譜和質(zhì)譜均使用二極管陣列檢測器在HP 1100 LC-MSAgilent裝置上記錄。使用6分鐘內(nèi)含0.01％TFA的1％-40％乙腈-水梯度且流速為2ml/min(方法1)的分析C18柱(75x 4.6mm，5微米)，6分鐘內(nèi)含0.01％TFA的15-99％乙腈-水梯度且流速為2ml/min(方法2)的分析C18柱(75x4.6mm，5微米)，5分鐘內(nèi)含0.01％TFA的0.1％-20％乙腈-水梯度且流速為1ml/min(方法3)的分析C18柱(75x4.6mm，5微米)，或者5分鐘內(nèi)含0.01％TFA的1％-50％乙腈-水梯度且流速為1ml/min(方法4)的分析C18柱(75x4.6mm，5微米)。
實施例1化合物I的合成(途徑1的代表性實施例)。

將氰尿酰氯(10.0g，54.2mmol)以較低比例加入到水(50ml)和丙酮(50ml)的冷(-10℃)混合物中。將在丙酮(50ml)中的3-氟苯胺(5.2ml，54.2毫摩爾)溶液經(jīng)50分鐘緩慢加入，保持反應(yīng)物溫度低于-5℃。然后將反應(yīng)物在室溫下攪拌一小時。用飽和碳酸氫鈉水溶液(200ml)將反應(yīng)物的pH從2調(diào)節(jié)到8，并繼續(xù)攪拌另外30分鐘。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，并真空干燥。這得到2，4-二氯-3-氟苯基氨基-1，3，5-三嗪，為白色固體13.3g，收率94％；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ6.97-7.01(1H，m)，7.38-7.43(2H，m)，7.52-7.55(1H，m)，11.25(1H，br)；LRMS(ESI)m/z 259(MH+)；HPLC(方法2)4.1min。下一步驟中使用該產(chǎn)物，沒有進(jìn)一步純化。在室溫下將該二氯-三嗪衍生物(6.4g，24.7毫摩爾)溶解在THF(70ml)中，并用在丙酮(50ml)和水(50ml)混合物中的5-(叔丁氧羰基氨基)戊胺(7.5g，37.0毫摩爾)的溶液處理。然后將得到的溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液(70ml)處理。將反應(yīng)物在室溫下攪拌2.5小時至3小時。然后將混合物真空濃縮，用水稀釋，并用乙酸乙酯萃取。將合并的有機(jī)萃取液用飽和氯化鈉水溶液、2M HCl水溶液、飽和氯化鈉、飽和碳酸氫鈉以及飽和氯化鈉洗滌，然后干燥(硫酸鎂-木炭)，通過CELITE硅藻土過濾，并真空濃縮至200ml。將該溶液在攪拌下傾倒入1.2L的己烷中，并通過過濾收集沉淀物，用己烷洗滌，并真空干燥，得到一氯-[1，3，5]三嗪衍生物，為白色固體6.6g，收率63％；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.23-1.30(2H，m)，1.31-1.56(2H，m)，1.34(9H，s)，1.44-1.56(2H，m)，2.85-2.91(2H，m)，3.20-3.30(2H，m)，6.70-6.77(1H，m)，6.79-6.85(1H，m)，7.25-7.33(1H，m)，7.38-7.43(1H，m)，7.67-7.75 & 7.76-7.85(1H，br)，8.14-8.21 & 8.22-8.30(1H，br)，10.05-10.11 & 10.15-10.26(1H，br)；LRMS(ESI)m/z 425(MH+)，447(MH+Na)；HPLC(方法2)4.5min。用酪胺(6.4g，46.7毫摩爾)和三乙胺(77.7mmol，10.9ml)處理在THF(300ml)中的一氯-三嗪(6.6g，15.6毫摩爾)溶液。將反應(yīng)物在65-70℃下加熱16小時至60小時，然后冷卻至室溫，并真空濃縮。將殘余物用乙酸乙酯萃取，并過濾。將濾液用1M HCl水溶液、飽和氯化鈉、飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉洗滌，然后干燥(硫酸鎂-木炭)，經(jīng)CELITE硅藻土過濾，并真空濃縮。然后將殘余物溶解在乙醚(150ml)中，并將該溶液在劇烈攪拌下逐滴加入到1.4L己烷中。通過過濾收集沉淀的固體，并真空干燥，獲得三(氨基-取代)-[1，3，5]三嗪衍生物，為灰白色固體6.5g，收率80％；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.21-1.29(2H，m)，1.32-1.41(2H，m)，1.34(9H，s)，1.44-1.54(2H，m)，2.65-2.71(2H，m)，2.88(2H，dt，J＝6.5，6.5Hz)，3.15-3.27(2H，m)，3.33-3.42(2H，m)，6.61-6.70(1H，m)，6.67(2H，d，J＝8.5Hz)，6.71-6.76(1H，m)，6.84-7.02(1H，m)，7.01(2H，d，J＝8.5Hz)，7.16-7.23(1H，m)，7.39-7.47(1H，m)，7.87-7.91(1H，m)，8.92-8.94 & 9.00-9.06(1H，2x br)，9.13(1H，s)；LRMS(ESI)m/z 526(MH+)，548(MH+Na)；HPLC(方法2)2.9min。將在4M HCl/l，4-二噁烷(100ml)和水(10ml)中的Boc-保護(hù)的化合物(6.5g，12.4毫摩爾)溶液在室溫下攪拌2小時。真空蒸發(fā)溶劑和過量的酸，通過用異丙醇(25ml)共蒸發(fā)(x2)去除痕量的水。將干燥的殘余物溶解在異丙醇(25ml)中，并在劇烈攪拌下將溶液逐滴加入乙醚(450ml)中。通過過濾收集沉淀的固體，真空干燥，然后溶解在無熱原的水(800ml)中，過濾(0.22μm)并凍干，得到脫保護(hù)的化合物I，為灰白色固體5.5g，收率89％；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.26-1.35(2H，m)，1.47-1.57(4H，m)，2.64-2.73(4H，m)，3.24-3.31(2H，m)，3.32-3.55(5H，m，CH2+NH3+)，6.63(2H，d，J＝8.5Hz)，6.82-6.89(1H，m)，6.93-7.06(2H，m)，7.24-7.39(2H，m)，7.61-7.73(1H，m)，7.81-7.93(3H，m)，8.15-8.25，8.40-8.60，9.10-9.30，10.25-10.40 & 10.55-10.65(2H，br)；19F NMR(376.5MHz，CD3OD)δ-114.50至-113.84(1F，m)；LRMS(ESI)m/z 426(MH+)，448(MH+Na)；HPLC(方法2)1.6min。
實施例2化合物V的合成(途徑2的代表性實施例)。

根據(jù)實施例1，使用4-氟苯胺(18ml，190mmol)代替3-氟苯胺制備2，4-二氯-4-氟苯基氨基-1，3，5-三嗪，得到白色固體44.3g，收率90％；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ；LRMS(ESI)m/z 259(MH+)HPLC(方法2)4.0min。根據(jù)實施例1，使用酪胺代替5-(叔丁氧羰基氨基)戊胺，將二氯-三嗪(44.2g，0.2摩爾)與酪胺(35.1g，0.3摩爾)偶聯(lián)，得到白色固體56.1g，收率91％；LRMS (ESI)m/z 360(MH+)，382(MH+Na)；HPLC(方法2)3.7min。將在四氫呋喃(125ml)和甲醇(60ml)中的一氯三嗪(15.0g，41.8毫摩爾)和1，5-二氨基戊烷(24.5ml，209毫摩爾)溶液分成九部分。將各部分在化學(xué)微波裝置中在130℃下加熱10分鐘。然后將各部分合并，真空濃縮，并將殘余物溶解在乙酸乙酯中。用水和飽和氯化鈉洗滌乙酸乙酯溶液，然后用2M HCl水溶液萃取。將水性萃取液用乙酸乙酯洗滌，然后用飽和的碳酸氫鈉水溶液堿化。將沉淀物用乙酸乙酯萃取，用飽和氯化鈉洗滌萃取液，然后干燥(硫酸鎂-木炭)，通過CELITE硅藻土過濾，并真空濃縮。將殘余物溶解在甲醇(300ml)中，用在乙醚(60ml)中的1M HCl溶液處理該溶液，真空濃縮該溶液。將殘余物溶解在熱異丙醇(150ml)中，并在劇烈攪拌下將該溶液逐滴加入乙醚(1.5L)中。通過過濾收集沉淀的固體，真空干燥，然后溶解在無熱原的水(1.6L)中，過濾(0.22μm)并凍干，得到化合物V，為其鹽酸鹽14.9g，收率72％；mp130-133℃；1H NMR(400MHz，D2O)δ1.16-1.27(2H，m)，1.37-1.54(4H，m)，2.53-2.64(2H，m)，2.76-2.83(2H，m)，3.09-3.17(2H，m)，3.21-3.48(2H，m)，6.56-6.64(2H，m)，6.85-7.02(4H，m)，7.16-7.27(2H，m)；19F NMR(376.5MHz，CD3OD)δ-118.1至-116.0(1F，m)；LRMS(ESI)m/z 426(MH+)；HPLC(方法2)1.6min。
