專利名稱：一種制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然產物開發(fā)或藥品原料的制造方法，具體涉及以紅豆 杉植物材料或者細胞培養(yǎng)物的醇性浸膏為原料，轉化、制備多羥基紫杉 烷與同步分離紫杉醇的方法。
背景技術：
紫杉醇(taxol),是一種療效顯著的天然抗腫瘤藥物，在治療AID 相關的卡波西肉瘤(Kaposi's Sarcoma)方面也有良好的應用前景，它 與目前己經上市的第二代紫杉醇藥物泰索帝(taxotere)，和進入臨床 1I期的第三代紫杉醇14一e—羥基去乙酰巴卡亭(ortataxel)，具有相 同的母核結構，差異僅在母核上個別取代基團的不同，統(tǒng)稱為紫杉烷類 化合物。紫杉醇是紅豆杉產生的二萜類次生代謝產物，結構很復雜，通 過化學全合成途徑生產很不現(xiàn)實，現(xiàn)在主要從紅豆杉樹皮或者枝葉中、 少量從紅豆杉細胞培養(yǎng)物中直接提取分離，或者先分離提純同時存在于 紅豆杉浸膏中的IO —去乙酰巴卡亭III (10—deacey1- baccatin III) 和巴卡亭III (baccatin III)，再以這些前體化合物為原料進行化學半合 成獲得泰索帝(taxotere)和14一 P —羥基去乙酰巴卡亭(ortataxel)。 但紫杉醇及其半合成前體10-去乙酰巴卡亭III (10 —deaceyl-baccatin III)和巴卡亭III (baccatin III)在植物組織或細胞培養(yǎng)中 的含量高低受品種和許多復雜因素制約，大多數(shù)情況下，它們的含量并 不高。例如，紫杉醇在可再生的紅豆杉枝葉中含量平均在0.02%以下； IO —去乙酰巴卡亭III (10 — deaceyl- baccatin III)和巴卡亭III (baccatin III)雖然在漿果紅豆杉(7: Asccats)枝葉中含量高達O. 1%，
但在中國紅豆杉(7: c/ j'/7朋w's)中，含量卻很低，大概在ppm的數(shù)量 級，低含量一方面導致大量植物資源被采伐，加劇了紫杉醇的供需矛盾， 另一方面加大了提取分離工藝的難度。
事實上，紅豆杉組織和細胞浸膏中還含有大量其它種類的紫杉垸，以
巴卡亭VI (baccatin VI)禾口云南寧(taxuyu腿nine C)為代表的多乙
酰紫杉垸在中國紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉、西藏紅豆杉、云
南紅豆杉、加拿大紅豆杉等這些品種中含量相當高，所述多乙酰紫杉烷
是指具有如下巴卡亭VI (baccatin VI)、云南寧(taxuyunnanine C)結
構骨架特征之一、在C7、 C9、 C10、 C13、 C14、 C5這些任意3個或以上
位點具有乙酰取代的紫杉二萜類物質。這些多乙酰紫杉烷雖然具有和紫
杉醇一樣或類似的母核結構，但本身并不顯示明顯的抗腫瘤活性，它們 存在于紅豆杉植物或細胞培養(yǎng)物的醇性浸膏中?，F(xiàn)有的以紫杉醇或者10 —去乙酰巴卡亭III (10 —deaceyl- baccatin III)和巴卡亭III
(baccatin III)為提取分離目標的技術見(1)美國專利USP 5， 412， 116 (1995) oxidation of glycoside substituted taxanes to taxol or taxol precursors and new taxane compounds formed as intermediates; (2)公開號CN1096820,細胞培養(yǎng)生產紫杉醇的方法；
(3)公開號CN1534032, —種高效制備紫杉醇的方法；(4)公開號 CN101函48，制備紫杉醇的方法；(5)公開號CN1158126,制備紫杉醇 及其衍生物的方法；(6)公開號CN1197796， 一種紫杉醇制備的新方法。 在這些方法中，多乙酰紫杉烷通常被作為"雜質"而被除去，造成寶貴 天然資源的極大浪費。因此，在分離純化紫杉醇的同時，將浸膏中這些 豐產紫杉垸經過結構改造，"變廢為寶"生成有用的紫杉醇或者其制藥的