實施例3化合物II 根據(jù)實施例1，使用4-[2-氨基乙基]苯磺酰胺代替酪胺制備以上化合物。白色固體，收率77％；mp 145-147℃；1H NMR(400MHz，D2O)δ1.14-1.26(2H，m)，1.33-1.44(2H，m)，1.46-1.55(2H，m)，2.64-2.84(4H，m)，3.04-3.15(2H，m)，3.33-3.56(2H，m)，6.68-6.84(1H，m)，6.88-6.99(1H，m)，7.09-7.32(4H，m)，7.44-7.63(2H，m)；19F NMR(376.5MHz，CD3OD)δ-114.50至-113.81(1F，m)；LRMS(ESI)m/z 489(MH+)；HPLC(方法2)1.6min。
實施例4化合物III 根據(jù)實施例2，使用N，N-二甲基-4-[2-氨基乙基]苯磺酰胺代替酪胺制備以上化合物。N，N-二甲基-4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺如下合成用鄰苯二甲酸酐(23.5g，0.2摩爾)處理在無水DMF(120ml)中的4-[2-氨基乙基]苯磺酰胺(26.5g，0.1摩爾)溶液，在70℃下加熱反應(yīng)物4小時。將反應(yīng)物冷卻至室溫，并以小比例加入1，1’羰基二咪唑(21.5g，0.1摩爾)，并將反應(yīng)物在室溫下攪拌過夜。真空蒸發(fā)溶劑，用水洗滌殘余物，干燥，并用乙酸乙酯磨碎，得到鄰苯二甲?；Ｗo(hù)的化合物，為白色固體38.1g，收率89％；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ2.98(2H，t，J＝7.0Hz)，3.82(2H，t，J＝7.0Hz)，7.29(2H，s)，7.38(2H，d，J＝8.0Hz)，7.69(2H，t，J＝8.0Hz)，7.76-7.84(4H，m)；LRMS(ESI)m/z331(MH+)，348(MH+Na)；HPLC(方法2)2.9min。將在無水DMF(120ml)中的鄰苯二甲?；Ｗo(hù)的化合物(12.7g，38.6毫摩爾)溶液在0℃和N2下用小比例NaH(60％分散體，在油中；3.5g，88.8mmol)處理15分鐘，并在0℃和N2下攪拌反應(yīng)物一小時。然后經(jīng)15分鐘逐滴加入碘代甲烷(4.8ml，77.2毫摩爾)，并且在0℃至室溫和N2下將反應(yīng)物攪拌過夜。將得到的黃色懸浮液傾倒在冰/水(1.4L)上，并攪拌30分鐘。通過過濾收集沉淀物，依次用水、己烷和乙醚洗滌，然后真空干燥，得到N，N-二甲基-苯磺酰胺衍生物，為白色固體11.3g，收率81％；LRMS(ESI)m/z 359(MH+)，381(MH+Na)；HPLC(方法2)3.7min。將在95％乙醇(125ml)中的鄰苯二甲?；Ｗo(hù)的化合物(11.3g，31.5毫摩爾)和水合肼(4.6ml，44.6毫摩爾)溶液加熱回流2小時。將形成的白色固體通過過濾去除，并用乙醇洗滌。將合并的濾液和洗滌液真空濃縮，并將形成的固體通過過濾去除，并用乙醇洗滌。將該程序重復(fù)三次，將終過濾液真空蒸發(fā)至干。用乙酸乙酯萃取固體。將萃取液真空濃縮，得到游離胺，為黃色油狀物4.8g，收率67％；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ2.65(6H，s)，2.84-2.92(4H，m)，7.47(2H，d，J＝8.5Hz)，7.71(2H，d，J＝8.5Hz)；LRMS(ESI)m/z 229(MH+)，251(MH+Na)；HPLC(方法2)2.3min。將該化合物用二氯三嗪處理，然后用烷基胺處理，然后脫保護(hù)，得到終產(chǎn)物。白色固體(2.2g，92％)；mp 143-146℃；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.42-1.53(2H，m)，1.64-1.78(4H，m)，2.60 & 2.64(6H，2x s)，2.92-2.99(2H，m)，3.01-3.07(2H，m)，3.39-3.48(2H，m)，3.68-3.78(2H，m)，6.83-6.92(1H，m)，7.24-7.37(2H，m)，7.42-7.71(5H，m)；LRMS(ESI)m/z 517(MH+)，539(MH+Na)；HPLC(方法1)4.3min。
實施例5化合物IV 根據(jù)實施例1，使用2-[4-氨基苯基]-乙基胺代替酪胺制備以上化合物。黃色固體，收率97％；mp 155-158℃；1H NMR(400MHz，D2O)δ1.42-1.53(2H，m)，1.63-1.76(4H，m)，2.87-3.02(4H，m)，3.40-3.48(2H，m)，3.62-3.77(2H，m)，7.07-7.15(2H，m)，7.28-7.38(3H，m)，7.40-7.49(1H，m)，7.52-7.63(2H，m)；LRMS(ESI)m/z 425(MH+)，447(MH+Na)；HPLC(方法3)1.9min。
實施例6化合物VI 根據(jù)實施例2，分別使用4-[2-氨基乙基]苯甲酰胺和3-氟苯胺代替酪胺和4-氟苯胺制備以上化合物。4-[2-氨基乙基]-苯甲酰胺如下制備將在甲醇(200ml)中的4-[2-氨基乙基]苯甲酸鹽酸鹽(5.0g，24.8毫摩爾)懸浮液用4M的在1，4-二噁烷(10ml，40毫摩爾)中的HCl溶液處理，然后將反應(yīng)物加熱回流過夜。真空去除溶劑和過量的酸。將殘余物用乙醚研磨，并真空干燥，得到酯，為白色固體(5.5g，定量)；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ3.04(2H，t，J＝7.0Hz)，3.21(2H，td，J＝7.0，0.5Hz)，3.89(3H，s)，7.41(2H，dd，J＝8.0，0.5Hz)，8.00(2H，d，J＝8.0Hz)。將在四氫呋喃(60ml)和甲醇(30ml)中的該鹽酸鹽(5.4g，24.8毫摩爾)懸浮液用二異丙基乙胺(4.8ml，27.3毫摩爾)和二碳酸二叔丁酯(8.1g，37.2毫摩爾)處理。將反應(yīng)物在室溫和N2下攪拌5小時。將溶劑真空蒸發(fā)，并將殘余物溶解在乙酸乙酯中。用水和飽和氯化鈉洗滌溶液，然后干燥(硫酸鎂)，過濾，并真空蒸發(fā)。將殘余物用冷乙醚研磨，真空干燥，得到保護(hù)的化合物，為白色固體(5.6g，81％)；LRMS(ESI)m/z 192(MH+)，302(MH+Na)；HPLC(方法2)3.9min。用飽和的氨水溶液(36ml)處理在1，4-二噁烷(36ml)中的該酯(5.6g，20.0毫摩爾)溶液。將反應(yīng)物在密封管中在100℃下加熱過夜。冷卻后，通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，并真空干燥，得到酰胺，為白色固體(4.4g，82％)；LRMS(ESI)m/z 287(MH+Na)；HPLC(方法2)2.6min。通過在實施例2中的程序的修改進(jìn)行叔丁氧羰基化合物(4.4g，16.5毫摩爾)的脫保護(hù)，其中省略水共溶劑，并真空干燥固體，代替凍干，得到白色固體(3.3g，定量)；LRMS(ESI)m/z 165(MH+)，187(MH+Na)；HPLC(方法2)0.3min。將該化合物與二氯-三嗪反應(yīng)，然后與烷基胺反應(yīng)，然后脫保護(hù)，得到終產(chǎn)物。白色固體，1.0g，收率20％；mp 190-192℃；1H NMR(400MHz，D2O)δ1.13-1.26(2H，m)，1.31-1.55(4H，m)，2.54-2.84(4H，m)，2.99-3.12(2H，m)，3.23-3.49(2H，m)，6.66-6.82(1H，m)，6.86-7.14(3H，m)，7.16-7.25(2H，m)，7.36-7.57(2H，m)；LRMS(ESI)m/z 453(MH+)；HPLC(方法2)1.5min。