前體意義重大。
發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，針對紫杉醇的 來源緊張問題，從紅豆杉植物材料或者細胞培養(yǎng)物的醇性浸膏中分離紫 杉醇的伺時，將其中高豐度的多乙?；仙纪椋x擇性地轉化為相應的 多羥基紫杉烷，生產可被制藥工業(yè)利用的原料，特別針對多乙酰紫杉垸
化合物巴卡亭VI轉化成為多羥基紫杉烷化合物四去乙酰巴卡亭VI、將多
乙酰紫杉烷化合物云南寧轉化成為多羥基紫杉烷化合物四去乙酰云南 寧。
本發(fā)明的一種制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，包括
(1) 樹脂柱分離步驟將紅豆杉植物組織或細胞培養(yǎng)物的甲醇或乙醇浸 膏加載到大孔樹脂柱上，用含甲醇20% 40%的水溶液沖洗，除去水
溶性雜質或色素，再用含甲醇50% 80%的水溶液沖洗，收集3倍柱 體積的洗脫液，將洗脫液中的甲醇蒸干，加入等體積的與水互不相 溶的萃取溶劑進行液-液萃取，收集有機溶劑層，蒸干，得到大孔樹 脂柱分離粗品，所述百分比均為體積百分比；
(2) 氧化鋁層析柱分離步驟用甲醇與二氯甲烷混合液溶解大孔樹脂柱
分離粗品，上樣于氧化鋁柱上，大孔樹脂柱分離粗品與氧化鋁的質
量比為1/60 1/100，進行中低壓正相層析，用甲醇與二氯甲垸混
合液洗脫，薄層層析結合高效液相色譜方法檢測流分，獲得富含多 乙酰紫杉烷的流分，以及富含紫杉醇的流分，減壓蒸干溶劑，獲得
含多乙酰紫杉烷粗品以及紫杉醇粗品；
(3) 水解反應步驟向含多乙酰紫杉烷粗品中添加極性有機溶劑,再加 入堿性溶液或者懸液，使整個溶液pH值為9 11，極性有機溶劑占
整個溶液體積的30% 60%，攪拌反應0. 5 1小時，用薄層層析方 法檢測反應液中無多乙酰紫杉烷時，反應完成，將整個溶液過濾， 濾液為富含多羥基紫杉垸的多羥基紫杉垸溶液；
(4) 多羥基紫杉烷的固相萃取步驟用鹽酸將多羥基紫杉烷溶液的pH 值調至3.5 6,加入處理好的聚酰胺吸附樹脂，攪拌3 5小時，用 薄層層析方法檢驗溶液中無多羥基紫杉垸時停止攪拌，過濾，將聚 酰胺吸附樹脂裝入玻璃層析柱中；
(5) 多羥基紫杉垸的洗脫步驟用pH值為2. 5 4. 5的擰檬酸水溶液洗 滌聚酰胺柱，脫除其中色素和生物堿類雜質；用2倍柱體積的體積 濃度為40%-60%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫流分，回收其中的醇， 向殘液中加入等體積的二氯甲垸，充分震蕩后萃取，將有機溶劑層 分離，蒸干有機溶劑所得的固體物質即為含多羥基紫杉烷粗品；
(6) 紫杉醇的純化步驟將步驟(2)得到的紫杉醇粗品，用中壓反相 液相層析柱分離，再結晶獲得純度接近99. 5%紫杉醇深度分離品；
(7) 多羥基紫杉垸的純化步驟將步驟(5)中得到的含多羥基紫杉烷 粗品，用中壓反相液相層析柱分離，再結晶獲得純度大于98%多羥 基紫杉烷深度分離品。
所述的制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于
所述樹脂柱分離步驟中，所述大孔樹脂柱中填充的大孔樹脂為非極
性大孔苯乙烯吸附樹脂；所述萃取溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯中 的一種。
所述的制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于 所述氧化鋁層析柱分離步驟中，所述氧化鋁柱填料為層析用氧化鋁
填料，粒徑為100目，濕法填裝成高徑比為15: 1 20: 1的層析柱，用體積比二氯甲烷甲醇=97: 3 99: 1的洗脫液洗脫2個柱體積，用體積 比二氯甲烷甲醇=95: 5 90: 10的洗脫液洗脫2個柱體積，層析柱壓 力為5 20bar，流速為1 5ml/min，用高效液相色譜方法測定洗脫液的 濃度。
所述的制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征在于 所述水解反應步驟中，所述極性有機溶劑為丙酮、乙腈、甲醇中的 一種；加入的堿性溶液為質量百分比10% 20%碳酸鉀水溶液、10% 20% 碳酸鈉水溶液或者氫氧化鈣懸液中的一種；攪拌速率為120 r/min 60 r/min。