實施例7化合物VII 通過實施例1中使用的程序的改變來對Boc保護(hù)的化合物(4.8毫摩爾)脫保護(hù)。在該情況下，使用在二氯甲烷(30ml)中的4M HCl/1，4-二噁烷(36ml)，在0℃至室溫下，得到低密度的白色固體，收率87％；mp 165-168℃；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.40-1.51(2H，m)，1.62-1.74(4H，m)，2.87-3.04(4H，m)，2.93(2H，t，J 7.5Hz)，3.01(2H，t，J 6.5Hz)，3.41(2H，t，J 7.5Hz)，3.64-3.77(2H，m)，7.07-7.16(2H，m)，7.29-7.48(2H，m)，7.50-7.62(2H，m)，7.77-7.86(2H，m)；19F NMR(376.5MHz，CD3OD)δ-120.2至-119.8(1F，m)；LRMS(ESI)m/z245(MH+)，489(MH+Na)；HPLC(方法1)3.6min。
實施例8化合物VIII 根據(jù)實施例2，分別使用4-氨基苯磺酰胺和3-氟苯胺代替酪胺和4-氟苯胺制備以上化合物。淺米色固體，收率95％；mp 162-163℃；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.47-1.56(2H，m)，1.67-1.78(4H，m)，2.95(2H，t，J＝7.5Hz)，3.52(2H，t，J＝7.0Hz)，6.92-7.00(1H，m)，7.29-7.42(2H，m)，7.60-7.78(1H，m)，7.82-7.95(4H，m)；19F NMR(376.5MHz，CD3OD)δ-114.17至-113.71(1F，m)；LRMS(ESI)m/z 461(MH+)，483(MH+Na)；HPLC(方法4)3.7min。
實施例9化合物IX 根據(jù)實施例2，分別使用4-[2-氨基乙基]苯磺酰胺和4-氨基丁胺代替酪胺和5-氨基戊胺制備以上化合物。白色固體，收率74％；mp 181-184℃；1HNMR(400MHz，CD3OD)δ1.65-1.77(4H，m)，2.93-3.04(4H，m)，3.42-3.54(2H，m)，3.68-3.78(2H，m)，6.86-6.95(1H，m)，7.24-7.50(4H，m)，7.57-7.66(1H，m)，7.78-7.86(2H，m)；19F NMR(376.5MHz，CD3OD)δ-116.10至-115.43(1F，m)；LRMS(ESI)m/z 475(MH+)，497(MH+Na)；HPLC(方法1)3.6min。
實施例10化合物X 根據(jù)實施例2，使用N，N-二甲基-4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺代替酪胺制備以上化合物。淺米色固體，收率57％；mp 290-295℃(分解)；1H NMR(400MHz，D2O)δ1.12-1.27(2H，m)，1.32-1.57(4H，m)，2.30-2.44(6H，m)，2.75-2.84(4H，m)，3.06-3.19(2H，m)，3.53-3.65(2H，m)，6.98-7.04(2H，m)，7.17-7.35(3H，m)，7.37-7.48(2H，m)，7.52-7.58(1H，m)；LRMS(ESI)m/z 517(MH+)，539(MH+Na)；HPLC(方法2)1.8min。
實施例11化合物XI 根據(jù)實施例2，使用[±]-酚乙醇胺代替酪胺制備以上化合物。白色固體，收率36％；mp 122-125℃；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.36-1.43(2H，m)，1.50(2H，tt，J＝7.0，7.0Hz)，1.57-1.63(2H，m)，2.62(2H，t，J＝7.0Hz)，3.28-3.40(2H，m)，3.45(1H，J＝13.5，8.0Hz)，3.54-3.63(1H，m)，4.67-4.75(1H，m)，6.69(2H，d，J＝8.5Hz)，6.96-7.00(2H，m)，7.13(2H，d，J＝8.5Hz)，7.56-7.67(2H，m)；LRMS(ESI)m/z 442(MH+)；HPLC(方法1)3.3min。
抗癌活性 實施例12在正常和癌細(xì)胞上測定的化合物的體外細(xì)胞毒性 進(jìn)行該測定法以確定本發(fā)明的化合物對細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效果。在化合物存在或不存在下在它們的各自條件培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞。24小時或72小時孵育后，加入50μl 3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四氮唑(MTT；2mg/ml)，并再孵育四小時。去除上清液，并加入100μl二甲基亞砜(DMSO)。用TecanSunrise ELISA平板讀取器在570nm處讀取吸光度。對照組由沒有化合物的細(xì)胞組成，并指100％存活細(xì)胞。使用Prism軟件確定IC50。
表1代表化合物對24小時或72小時細(xì)胞培養(yǎng)物中的正常(NHDF或正常人真皮成纖維細(xì)胞；HUVEC或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)和癌(PC-3人前列腺癌細(xì)胞；P815鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞)細(xì)胞系的效果(IC50)。所有的化合物對細(xì)胞的細(xì)胞毒具有弱的作用?；诩?xì)胞毒測定法評價化合物對選擇的癌細(xì)胞系的潛在體內(nèi)抗癌活性的預(yù)測性應(yīng)用在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)建立，使用整個細(xì)胞而不是分離的蛋白受體或酶提供了更可靠的活性確定。參見例如Paull等(J.Nat’lCancer Inst.811088-1092，1989)；Monks等(J Nat’l Cancer Inst.83757-766，1991)；Bandes等(J.Nat’l Cancer Inst.86770-775，1994)；以及Kamate等(Int’lJ.Cancer 100571-579，2002)。
表1.化合物對24小時或72小時細(xì)胞培養(yǎng)物中的正常和癌細(xì)胞細(xì)胞毒的效果。

nd＝未測定 實施例13化合物對PC-3細(xì)胞遷移或侵襲的體外效果。
使用體外遷移測定法評價細(xì)胞二維運(yùn)動性。將PC-3細(xì)胞置于12孔板上，并在RPMI+10％FBS中生長至匯合。用橡膠刮勺產(chǎn)生裸區(qū)。通過使用阻止細(xì)胞增殖和蛋白合成混淆事件的濃度的絲裂霉素C(0.5μM)處理使匯合的細(xì)胞處于靜止。這些細(xì)胞還在內(nèi)皮生長因子(EGF)和化合物存在或不存在下孵育24小時，然后對其進(jìn)行拍照。
測定在體外遷移測定法中EGF和化合物V對PC-3細(xì)胞遷移或侵襲的效果。與對照(即沒有加EGF)相比，EGF促進(jìn)用絲裂霉素處理的PC-3細(xì)胞的遷移或侵襲。向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度(即1μM至10μM)的化合物V產(chǎn)生EGF誘導(dǎo)的PC-3遷移或侵襲的抑制。用化合物I觀察到類似的結(jié)果。將不同濃度的化合物I添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中在培養(yǎng)24小時后產(chǎn)生對EGF誘導(dǎo)的PC-3遷移或侵襲的抑制。
實施例14化合物對PC-3細(xì)胞粘附至細(xì)胞外基質(zhì)成分的體外效果。
使用體外細(xì)胞粘附測定法評價化合物對癌細(xì)胞粘附的效果。在室溫下用50μl/ml的粘附配體包被微滴定96孔板1小時，之前在PBS中，粘附配體就層粘連蛋白而言稀釋至5μg/ml，就MATRIGELTM基底膜基質(zhì)而言稀釋至10μg/ml，或就膠原而言稀釋至10μg/ml。用在PBS(100μl/孔)中的1％BSA溶液在37℃下封閉孔1小時。在37℃下用5μM鈣黃綠素-AM溶液孵育PC-3細(xì)胞亞匯合培養(yǎng)物30分鐘，然后通過在不含鈣黃綠素-AM的培養(yǎng)基中孵育PC-3細(xì)胞來將自由鈣黃綠素-AM洗去(30min)。用胰蛋白酶消化鈣黃綠素-AM標(biāo)記的細(xì)胞，洗滌，并重懸在粘附緩沖液(RPMI-1640，10％FBS，補(bǔ)充有1mM MgCl2)中。標(biāo)記的PC-3細(xì)胞在化合物不存在或存在下預(yù)孵育30分鐘，然后使終體積100μl的預(yù)孵育細(xì)胞在濕度孵箱中在37℃下粘附15min、30min或60min。通過用PBS洗滌兩次去除未粘附的細(xì)胞，將粘附的細(xì)胞用在PBS中的100μl 1％Triton X-100溶液裂解。在激發(fā)波長485nm以及發(fā)射波長530nm的Tecan GENios Plus熒光讀取器上讀板。粘附的細(xì)胞數(shù)基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。非特異性細(xì)胞粘附(粘附在用BSA包被的孔上)總是小于5％。
在上述體外細(xì)胞粘附測定法中加入的不同濃度的化合物V以劑量依賴性的方式抑制PC-3細(xì)胞對多種基質(zhì)層粘連蛋白(圖IA)、MATRIGELTM基底膜基質(zhì)(圖IB)或膠原(圖1C)的粘附。
實施例15化合物對原發(fā)B16F10黑色素瘤腫瘤的抗腫瘤效果。
雌性6-8周齡C57BL/6小鼠在第0天皮內(nèi)注射50μl來自ATCC的3.75x104存活B16F10黑色素瘤細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng)物來源，Dr.I.J.Fidler)。在第14天，腫瘤達(dá)到80mm，動物隨機(jī)分組用于治療。然后將動物在第14天、第16天以及第18天靜脈內(nèi)注射鹽水(陰性對照)或化合物(5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg)或者在第14天10mg/kg阿霉素(陽性對照)。在第29天，處死小鼠。記錄體重和腫瘤體積。使用公式0.4(a x b2)，通過用卡尺進(jìn)行二維直徑測量獲得一系列腫瘤體積，其中″a″是腫瘤大直徑，而″b″是垂直小直徑。通過T/C可以定量抗腫瘤效果，T/C計算作(治療的腫瘤體積/對照的腫瘤體積)x100％。
圖2A顯示化合物I或II對原發(fā)腫瘤B16F10細(xì)胞的抗腫瘤功效。與對照相比，兩種化合物均誘導(dǎo)腫瘤體積的弱的降低(T/C，約80％)。圖2B顯示化合物V對原發(fā)腫瘤B16F10細(xì)胞的抗腫瘤功效。與對照相比，化合物V誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著降低(T/C＜40％，p＝0.001)。
實施例16化合物對原發(fā)DA-3乳房腫瘤的抗腫瘤效果。
同源DMB A3(DA-3，乳癌模型)細(xì)胞系由在雌性BALB/c小鼠中用7，12-二甲基苯并蒽處理的癌前損傷產(chǎn)生。DA-3細(xì)胞在塑料瓶中在含有0.1mM非必需氨基酸、0.1μM丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640中作為單層培養(yǎng)物培養(yǎng)。進(jìn)一步補(bǔ)充有50μM 2-巰基乙醇和10％胎牛血清。DA-3腫瘤通過皮內(nèi)接種50μl 5x105個存活腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行體內(nèi)系列傳代，在6至8周齡BALB/c小鼠中產(chǎn)生局部腫瘤。然后通過手觸證實腫瘤來系列監(jiān)測動物。小鼠在第11天、第18天以及第25天用環(huán)磷酰胺(100mg/kg，靜脈內(nèi)注射)治療，在第11天、第12天、第13天、第15天、第18天、第20天、第22天以及第25天用化合物靜脈內(nèi)治療。從第27天至第55天處死小鼠。使用公式0.4(a x b2)，通過用卡尺進(jìn)行二維直徑測量來獲得一系列腫瘤體積，其中″a″是腫瘤大直徑，而″b″是垂直小直徑。通常，接種后7天至10天可以觸及腫瘤。國家癌癥研究所(The National Cancer Institute，USA)定義如果T/C是≤40％，則產(chǎn)品是有效的。
圖3顯示靜脈內(nèi)給予(5mg/kg)化合物II、化合物IV、化合物V或環(huán)磷酰胺的抗腫瘤功效。所有的化合物誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著(p＜0.05)抑制，T/C在25％至70％之間。另外，與誘導(dǎo)腫瘤體積顯著(p＜0.04)抑制的T/C在24％至50％之間的環(huán)磷酰胺相比，所有化合物與環(huán)磷酰胺類似直到第20天。還確定了針對DA-3腫瘤的化合物和CYTOXAN環(huán)磷酰胺的組合的抗腫瘤功效。
圖4A比較單獨(dú)靜脈內(nèi)給予(50mg/kg)化合物II與化合物II和環(huán)磷酰胺組合的抗腫瘤功效?；衔颕I誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著(p＜0.05)抑制，T/C在40％至70％之間。另外，與誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著(p＜0.05)抑制的T/C在24％至50％之間的環(huán)磷酰胺相比，用環(huán)磷酰胺和化合物II組合治療的小鼠也顯示對消退的腫瘤體積的顯著(p＜0.0001)抑制，并且T/C低于10％。消退和細(xì)胞生長抑制作用(不生長)在組合方案中觀察到。
圖4B比較單獨(dú)靜脈內(nèi)給予(50mg/kg)化合物I與化合物I和環(huán)磷酰胺組合的抗腫瘤功效?；衔颕對DA-3腫瘤生長具有弱的抑制效果。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著(p＜0.01)抑制，T/C在20％至50％之間，用環(huán)磷酰胺和化合物I組合治療的小鼠也顯示腫瘤體積的顯著(p＜0.05)抑制，T/C在10％至40％之間。細(xì)胞生長抑制作用(不生長)在組合方案中觀察到直到第35天。所有治療在第35天停止。保持環(huán)磷酰胺治療的和組合CY+化合物I治療的小鼠以觀察腫瘤的再生長。腫瘤的再生長在兩組中類似，但是在組合方案組中不太顯著或是延遲的。
圖4C比較單獨(dú)靜脈內(nèi)給予(12.5mg/kg)化合物V與化合物V和環(huán)磷酰胺組合相比的抗腫瘤功效。所有方案誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著抑制(p＜0.04)直到第20天。用化合物V治療的小鼠顯示T/C為36％至74％的腫瘤體積的降低。但是，與誘導(dǎo)腫瘤體積抑制的T/C為30％至45％的環(huán)磷酰胺相比，用環(huán)磷酰胺和化合物V治療的小鼠表現(xiàn)T/C在1％至20％之間的腫瘤體積的顯著抑制。
圖5比較單獨(dú)口服給予(50mg/kg)順鉑與化合物VII和順鉑組合相比的抗腫瘤功效。順鉑誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著(p＜0.01)抑制，從第40天至第77天T/C在40％至77％之間。用順鉑和化合物VII組合治療的小鼠也顯示腫瘤體積的顯著(p＜0.01)抑制，從第34天至第71天T/C在34％至71％之間。
實施例17化合物對原發(fā)P815肥大細(xì)胞瘤腫瘤的抗腫瘤效果。
同源P815是從ATCC(TIB64)獲得的DBA/2(H-2d)衍生的肥大細(xì)胞瘤。P815細(xì)胞在含有10％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。在第0天，在6至8周齡DBA/2小鼠中皮內(nèi)注射50μl 5x105個存活P815細(xì)胞，以產(chǎn)生局部腫瘤。然后，通過手觸證實腫瘤來系列監(jiān)測動物。然后將小鼠每天口服給予載體(陰性對照)、乙酰水楊酸(陽性對照，50mg/kg)或化合物(50mg/kg)來治療。在第23天處死小鼠。使用公式0.4(a x b2)，通過卡尺進(jìn)行二維直徑測量獲得一系列腫瘤體積，其中″a″是腫瘤大直徑，而″b″是垂直小直徑。一般而言，在接種后3天至5天可以觸及腫瘤。