所述的制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征在于 所述多羥基紫杉垸的固相萃取步驟中，所述的聚酰胺樹脂是粒徑為 30 60目的層析用聚酰胺樹脂填料粉末，濕法填裝到直徑為0. 6cm 1. 5 cm的玻璃柱，填料的禽度與柱直徑的比為10: 1 20: 1;每克干樹脂上 樣量為10 mg 50 mg，洗脫流速為2 BV.h-'。
所述的制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于 所述紫杉醇的純化步驟中，
所述中壓反相液相層析柱分離的過程為將紫杉醇粗品用甲醇溶解， 上C18反相填料，在20 40bar壓力范圍，用體積比甲醇水為4: 1洗 脫，收集正組分，于3(TC 5(TC減壓蒸餾至干；
所述結晶過程為對反相層析蒸干的正組分，再加入體積濃度為
80% 95%的甲醇正己烷溶液，3(TC 40'C下充分溶解，趁熱過濾，將濾 液放置到0。C 6。C冷凍結晶，晶體即為純度接近99. 5%的紫杉醇精品；
所述的制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于-所述多羥基紫杉烷的純化步驟中，
所述中壓反相液相層析柱分離的過程為將多羥基紫杉垸粗品用甲 醇溶解，上C18反相填料，在20 40 bar壓力范圍，用體積比甲醇水 =3: 2洗脫，收集正組分，于30'C 5(TC減壓蒸餾至干；
所述結晶過程為對反相層析蒸干的正組分，再加入體積濃度為
70% 90%的甲醇乙酸乙酯溶液，3(TC 4(TC下充分溶解，趁熱過濾，將 濾液放置到0'C 6。C冷凍結晶，晶體即為純度大于98%的多羥基紫杉烷 深度分離品。
經申請人用高效液相色譜方法(HPLC)和液一質聯(lián)用(LC-MS)分 析，發(fā)現(xiàn)多乙酰紫杉烷化合物巴卡亭VI (bacctin VI)的含量占中國紅 豆杉枝葉干重的0.2%，比taxol 0.007%高出2個數(shù)量級；采用現(xiàn)有細胞 培養(yǎng)方法，云南寧(taxuyunnanine C)在中國紅豆杉細胞培養(yǎng)體系產量 可達400 mg/L，而紫杉醇(taxol)的平均產量僅有20 mg/L;本發(fā)明將 這些高豐度的多乙酰紫杉烷選擇性的轉化為相應的多羥基紫杉垸，生產 可被制藥工業(yè)利用的原料，顯著降低原料的成本、提高生物資源的利用 度。所述多羥基紫杉烷是指具有四去乙酰巴卡亭VI (7， 9， 10， 13 — deacetyl—bacctin VI)或者四去乙酰云南寧(2， 5， 10， 14一deacetyl —taxuyunnanine C)結構骨架特征之一、在C7、 C9、 CIO、 C13、 C14、 C5這些任意3個或以上位點具有羥基取代的紫杉二萜類物質。對多乙酰 紫杉烷化合物巴卡亭VI進行選擇性乙酰水解，就是去掉其C7、 C9、 CIO、 C13位的乙酰基，使之成為相應構型的多羥基紫杉烷化合物四去乙酰巴卡 亭VI，但保留C4位上的乙?；虲2位的苯甲酰基，生成的多羥基紫杉
烷化合物四去乙酰巴卡亭vi,可方便的再修飾成為io—去乙酰巴卡亭ni
(將C9位上羥基脫氫，變?yōu)轸驶?；同樣，對云南寧進行選擇性乙酰水
解，將其C2、 C5、 CIO、 C14位上的乙酰基轉化成化合物四去乙酰云南寧 (2， 5， 10， 14一deacety1 —taxuyun醒ine C)，將縮短14—P —羥基 去乙酰巴卡亭(ortataxel)的合成路線。
本發(fā)明所具有的優(yōu)越性為
(1) 利用本發(fā)明的水解反應步驟，轉化多乙酰紫杉烷為多羥基紫杉垸， 顯著降低原料中紫杉垸類化合物的流失，擴大了紫杉垸原料的來源。如 果按生成每摩爾紫杉醇(或者第二代、三代紫杉醇)需要1摩爾生物合 成來源的紫杉烷化合物進行推算，利用本發(fā)明可以獲得更多可被制藥工 業(yè)利用的紫杉垸，相當于比現(xiàn)有工藝增加了 13——20倍的紫杉醇原料來 源，資源利用度顯著增加。
(2) 利用本發(fā)明所述技術制備的多羥基紫杉垸可作為制藥有用的原 料，因為多羥基紫杉烷母核上的羥基相當于在母核上引入多個"鉚釘"， 利用在這些"鉚釘"良好的反應性和結合能力，可以更容易、更方便的 在相應的位點上進行后續(xù)的基團保護、取代基消除、或者酰化等修飾。 特別是利用本發(fā)明制備的四去乙酰巴卡亭VI和本來就具有C14取代的四 去乙酰云南寧出發(fā)，比從巴卡亭III出發(fā)到第三代紫杉醇類藥物14一 0 一羥基去乙酰巴卡亭，合成路線更短，技術上更容易實現(xiàn)。
(3) 利用本發(fā)明，不僅可以將紅豆杉植物組織或細胞培養(yǎng)為浸膏中的 高豐度多乙?；仙价x擇性轉化為相應的多羥基紫杉烷，還可以將浸 膏中存在的紫杉醇進行分離和純化，紫杉醇的收率與現(xiàn)有技術持平或略 高，實現(xiàn)了紫杉醇與多羥基紫杉垸同步生產。
圖l為紫杉醇(taxol)分子結構； 圖2為泰索帝(taxotere)分子結構；
圖3為14—e—羥基去乙酰巴卡亭(ortataxel)分子結構； 圖4為10 —去乙酰巴卡亭III (10-deacetyl-bacctin III)分子 結構；
圖5為巴卡亭I11 ( bacctin III)分子結構； 圖6為巴卡亭VI (bacctin VI)分子結構； 圖7為云南寧(taxuyunnanine C)分子結構；
圖8為四去乙酰巴卡亭VI (7， 9， 10, 13—deacetyl—bacctin VI) 分子結構；
圖9為四去乙酰云南寧(2， 5, 10， 14—deacetyl —t訓yun腿ine C)分子結構；
圖IO為巴卡亭VI (bacctin VI)選擇性乙酰水解生成四去乙酰巴卡 亭VI (7， 9， 10， 13 —deacetyl—bacctin VI)的反應式；
圖11為云南寧(taxuyunnanine C)選擇性乙酰水解生成四去乙酰 云南寧(2, 5， 10， 14—deacetyl —taxuyurmanine C)的反應式。
具體實施例方式
實施例1從中國紅豆杉枝葉浸膏中同步制備紫杉醇和多羥基紫杉垸
(1) 樹脂柱分離步驟取中國紅豆杉枝葉甲醇提取濃縮后的浸膏10g，
經HPLC分析含紫杉醇0. 2 % (20mg)、含巴卡亭VI約為5. 7% (570mg )， 用甲醇溶解，加載到非極性大孔苯乙烯吸附樹脂XAD16的樹脂柱上，用 含甲醇30%的水溶液沖洗，洗去水溶性雜質或色素；再用3倍柱體積含甲 醇50%的水溶液洗脫，收集該洗脫液，將其中甲醇蒸干，加入等體積的乙 酸乙酯作為萃取溶劑進行液-液萃取，收集乙酸乙酯層，蒸干，得到1.45g 大孔樹脂柱分離粗品，經HPLC分析含紫杉醇1. 3 % (18.8mg)、含巴卡 亭VI約為39y。
(565mg );紫杉醇收率為94%;巴卡亭VI收率，99%。
(2) 氧化鋁層析柱分離步驟取粒徑為100目的層析用氧化鋁填料，用
濕法填裝成高徑比為16: 1的層析柱，將上述1.45g大孔樹脂柱分離粗
品用體積比1: 99的甲醇與二氯甲垸混合液溶解，上樣于氧化鋁柱上，
大孔樹脂柱分離粗品與氧化鋁的質量比為1/100;先用二氯甲烷甲醇體 積比為97: 3的洗脫液洗脫2個柱體積，獲得富紫杉醇的流分340 ml; 再用二氯甲烷甲醇體積比為95: 5的洗脫液洗脫，獲得富含多乙酰紫杉 垸的流分340 ml;層析柱壓力為5bar，流速為lml/min，分別減壓蒸干 上述收集的2部分流分，用薄層層析結合高效液相色譜方法檢測，獲得 含紫杉醇59. 3%的粗品32mg;含巴卡亭V18(m的粗品706mg;
(3) 水解反應步驟向上述706mg含巴卡亭VI的粗品中添加甲醇20ml， 質量比2096的碳酸鉀水溶液37ml，甲醇約占溶液總體積的30%， pH為10， 120 r/min轉速攪拌反應，約1小時后，用TLC方法檢測指示反應液中 無巴卡亭VI，隨結束反應，將整個溶液過濾，濾液為富含四去乙酰巴卡 亭VI的溶液；