圖6顯示口服給予的化合物I、化合物II、化合物V或乙酰水楊酸(陽性對照)對原發(fā)腫瘤P815細(xì)胞的效果。所有化合物誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著降低(T/C在40％至50％之間)。另外，所有化合物的效果與金標(biāo)準(zhǔn)可溶性乙酰水楊酸相當(dāng)。
實施例18化合物對原發(fā)Lewis肺LL/2癌腫瘤的抗腫瘤效果。
同源LL/2是從ATCC(CRL-1642)獲得的肺腫瘤細(xì)胞系。LL/2細(xì)胞在含有10％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。在第0天，在6至8周齡小鼠中將50μl3x105個存活LL/2細(xì)胞皮內(nèi)注射，以產(chǎn)生局部腫瘤。然后通過手觸證實腫瘤來系列監(jiān)測動物。然后每天口服給予載體(陰性對照)或化合物(50mg/kg)以及在第6天和第13天靜脈內(nèi)注射順鉑(5mg/kg)治療小鼠。在第16天處死小鼠。使用公式0.4(a x b2)，通過卡尺進(jìn)行二維直徑測量獲得一系列腫瘤體積，其中″a″是腫瘤大直徑，而″b″是垂直小直徑。一般而言，在接種后3天至5天可以觸及腫瘤。
圖7A顯示口服給予化合物II或順鉑(陽性對照)對原發(fā)腫瘤LL/2細(xì)胞的效果。化合物II從第7天至第16天誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著降低(T/C在36％至60％，p＜0.04)。順鉑在第7天和第8天誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著降低(T/C在42％至84％之間，p＜0.04)。在另一實驗中，使用環(huán)磷酰胺(100mg/kg)作為陽性對照，并在第9天和第15天注射。在第20天，處死小鼠。圖7B顯示環(huán)磷酰胺和化合物II的組合治療效果。該組合治療在原發(fā)腫瘤LL/2細(xì)胞的降低中獲得協(xié)同活性。
圖8顯示口服給予化合物II、化合物III、化合物VII或環(huán)磷酰胺(陽性對照)對原發(fā)腫瘤LL/2細(xì)胞的效果?；衔颕I誘導(dǎo)腫瘤生長的降低(T/C在53％至74％之間)?；衔颕II誘導(dǎo)腫瘤生長的降低(T/C在67％至96％之間)?；衔颲II誘導(dǎo)腫瘤生長的降低(T/C在72％至85％之間)。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腫瘤生長的降低(T/C在50％至67％之間)。
實施例19化合物對PAN02胰腺腫瘤的抗腫瘤效果。
同源PAN02是從NCI(0507232)獲得的胰腺腫瘤細(xì)胞系。PAN02在含10％胎牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)。在第0天，在6至8周齡的C57BL/6小鼠中將50μl 7.5x105個存活PAN02細(xì)胞皮內(nèi)注射，以產(chǎn)生局部腫瘤。然后通過手觸證實腫瘤來系列監(jiān)測動物。然后每天口服給予載體(陰性對照)或化合物(50mg/kg)以及在第6天和第12天腹膜內(nèi)注射吉西他濱(50mg/kg)治療小鼠。在第40天處死小鼠。使用公式0.4(a x b2)，通過卡尺進(jìn)行二維直徑測量來獲得一系列的腫瘤體積，其中″a″是腫瘤大直徑，而″b″是垂直小直徑。一般而言，在接種后3天至5天可以觸及腫瘤。
圖9顯示口服給予化合物I、化合物V或吉西他濱(陽性對照)對原發(fā)腫瘤PAN02細(xì)胞的效果?；衔颕和V兩者均誘導(dǎo)腫瘤生長的弱降低(T/C分別在17％至67％之間以及在40％至84％之間)。另外，用于治療胰腺癌癥，所有化合物的效果與金標(biāo)準(zhǔn)吉西他濱(T/C在52％至77％之間)相當(dāng)。
實施例20化合物對異種移植人前列腺PC-3腫瘤的抗腫瘤效果。
異種人前列腺腫瘤PC-3從ATCC(CRL1435)獲得。PC-3細(xì)胞在含有10％胎牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)。在第0天，在6至8周齡的雄性CD1 nu/nu小鼠中皮內(nèi)注射50μl存活PC-3(1.5至2X106)細(xì)胞，以產(chǎn)生局部腫瘤。然后通過手觸證實腫瘤來系列監(jiān)測動物。當(dāng)腫瘤達(dá)到滿意的體積時，將小鼠隨機(jī)分組，然后第一、二和三周分別用靜脈內(nèi)注射載體(陰性對照)、環(huán)磷酰胺(陽性對照，100mg/kg)或化合物(5mg/kg)治療四次、三次和三次。在56天至65天之間處死小鼠。使用公式0.4(a x b2)，通過用卡尺進(jìn)行二維直徑測量來獲得一系列腫瘤體積，其中″a″是腫瘤大直徑，而″b″是垂直小直徑。
圖10A顯示化合物II或環(huán)磷酰胺對異種移植人前列腺PC-3腫瘤的效果?；衔颕I誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著降低(T/C在29％至75％之間)。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著降低(T/C在1％至52％之間)。另外，化合物II表明細(xì)胞生長抑制(無生長)作用直到第42天。
圖10B顯示化合物II、環(huán)磷酰胺或化合物II和環(huán)磷酰胺的組合對異種移植人前列腺PC-3腫瘤的效果。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著降低(T/C在8％至31％之間)。用化合物II和環(huán)磷酰胺組合治療導(dǎo)致顯著的降低(T/C在1％至23％之間)，之后腫瘤消退。腫瘤再生長在第48天治療結(jié)束后在環(huán)磷酰胺治療組較快。
圖10C顯示單獨(dú)口服給予化合物V和與環(huán)磷酰胺一起給予對異種移植人前列腺PC-3腫瘤的抗腫瘤功效?？诜o予化合物V誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著(p＜0.05)抑制，T/C在14％至40％之間。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著抑制(p＜0.05)，T/C在1％至39％之間。用環(huán)磷酰胺和口服給予化合物V組合治療的小鼠顯示腫瘤體積的顯著(p＜0.01)抑制，T/C在1％至40％之間，伴有腫瘤消退。
抗炎活性 實施例21在WEHI-13VAR細(xì)胞系中化合物對TNFα誘導(dǎo)的凋亡的效果。
通過標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)測定法，使用WEHI-13VAR細(xì)胞測定化合物對TNFα誘導(dǎo)的凋亡的效果。這些細(xì)胞在它們在TNFα和放線菌素D存在下培養(yǎng)時經(jīng)歷凋亡。2x104 WEHI-13VAR細(xì)胞在補(bǔ)充有1％丙酮酸鈉和10％FBS的RPMI中培養(yǎng)，在37℃下細(xì)胞粘附過夜。然后，將細(xì)胞在37℃下在1μg/ml放線菌素D(抑制蛋白合成)和0.04nM TNFα以及有或沒有化合物下培養(yǎng)。16小時至24小時后，將50μl 2mg/ml MTT溶液加入各孔中，然后將板在37℃下孵育4小時。僅僅存活的細(xì)胞代謝MTT，形成甲

鹽，其通過測量在570nm處的吸光度來檢測。孵育后，將板倒轉(zhuǎn)以去除培養(yǎng)基和死細(xì)胞。將150μLDMSO加入各孔中，以終止反應(yīng)和溶解甲

鹽。在Bio-Tek EL 800UV微板讀取器上讀取光密度。光密度的下降是TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的直接證據(jù)。還比較化合物與抗TNFα中和抗體的活性。
表2代表在基于細(xì)胞的TNFα敏感的WEHI-13VAR細(xì)胞增殖測定法中檢測的化合物的TNFα抑制百分比(凋亡)?；衔锉砻鱐NFα抑制活性在40-80％范圍內(nèi)。比較而言，TNFα抗體證明90-95％的TNFα抑制活性。該數(shù)據(jù)例示了本發(fā)明的化合物抑制TNFα對TNFα敏感的WEHI-13 VAR細(xì)胞的凋亡活性的能力。