(4) 多羥基紫杉垸的固相萃取步驟用鹽酸將上述多羥基紫杉烷溶液的 pH值調至5，加入處理好的粒徑為30 60目的層析用聚酰胺樹脂填料粉 末，攪拌3小時，用薄層層析方法檢驗溶液中無四去乙酰巴卡亭VI時停 止攪拌，過濾，將聚酰胺吸附樹脂裝入直徑為0.6cm玻璃層析柱中，填 料的高度與柱直徑的比為20: 1;每克干樹脂載樣量為10 mg,洗脫流速 為2 BV. h-、
(5) 多羥基紫杉垸的洗脫步驟用pH為3. 5的檸檬酸水溶液洗滌聚酰 胺柱，脫除其中色素和生物堿類雜質，用2倍柱體積(34ml)的體積濃 度為60%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫流分，回收其中甲醇，向殘液中加 入等體積的二氯甲垸，充分震蕩后萃取，將二氯甲垸層分離，蒸干有機 溶劑，得到300 mg的固體物質，經HPLC分析四去乙酰巴卡亭VI的含量 為82%，轉化率為60%、分離收率為95%;
(6) 紫杉醇的純化步驟將上述獲得的32mg 59.3% (HPLC分析)紫杉
醇的粗品用0. 5ml甲醇溶解，在壓力為20 bar下，用C18制備型中壓反 相液相層析柱分離，用甲醇與水的體積比為4: l的流動相洗脫，收集正 組分，于3(TC減壓蒸餾至干，加入體積百分比為80%的甲醇正己烷溶液 2ml，3(TC下充分溶解，趁熱過濾，將濾液放置到(rC冷凍結晶，獲得15. 8mg 晶體純度為99.5%紫杉醇精品；紫杉醇總收率79%; (7)多羥基紫杉烷的純化步驟將上述獲得的300 mg 82%的四去乙酰 巴卡亭VI粗品用lml甲醇溶解，在壓力為40 bar下，用C18制備型中 壓反相液相層析柱分離，用甲醇與水的體積比為3: 2的流動相洗脫，收 集正組分，于3(TC減壓蒸餾至干，加入體積百分比為為80%的甲醇乙酸 乙酯4ml， 4(TC下充分溶解，趁熱過濾，將濾液放置到Ot:冷凍結晶，獲 得192 mg的98%晶體四去乙酰巴卡亭VI ，紫杉烷資源利用度為19 (倍)。
實施例2從中國紅豆杉細胞培養(yǎng)物浸膏中同步制備紫杉醇和多羥基紫杉 院
(1) 樹脂柱分離步驟取中國紅豆杉細胞甲醇提取濃縮后的浸膏5g， 經HPLC分析含紫杉醇1% (50mg)、含云南寧約為16% (800mg)。用 甲醇溶解，加載到非極性大孔苯乙烯吸附樹脂XAD1180的樹脂柱上，用 甲醇含20%的水溶液沖洗，洗去水溶性雜質或色素；再用3倍柱體積含甲 醇80%的水溶液洗脫，收集該洗脫液，將其中甲醇蒸干，加入等體積的氯 仿進行液-液萃取，收集氯仿層，蒸干，得到2.65g大孔樹脂柱分離粗品， 經HPLC分析含紫杉醇1. 8 % (47mg)、含云南寧約為30% (795 mg); 紫杉醇收率為94%;云南寧收率，99%。
(2) 氧化鋁層析柱分離步驟取粒徑為100目的層析用氧化鋁填料，用 濕法填裝成髙徑比為20: 1的層析柱，將上述2. 65g大孔樹脂柱分離粗 品體積比1: 99的甲醇與二氯甲烷混合液溶解，上樣于氧化鋁柱上，大 孔樹脂柱分離粗品與氧化鋁的質量比為1/60 ;先用二氯甲烷甲醇體積
比為99: 1的洗脫液洗脫2個柱體積，獲得富紫杉醇的流分；再用二氯 甲烷甲醇體積比為96:4的洗脫液洗脫，獲得富含多乙酰紫杉烷的流分； 層析柱壓力為20 bar,流速為5ml/min,分別減壓蒸干上述收集的2部 分流分，用薄層層析結合高效液相色譜方法檢測，獲得含紫杉醇60%的粗 品78 mg;含云南寧83%的粗品910 mg;
(3) 水解反應步驟向上述910 mg含云南寧的粗品中添加丙酮25 ml， 質量比10%碳酸鈉水溶液25 ml,丙酮約占溶液總體積的50%， pH為9， 60 r/min轉速攪拌反應，約0. 5小時后，用TLC方法檢測指示反應液中 無巴卡亭VI，隨結束反應，將整個溶液過濾，濾液為富含四去乙酰巴卡 亭VI的溶液；
(4) 多羥基紫杉烷的固相萃取步驟用鹽酸將上述多羥基紫杉烷溶液的 pH值調至3. 5，加入處理好的粒徑為30 60目的層析用聚酰胺樹脂填 料粉末，攪拌5小時，用薄層層析方法檢驗溶液中無四去乙酰云南寧時 停止攪拌，過濾，將聚酰胺吸附樹脂裝入直徑為1.5cm玻璃層析柱中， 填料的高度與柱直徑的比為10: 1;每克干樹脂上樣量為30 mg,洗脫流 速為2 BV. h—、