表2.化合物對TNF-α抑制(凋亡)的效果。

實施例22化合物對小鼠J774A.1細(xì)胞系中LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的效果。
使用LPS刺激的J774A.1細(xì)胞，通過ELISA測定化合物對TNFα產(chǎn)生的效果。J774A.1細(xì)胞在LPS和化合物存在或不存在下培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24小時，然后收集上清液用于通過ELISA測定TNFα的濃度，ELISA如廠商(BD Biosciences)所推薦的進(jìn)行。數(shù)據(jù)在Microsoft Excel軟件中分析，并使用Prism軟件計算抑制50％TNFα產(chǎn)生(IC50)的化合物的濃度。
表3總結(jié)化合物對由LPS對J774A.1細(xì)胞誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的效果。
表3.化合物對LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的效果。
實施例23化合物對在小鼠J774A.1細(xì)胞系中LPS誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生的效果。
化合物對PGE2產(chǎn)生的效果使用LPS刺激的J774A.1細(xì)胞通過ELISA進(jìn)行測定。J774A.1細(xì)胞在LPS和化合物存在和不存在下培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24小時，然后收集上清液用于通過ELISA測定PGE2濃度，ELISA如廠商(GE Healthcare)所推薦的進(jìn)行。數(shù)據(jù)在Microsoft Excel軟件中分析，并使用Prism軟件計算抑制50％PGE2產(chǎn)生(IC50)的化合物的濃度。
圖11顯示化合物V在LPS刺激的J774A.1中對PGE2產(chǎn)生的效果?；衔颲抑制PGE2產(chǎn)生，IC50為2μM。
實施例24化合物對外周血單核白細(xì)胞(PBML)細(xì)胞毒、DNA、RNA和蛋白合成的效果。
PBML從健康自愿者的外周血獲得。用多型淋巴細(xì)胞分離液培養(yǎng)基(Cedarlane，Hornby，加拿大)對血進(jìn)行梯度離心。收集含有單核白細(xì)胞的層，并在PBS中洗滌細(xì)胞三次。然后將細(xì)胞懸浮在補(bǔ)充有10％FBS(Hyclone，Logan USA)的RPMI(Gibco，Burlington，加拿大)中。通過錐蟲藍(lán)拒染法確定存活率大于99％。
將PBML以2x 106個細(xì)胞/ml懸浮。在化合物存在或不存在下在96孔微量滴定板中培養(yǎng)100μL PBML(2x105個細(xì)胞)48小時。細(xì)胞用刀豆蛋白A(con A；T細(xì)胞)或商陸促細(xì)胞分裂素(PWM；B細(xì)胞)靜止或刺激。孵育后，將細(xì)胞用MTT處理(細(xì)胞毒性)或用1μCi[3H]-胸苷(DNA合成)、[3H]-尿苷(RNA合成)或[3H]-亮氨酸(蛋白合成)脈沖刺激6小時。將板在Tomteck上收集并在Microbetaβ計數(shù)儀上計數(shù)。
表4總結(jié)化合物對人外周血單核白細(xì)胞(PBML)的細(xì)胞毒、DNA、RNA和蛋白合成的效果。沒有觀察到細(xì)胞的細(xì)胞毒。不過，當(dāng)PBML用刺激T細(xì)胞增殖的促細(xì)胞分裂原con A和刺激B細(xì)胞增殖的促細(xì)胞分裂原PWM刺激時所有的化合物抑制DNA。RNA合成在靜止和刺激的(con A和PWM)PBML中均被抑制。不過，僅化合物I和II在刺激的PBML中抑制蛋白合成。這些結(jié)果表明T和B細(xì)胞都抑制。這些細(xì)胞強(qiáng)烈地參與炎癥性疾病例如自身免疫性疾病。
表4.化合物對靜止或刺激的PBML細(xì)胞毒、DNA、RNA以及蛋白合成的效果。

nd＝未測定 實施例25化合物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的效果。
經(jīng)NZB x NZW F1雜交的新西蘭小鼠發(fā)生在人SLE中看到的多數(shù)自身免疫性異常，并死于SLE樣免疫復(fù)合物(IC)介導(dǎo)的腎小球腎炎。小鼠產(chǎn)生高滴度的抗DNA(雙鏈和單鏈)和核提取物(NE)抗體以及SLE相關(guān)的臨床表現(xiàn)，包括白細(xì)胞減少、血小板減少、蛋白尿和腎小球腎炎。這些小鼠在3個月齡后產(chǎn)生抗DNA抗體，在7個月時發(fā)生抗DNA抗體反應(yīng)高峰。之后，抗DNA抗體的血清濃度下降，預(yù)測結(jié)果是進(jìn)展性尿毒癥。該疾病的最初血清學(xué)表現(xiàn)發(fā)生在約150天(即5個月)。在約250天時評價它們的生存。
圖12顯示化合物I對NZB x NZW小鼠死亡率的影響。從第10周至第46周每周一次進(jìn)行靜脈內(nèi)給予化合物或載體。結(jié)果表明化合物I降低NZB xNZW小鼠死亡率。
實施例26化合物對遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的效果。
檢測化合物用于治療小鼠中噁唑酮誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的能力。在第0天，用在5％丙酮中的100μL噁唑酮致敏小鼠。在第0天、第1天和第2天，通過靜脈內(nèi)(IV)或口服(PO)給予載體(對照)或甲氨蝶呤(MTX；陽性對照/IV)或氫化可的松(陽性對照/PO)或化合物來治療小鼠，它們的濃度低于或等于50mg/kg或如所規(guī)定。小鼠通過在右耳的表面施用50μl噁唑酮來激發(fā)(第一次激發(fā)，在第3天；第二次激發(fā)，在第10天)。在第4天至第7天，以及在第11天至14天測量耳厚。還觀察到發(fā)紅和硬皮形成。在第14天處死小鼠。TDTH(CD4)細(xì)胞在調(diào)節(jié)DTH反應(yīng)的強(qiáng)度中起重要作用。化合物可通過其抑制T細(xì)胞活性以及DNA、RNA和/或蛋白合成發(fā)揮對DTH反應(yīng)的抑制性影響。
如圖13A所示，靜脈內(nèi)給予(25mg/kg)化合物I誘導(dǎo)噁唑酮第一次激發(fā)后誘導(dǎo)的炎癥的顯著降低，這如降低的耳厚所見。另外，由化合物I誘導(dǎo)的炎癥的抑制與由甲氨蝶呤的免疫抑制劑量所獲得的結(jié)果相當(dāng)。靜脈內(nèi)給予(25mg/kg)化合物I誘導(dǎo)噁唑酮第二次激發(fā)后誘導(dǎo)的炎癥的顯著降低，這如降低的耳厚所見(圖13B)。另外，由化合物I誘導(dǎo)的炎癥的抑制與由甲氨蝶呤的免疫抑制劑量所獲得的結(jié)果相當(dāng)。
如圖14A所示，靜脈內(nèi)給予(5mg/kg)化合物II誘導(dǎo)噁唑酮第一次激發(fā)后誘導(dǎo)的炎癥的顯著降低，這如降低的耳厚所見。另外，由化合物II誘導(dǎo)的炎癥的抑制與由甲氨蝶呤的免疫抑制劑量所獲得的結(jié)果相當(dāng)。靜脈內(nèi)給予(5mg/kg)化合物II誘導(dǎo)噁唑酮第二次激發(fā)后誘導(dǎo)的炎癥的顯著降低，這如降低的耳厚所見(圖14B)。另外，由化合物II誘導(dǎo)的炎癥的抑制與由甲氨蝶呤的免疫抑制劑量所獲得的結(jié)果相當(dāng)。
如圖15所示，口服給予(50mg/kg)化合物IV或化合物V誘導(dǎo)炎癥的顯著降低，這如降低的耳厚所見。另外，由化合物IV或化合物V誘導(dǎo)的炎癥的抑制與由氫化可的松的治療劑量(50mg/kg)獲得的結(jié)果相當(dāng)。
圖16顯示在第一次(圖16A)和第二次(圖16B)噁唑酮激發(fā)后口服給予50mg/kg化合物III的效果?；衔颕II誘導(dǎo)炎癥的顯著降低，這如在兩次激發(fā)中降低的耳厚所見。
圖17顯示在噁唑酮第一次激發(fā)后靜脈內(nèi)分別給予5mg/kg或25mg/kg化合物X或化合物XI的效果?；衔颴和XI誘導(dǎo)炎癥的顯著降低，這如較低的耳重所見。另外，由化合物X或XI所誘導(dǎo)的炎癥的抑制與由甲氨蝶呤的免疫抑制劑量獲得的結(jié)果相當(dāng)。