(5) 多羥基紫杉烷的洗脫步驟用pH為4. 5的檸檬酸水溶液洗滌聚酰 胺柱，脫除其中色素和生物堿類雜質，用2倍柱體積、體積濃度為50% 的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫流分，回收其中甲醇，再向殘液中加入等 體積的二氯甲烷，充分震蕩后萃取，將二氯甲烷層分離，蒸干有機溶劑， 得到299mg的固體物質，經HPLC分析四去乙酰云南寧的含量為8(m，轉 化率為50%，分離收率為95%;
(6) 紫杉醇的純化步驟將上述獲得的78 mg 60% (HPLC分析)紫杉醇 的粗品用0. 5ml甲醇溶解，在壓力為40 bar下，用C18制備型中壓反相 液相層析柱分離，用甲醇與水的體積比為4: l的流動相洗脫，收集正組 分，于50'C減壓蒸餾至干，加入體積百分比為為95%的甲醇正己烷溶液
2ml， 4(TC下充分溶解，趁熱過濾，將濾液放置到6°C冷凍結晶，獲得 37 mg晶體純度為99. 5%紫杉醇精品；
(7)多羥基紫杉垸的純化步驟將上述獲得的299 mg 80 %四去乙酰云 南寧粗品用1. 5 ml甲醇溶解，在壓力為40 bar下，用C18制備型中壓 反相液相層析柱分離，用甲醇與水的體積比為3: 2的流動相洗脫，收 集正組分，于50。C減壓蒸餾至干，加入體積百分比為為90%的甲醇乙酸 乙酯4ml， 30°C下充分溶解，趁熱過濾，將濾液放置到4-C冷凍結晶， 獲得233.4 mg 98%的晶體四去乙酰云南寧。
實施例3從南方紅豆杉枝葉浸膏中同步制備紫杉醇和多羥基紫杉垸
(1) 樹脂柱分離步驟取南方紅豆杉枝葉甲醇提取濃縮后的浸膏l(xiāng) Kg， 經HPLC分析含紫杉醇0. 18 % (1.8g)、含巴卡亭VI (BVI)約為5.5%
(55g )。用甲醇溶解，加載到非極性大孔苯乙烯吸附樹脂XAD16的樹 脂柱上，用含甲醇40%的水溶液沖洗，洗去水溶性雜質或色素；再用3倍 柱體積含甲醇70%的水溶液洗脫，收集該洗脫液，將其中甲醇蒸干，加入 等體積的二氯甲烷作為萃取溶劑進行液-液萃取，收集二氯甲烷層，蒸干， 得到1. 43g大孔樹脂柱分離粗品，經HPLC分析含紫杉醇1. 2 % (1. 717)、 含巴卡亭VI約為4(m (53.9g );紫杉醇收率為95%;巴卡亭VI收率， 98%。
(2) 氧化鋁層析柱分離步驟取粒徑為100目的層析用氧化鋁填料，用
濕法填裝成高徑比為15: l的層析柱，將上述143g大孔樹脂柱分離粗品 用體積比2: 98的甲醇與二氯甲烷混合液溶解，上樣于氧化鋁柱上，大 孔樹脂柱分離粗品與氧化鋁的質量比為1/80;先用二氯甲垸甲醇體積 比為98: 2的洗脫液洗脫2個柱體積，獲得富紫杉醇的流分；再用二氯 甲垸甲醇體積比為90: 10的洗脫液洗脫，獲得富含多乙酰紫杉烷的流 分；層析柱壓力為15bar，流速為3ml/min，分別減壓蒸干上述收集的2
部分流分，用薄層層析結合高效液相色譜方法檢測，獲得含紫杉醇49.5% 的粗品3.399 g;含巴卡亭VI82。/。的粗品62.445 g;
(3) 水解反應步驟向上述62. 445 g含巴卡亭VI的粗品中添加乙腈 300 ml,氫氧化鈣懸液200 ml，乙腈約占溶液總體積的60%, pH為ll， 100 r/min轉速攪拌反應，約45 min后，用TLC方法檢測指示反應液 中無巴卡亭VI，隨結束反應，將整個溶液過濾，濾液為富含四去乙酰巴 卡亭VI的溶液；
(4) 多羥基紫杉垸的固相萃取步驟用鹽酸將上述多羥基紫杉垸溶液的 pH值調至6，加入處理好的粒徑為30 60目的層析用聚酰胺樹脂填料 粉末，攪拌4小時，用薄層層析方法檢驗溶液中無四去乙酰巴卡亭VI時 停止攪拌，過濾，將聚酰胺吸附樹脂裝入直徑為1.4 cm玻璃層析柱中， 填料的高度與柱直徑的比為15: 1;每克干樹脂載樣量為50 mg ，洗脫流 速為2 BV.h—、
(5) 多羥基紫杉烷的洗脫步驟用pH為2. 5的檸檬酸水溶液洗滌聚酰 胺柱，脫除其中色素和生物堿類雜質，用2倍柱體積的體積濃度為40%的 甲醇水溶液洗脫，收集洗脫流分，回收其中甲醇，向殘液中加入等體積 的二氯甲烷，充分震蕩后萃取，將二氯甲烷層分離，蒸干有機溶劑，得 到26. 41g的固體物質，經HPLC分析四去乙酰巴卡亭VI的含量為85%， 轉化率為58.5 %、分離收率為98%;