實施例27化合物對弗氏佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(AIA)的效果。
通過將懸浮在礦物油中的凍干乳酪分支桿菌(Mycobacterium butyricum)注射入足墊中來在雌性Lewis大鼠中誘導(dǎo)AIA。在佐劑注射后經(jīng)3周時間監(jiān)測關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。在佐劑給予后的第3天炎癥達(dá)到高峰。在第10天至第16天左右出現(xiàn)免疫活化。從第3至第21天口服給予化合物。記錄體重。使用作為炎癥(水腫)、發(fā)紅以及關(guān)節(jié)僵硬的量度的關(guān)節(jié)炎指數(shù)監(jiān)測疾病的發(fā)展。通過使用卡尺在中側(cè)面和背腹面測量踝的兩垂直直徑來確定關(guān)節(jié)炎的程度。然后使用幾何公式計算以毫米計的關(guān)節(jié)周長。
如圖18所示，100％的動物快速發(fā)生滑膜炎。通過在第1天至第5天和從第8天至結(jié)束(by day 8 and over)口服給予消炎痛(陽性對照)觀察到關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度的顯著降低。使用化合物也可在第1天至第4天以及從第8天至第16天觀察到類似的炎癥指數(shù)的降低。
實施例28化合物對氣囊模型炎癥的效果。
大鼠氣囊模型中LPS誘導(dǎo)的炎癥認(rèn)為是模擬在關(guān)節(jié)疾病例如關(guān)節(jié)炎中發(fā)生的病理過程。這是因為沿氣囊形成的結(jié)締組織與在慢性關(guān)節(jié)疾病中發(fā)現(xiàn)的那些類似。LPS誘導(dǎo)的炎癥和慢性關(guān)節(jié)疾病具有其他共同特征，包括顯著的升高的PGE2、中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子形成以及組織損傷。
在第-6天通過皮下注射20ml無菌氣體進(jìn)入雄性Lewis大鼠(175至200g)背部的肩胛骨區(qū)(intrascapular)來產(chǎn)生氣腔。在第-3天注射入另外的10ml氣體以保持氣腔開放。在第0天，靜脈內(nèi)給予化合物，并在一小時之后將脂多糖(LPS2.5ml 2μg/ml，在PBS中)注射入囊中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在LPS處理2小時、4小時或18小時后，通過CO2窒息使動物安樂死，并將5ml PBS/肝素(10U/ml)/消炎痛(36μg/ml)注射入囊中。收集囊液體。測量流出物的體積，并通過Coulter計數(shù)儀確定流出物中存在的白細(xì)胞的數(shù)目。通過瑞氏-吉姆薩染色確定分類計數(shù)。通過特異的ELISA確定囊流出物中的PGE2、LTB4、MCP和TNFα。
如圖19所示，靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V誘導(dǎo)在LPS誘導(dǎo)后兩小時的白細(xì)胞計數(shù)的顯著抑制。這些血白細(xì)胞的分類計數(shù)表明有大于90％中性粒細(xì)胞，如瑞氏-吉姆薩染色所見。通過化合物II或V得到的抑制與由陽性對照消炎痛獲得的抑制類似。
圖20A顯示在氣囊大鼠模型中靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生(誘導(dǎo)后兩小時)的效果。化合物V誘導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的顯著抑制。但是化合物II或消炎痛增加LPS誘導(dǎo)后兩小時后的TNFα的濃度。
圖20B顯示在氣囊大鼠模型中靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對LPS誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生(誘導(dǎo)后兩小時)的效果。化合物V和消炎痛誘導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生的顯著抑制。但是用化合物II觀察到弱且不顯著的PGE2抑制。
圖20C顯示在氣囊大鼠模型中靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對LPS誘導(dǎo)的LTB4產(chǎn)生(誘導(dǎo)后兩小時)的效果?；衔颕I和V誘導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的LTB4產(chǎn)生的弱抑制。但是消炎痛不影響LTB4的產(chǎn)生。
圖20D代表在氣囊大鼠模型中靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對LPS誘導(dǎo)的MCP-1產(chǎn)生(誘導(dǎo)后兩小時)的效果?；衔颲誘導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的LTB4產(chǎn)生的弱抑制。但是消炎痛誘導(dǎo)顯著的增加，而化合物II對LPS誘導(dǎo)后兩小時后流出液中MCP-1的存在沒有影響。
在另一組實驗中，在LPS誘導(dǎo)后12小時后收集流出物。圖21A代表靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的效果?；衔颲誘導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生的顯著抑制。但是化合物II對LPS誘導(dǎo)后十二小時后流出液中TNFα的濃度沒有影響。消炎痛誘導(dǎo)對LPS誘導(dǎo)后十二小時后流出液中的TNFα的弱抑制。
圖21B顯示在氣囊大鼠模型中靜脈內(nèi)給予化合物II或化合物V對LPS誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生(誘導(dǎo)后十二小時)的效果?；衔颲或消炎痛誘導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生的顯著抑制。但是用化合物II觀察到PGE2的弱且非顯著性增加。
實施例29化合物V對DNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的效果。
2，4-二硝基苯磺酸(DNBS)誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎小鼠模型作為炎癥性腸病模型。在第0天，CD1小鼠用DNBS通過結(jié)腸內(nèi)滴注0.1ml DNBS(40mg/ml)乙醇溶液(30％)來致敏。在用DNBS致敏后1小時開始，將化合物V以25mg/kg和50mg/kg每天一次連續(xù)四天口服給予。在第4天，處死小鼠，收集8cm遠(yuǎn)端結(jié)腸，并縱向切開用于大體評價。
與陰性對照(載體)相比，化合物V誘導(dǎo)弱但是具有顯著性的體重增加(25mg/kg時p＝0.049，而在50mg/kg時p＝0.038)，表明治療的小鼠健康更好。的確，在對照組中觀察到死亡率，但是在用化合物V治療的組中沒有觀察到。
如圖22所示，與陰性對照(載體)相比，化合物V誘導(dǎo)強(qiáng)且顯著地DNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸粘膜組織的大體損傷面積(在25mg/kg時p＝0.003，而在50mg/kg時p＝0.012)的降低。
實施例30化合物V對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的效果。
以PLP誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型作為多發(fā)性硬化模型。在第0天，SJL小鼠用乳化在弗氏完全佐劑中的75μg PLP(139-151)(200μl乳液/小鼠，皮下注射，分在四個部位)和用百日咳毒素(200ng，腹膜內(nèi))免疫。在第2天，重復(fù)腹膜內(nèi)注射百日咳毒素?；衔颲以25mg/kg和50mg/kg口服每天一次給予，在第0天開始，直至免疫后30天，每周六次。