(6) 紫杉醇的純化步驟將上述獲得的3.399 g (HPLC分析含紫杉醇 49.5%)紫杉醇的粗品用甲醇溶解，在壓力為30 bar下，用C18制備型 中壓反相液相層析柱分離，用甲醇與水的體積比為4: l的流動相洗脫， 收集正組分，于4(TC減壓蒸餾至干，加入體積百分比為為90%的甲醇正 己垸溶液100 ml， 35°C下充分溶解，趁熱過濾，將濾液放置到4°C冷 凍結晶，獲得1. 353 g晶體純度為99. 5%紫杉醇精品；
(7) 多羥基紫杉垸的純化步驟將上述獲得的26. 41g 85%的四去乙酰
巴卡亭VI粗品用甲醇溶解，在壓力為20 bar下，用C18制備型中壓反 相液相層析柱分離，用甲醇與水的體積比為3: 2的流動相洗脫，收集 正組分，于4(TC減壓蒸餾至干，加入體積百分比為為70%的甲醇乙酸乙 酯4ml， 40°C下充分溶解，趁熱過濾，將濾液放置到6t:冷凍結晶，獲 得20.653 g98y。的晶體四去乙酰巴卡亭VI ，紫杉烷資源利用度為20(倍)。
多羥基紫杉烷的分析方法HPLC/MS和麗R結構確認，用HPLC定 量，用TLC方法粗略分析。
轉化率的計算(實際產量/理論產量)X100%; 紫杉烷資源利用度的計算 紫杉烷資源利用度=(AXB) / (CXD);
其中，A為步驟(7)中四去乙酰巴卡亭VI (或四去乙酰云南寧) 實際產量；B為紫杉醇相對分子質量853; C為步驟(6)中紫杉醇實際產 量；D為四去乙酰巴卡亭VI (或四去乙酰云南寧)相對分子質量。
權利要求
1. 一種制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，包括(1)樹脂柱分離步驟將紅豆杉植物組織或細胞培養(yǎng)物的甲醇或乙醇浸膏加載到大孔樹脂柱上，用含甲醇20％～40％的水溶液沖洗，除去水溶性雜質或色素，再用含甲醇50％～80％的水溶液沖洗，收集3倍柱體積的洗脫液，將洗脫液中的甲醇蒸干，加入等體積的與水互不相溶的萃取溶劑進行液-液萃取，收集有機溶劑層，蒸干，得到大孔樹脂柱分離粗品，所述百分比均為體積百分比；(2)氧化鋁層析柱分離步驟用甲醇與二氯甲烷混合液溶解大孔樹脂柱分離粗品，上樣于氧化鋁柱上，大孔樹脂柱分離粗品與氧化鋁的質量比為1/60～1/100，進行中低壓正相層析，用甲醇與二氯甲烷混合液洗脫，薄層層析結合高效液相色譜方法檢測流分，獲得富含多乙酰紫杉烷的流分，以及富含紫杉醇的流分，減壓蒸干溶劑，獲得含多乙酰紫杉烷粗品以及紫杉醇粗品；(3)水解反應步驟向含多乙酰紫杉烷粗品中添加極性有機溶劑，再加入堿性溶液或者懸液，使整個溶液pH值為9～11，極性有機溶劑占整個溶液體積的30％～60％，攪拌反應0.5～1小時，用薄層層析方法檢測反應液中無多乙酰紫杉烷時，反應完成，將整個溶液過濾，濾液為富含多羥基紫杉烷的多羥基紫杉烷溶液；(4)多羥基紫杉烷的固相萃取步驟用鹽酸將多羥基紫杉烷溶液的pH值調至3.5～6，加入處理好的聚酰胺吸附樹脂，攪拌3～5小時，用薄層層析方法檢驗溶液中無多羥基紫杉烷時停止攪拌，過濾，將聚酰胺吸附樹脂裝入玻璃層析柱中；(5)多羥基紫杉烷的洗脫步驟用pH值為2.5～4.5的檸檬酸水溶液洗滌聚酰胺柱，脫除其中色素和生物堿類雜質；用2倍柱體積的體積濃度為40％-60％的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫流分，回收其中的醇，向殘液中加入等體積的二氯甲烷，充分震蕩后萃取，將有機溶劑層分離，蒸干有機溶劑所得的固體物質即為含多羥基紫杉烷粗品；(6)紫杉醇的純化步驟將步驟(2)得到的紫杉醇粗品，用中壓反相液相層析柱分離，再結晶獲得純度接近99.5％紫杉醇深度分離品；(7)多羥基紫杉烷的純化步驟將步驟(5)中得到的含多羥基紫杉烷粗品，用中壓反相液相層析柱分離，再結晶獲得純度大于98％多羥基紫杉烷深度分離品。
2. 如權利要求1所述的制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述樹脂柱分離步驟中，所述大孔樹脂柱中填充的大孔樹脂為非極 性大孔苯乙烯吸附樹脂；所述萃取溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一種。
3. 如權利要求1所述的制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述氧化鋁層析柱分離步驟中，所述氧化鋁柱填料為層析用氧化鋁 填料，粒徑為100目，濕法填裝成高徑比為15: 1 20: 1的層析柱，用 體積比二氯甲烷甲醇=97: 3 99: 1的洗脫液洗脫2個柱體積，用體積 比二氯甲烷甲醇=95: 5 90: 10的洗脫液洗脫2個柱體積，層析柱壓 力為5 20bar，流速為1 5ml/min，用高效液相色譜方法測定洗脫液的 濃度。
4. 如權利要求1所述的制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征 在于 所述水解反應步驟中，所述極性有機溶劑為丙酮、乙腈、甲醇中的一種；加入的堿性溶液為質量百分比10% 20%碳酸鉀水溶液、碳酸鈉水 溶液或者氫氧化鈣懸液中的一種；攪拌速率為120 r/min 60 r/min。
5. 如權利要求1所述的制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述多羥基紫杉烷的固相萃取步驟中，所述的聚酰胺樹脂是粒徑為 30 60目的層析用聚酰胺樹脂填料粉末，濕法填裝到直徑為0.6cm 1.5 cm的玻璃柱，填料的高度與柱直徑的比為10: 1 20: 1;每克干樹脂上 樣量為10 mg 50 mg，洗脫流速為2 BV. h、
6. 如權利要求1所述的制備多羥基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征 在于-所述紫杉醇的純化步驟中，所述中壓反相液相層析柱分離的過程為將紫杉醇粗品用甲醇溶解， 上C18反相填料，在20 40bar壓力范圍，用體積比甲醇水為4: 1洗 脫，收集正組分，于3(TC 50。C減壓蒸餾至干；所述結晶過程為對反相層析蒸干的正組分，再加入體積濃度為80% 95%的甲醇正己垸溶液，3(TC 40。C下充分溶解，趁熱過濾，將濾 液放置到0。C 6。C冷凍結晶，晶體即為純度接近99. 5%的紫杉醇精品。
7. 如權利要求1所述的制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述多羥基紫杉垸的純化步驟中，所述中壓反相液相層析柱分離的過程為將多羥基紫杉烷粗品用甲 醇溶解，上C18反相填料，在20 40 bar壓力范圍，'用體積比甲醇水 二 3: 2洗脫，收集正組分，于3(TC 50'C減壓蒸餾至干；所述結晶過程為對反相層析蒸干的正組分，再加入體積濃度為70% 90%的甲醇乙酸乙酯溶液，30'C 4(TC下充分溶解，趁熱過濾，將 濾液放置到ox: 6-c冷凍結晶，晶體即為純度大于98%的多羥基紫杉垸 深度分離品。
全文摘要
一種制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法，屬于天然藥物化學物質或藥品原料的制造方法，針對紫杉醇的來源緊張問題，從紅豆杉植物材料或者細胞培養(yǎng)物的醇性浸膏中分離紫杉醇的同時，將其中高豐度的多乙酰紫杉烷，選擇性地轉化為相應的多羥基紫杉烷。本發(fā)明包括樹脂柱分離步驟、氧化鋁層析柱分離步驟、水解反應步驟、多羥基紫杉烷的固相萃取步驟、多羥基紫杉烷的洗脫步驟、紫杉醇的純化步驟以及多羥基紫杉烷的純化步驟，獲得純度接近99.5％紫杉醇和純度大于98％的多羥基紫杉烷。本發(fā)明將高豐度的多乙酰紫杉烷選擇性的轉化為相應的多羥基紫杉烷，生產可被制藥工業(yè)利用的原料，顯著降低原料中紫杉烷類化合物的流失、提高生物資源的利用度。
文檔編號A61P35/00GK101391989SQ20081019682
公開日2009年3月25日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權日2008年8月29日
發(fā)明者余龍江, 浩 劉, 敖明章, 碩 李, 趙春芳, 魯明波 申請人:華中科技大學