觀察小鼠EAE臨床癥狀直至免疫后30天。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癥狀的臨床等級評定0＝無病，1＝尾無力，2＝中度截癱，3＝重度截癱，4＝瀕死狀態(tài)，5＝死亡。如圖23所示，化合物V以劑量依賴性方式降低EAE癥狀的表現(xiàn)。與陰性對照(載體)相比，在50mg/kg時，化合物V表現(xiàn)顯著的活性(p＝0.048)。
本文所引用的專利、專利申請以及其他出版物以它們的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
在權(quán)利要求書的含義及其法律等同物的范圍內(nèi)的所有修改和替換應(yīng)包含在其范圍內(nèi)。使用連接詞“包含”的權(quán)利要求允許在權(quán)利要求的范圍內(nèi)包含其他元素；代替“包含”術(shù)語，本發(fā)明還通過使用連接詞“基本上由...組成”(即如果其他元素不實質(zhì)性地影響發(fā)明的實施，允許在權(quán)利要求的范圍內(nèi)包含它們)和連接詞“由...組成”(即除了通常與發(fā)明相關(guān)的雜質(zhì)或無關(guān)緊要的活性外僅允許在權(quán)利要求中列出的元素)的這樣的權(quán)利要求來描述。這三種連接詞中的任何一種可用于要求本發(fā)明。
應(yīng)該理解，本說明書中描述的元素不應(yīng)該理解為限制所保護(hù)的權(quán)利要求，除非其在權(quán)利要求中清楚地指出。因此，權(quán)利要求是確定授權(quán)的法律保護(hù)的范圍的基礎(chǔ)而不是來自說明書的、曲解權(quán)利要求書的限制。相反，現(xiàn)有技術(shù)在至先占所要保護(hù)的發(fā)明或破壞新穎性的具體實施方式
的程度上被清楚地排出在本發(fā)明之外。
另外，無意于在權(quán)利要求的各限制之間設(shè)置特定的關(guān)系，除非該關(guān)系在權(quán)利要求中被清楚地指出(例如在產(chǎn)品權(quán)利要求中的組分的排列或在方法權(quán)利要求中步驟的順序?qū)?quán)利要求沒有限制，除非特別地指出如此)。本文公開的各個元素的所有可能組合和排列被認(rèn)為是本發(fā)明的方面；類似地，對發(fā)明描述的概括認(rèn)為是發(fā)明的一部分。
從前述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，在不偏離本發(fā)明的精神或必要特征的前提下，本發(fā)明能夠以其他特定的形式實施。所描述的實施方案應(yīng)該認(rèn)為僅是例示性的，而不是限制性的，因為提供的本發(fā)明的法律保護(hù)范圍將通過所附的權(quán)利要求書而不是通過說明書來指出。
權(quán)利要求
1.下式的化合物
其中X是F或Cl；
Y是NH、O或S；
R是NH2、OH、SO2NH2、SO2N(CH3)H、SO2N(CH3)2或CONH2；
m是2至6的整數(shù)；且
n是0至2的整數(shù)，其中二碳片段(n＝2)包括
Z＝H或OH的
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中X＝F。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中Y＝NH或O。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的化合物，其中m＝4-6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的化合物，其中n＝2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的化合物，其中R＝NH2、OH、SO2NH2或SO2N(CH3)2。
7.一種化合物，其選自
8.一種組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求1至7中任一項所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體溶解所述一種或多種化合物，且選自醇、多元醇溶劑和單糖或二糖的水性溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其進(jìn)一步包含化療藥。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述化療藥選自達(dá)卡巴嗪、阿霉素、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、長春堿、長春新堿、博萊霉素、足葉乙甙、托泊替康、伊立替康、泰索帝、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、賽特鉑和苯丁酸氮芥。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其進(jìn)一步包含與TNFα結(jié)合的蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述蛋白是抗TNFα抗體或可溶性TNFα受體。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其進(jìn)一步包含能結(jié)合TNFα的低分子量化合物(非蛋白)。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其進(jìn)一步包含甲氨蝶呤、抗炎皮質(zhì)類固醇、非甾體抗炎藥或其組合。
16.一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的一種或多種權(quán)利要求1-7中任一項所述的化合物或權(quán)利要求8至11中任一項所述的組合物。
17.一種或多種權(quán)利要求1-7中任一項所述的化合物或權(quán)利要求8至11中任一項所述的組合物用于制備用于治療癌癥的藥物的應(yīng)用。
18.一種治療自身免疫患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的一種或多種權(quán)利要求1-7中任一項所述的化合物或權(quán)利要求8至9和12至15中任一項所述的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述自身免疫患者具有至少克隆氏病、炎癥性腸病或多發(fā)性硬化。
20.一種或多種權(quán)利要求1-7中任一項所述的化合物或權(quán)利要求8至9和12至15中任一項所述的組合物用于制備用于治療自身免疫性疾病的藥物的應(yīng)用。
21.一種或多種權(quán)利要求1至7中任一項所述的化合物降低哺乳動物中炎癥的應(yīng)用。
22.下式的化合物
其中X是F或Cl；
Y是NH、O或S；
R是NH2、OH、F或Cl；
m是2至6的整數(shù)；且
n是0至2的整數(shù)。
23.一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的一種或多種權(quán)利要求22所述的化合物。
24.一種治療自身免疫患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的一種或多種權(quán)利要求22所述的化合物。
25.一種或多種權(quán)利要求22所述的化合物用于制備用于治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明描述所述通式(I)的化合物其中X是氟或氯；Y是氧、硫或氨基；R是氨基、羥基、氨磺酰或酰氨基或其N-一甲基或N-二甲基類似物；m是2至6的整數(shù)，且n是0至2的整數(shù)。所述化合物可用于治療某些癌癥和自身免疫性疾病。
文檔編號A61P37/00GK101679321SQ200880014036
公開日2010年3月24日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者B·扎卡賴爾, C·彭尼, L·加尼翁, B·格勞克斯, L·格爾茨, S·D·阿博特 申請人:普羅米蒂克生物科學(xué)公司