專利名稱：：一種噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物及其作為Bcl-2家族蛋白拮抗劑的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物及其作為Bcl-2家族蛋白拮抗劑的應用，特別是2-(芳基亞甲基)-5-芳基-7-甲基-3-氧代-2,3二氫-5H-噻唑射3,2-a]嘧啶類化合物與作為Bd-2家族蛋白拮抗劑的應用。該類化合物能夠抑制Bcl-2家族蛋白成員Bcl-XL與天然底物多肽(BMBH3多肽)的結合，可作為Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑用于抑制其抗凋亡活性，并有望開發(fā)成為一類新型的抗腫瘤藥物。
背景技術：
：細胞凋亡(某些情況下又可稱為細胞程序性死亡)是一種去除衰老細胞或異常細胞的正常死亡機制，該機制的紊亂與多種疾病的發(fā)生有直接的關系。自上世紀90年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生是細胞的增殖與凋亡失衡所致(Okad^H.;Mak,T.W.及ev.Omcer2004，《592-603)。研究表明在多種腫瘤細胞中凋亡機制被抑制，腫瘤細胞因而得以過度增生；另外，凋亡機制被抑制也使得腫瘤細胞對化療藥物的抵抗性增強(Igney，F(xiàn).H.;Krammer,P.H.及ev.Omcer2002,2,277-288)。因此，設法恢復腫瘤細胞中的凋亡機制成為當今抗腫瘤藥物設計的—條新思路，在國際上得到了廣泛重視(Reed，J.C.JV抓Jev.Dn^D^cov.2002，J，111-121;Andersen，M.H.;Becker,J.C.;Straten，R淑及ev.Zfecov.2005,《399-409.)。在與細胞凋亡有關的藥物靶點中，Bcl-2(B-celllymphoma2)相關蛋白是較早得到研究的一類。該類蛋白可分為三個家族Bcl-2家族，Bax家族和BH3-only家族。其中，Bcl-2家族成員(Bcl-2，Bc1-Xl，Mcl-l，Bcl-w等)起著抗細胞凋亡的作用，后兩個家族的成員起促細胞凋亡的作用。目前人們認為Bcl-2相關蛋白主要是在細胞凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮作用。其中經(jīng)活化的Bax家族蛋白(Bax、Bak等)可以結合在線粒體膜上使得細胞色素C從線粒體中釋放出來從而最終導致凋亡的發(fā)生；而Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白則能夠與Bax和Bak相結合，使其不能發(fā)揮作用；另外，一些BH3-only家族成員(Bim，Bad，Bid，Bik等)又能夠與Bcl-2家族成員相結合，抑制其抗凋亡作用。因此，Bcl-2相關蛋白之間的平衡與否對細胞凋亡起著至關重要的調控作用。研究表明，多種類型的腫瘤細胞至少過量表達其中一種Bcl-2家族蛋白，但是在正常細胞中這些蛋白的表達水平則相對較低。使用有機小分子拮抗這些蛋白的功能有望恢復腫瘤細胞中的凋亡機制，從而達到消除腫瘤的目的(Huang，Z.O/at.i>Mg￡fecov.Deve/.2000，3,565-574;Cory，S.;Adams，J.M.及ev.C朋cer2002,2，647-656)。有機小分子對Bcl-2家族蛋白的抑制活性通常用熒光偏振(FluorescencePolarization,簡稱FP)方法檢測(Zhang,H.;Ni畫er，P.;Rosenberg,S.H.;Ng,S.C.;Joseph,M.j"a/.2002，307，70-75)。該方法是基于分子在均相溶液中的自由旋轉，當一個熒光標記的分子被一個平面的極化光所激發(fā)時，其發(fā)射光可發(fā)射到一個固定的平面，而該發(fā)射光的極化水平與分子的旋轉速度成反比。熒光標記的小分子在均相體系里處于高速旋轉狀態(tài)，發(fā)射光表現(xiàn)為除極化，得到一個較低的極化值，而非熒光標記的大分子旋轉速度遠遠低于熒光標記的小分子，當小分子和大分子發(fā)生特異性結合后，復合物的旋轉速度與大分子的旋轉速度相比變化不明顯，而遠遠低于熒光標記小分子的旋轉速度，極化值顯著升高。當該方法用于檢測小分子抑制Bcl-2家族蛋白與天然底物多肽的結合時，在熒光標記多肽與蛋白共存的體系中加入待測化合物，如果化合物也能夠與蛋白特異性結合，則會與熒光標記多肽發(fā)生競爭從而抑制其與蛋白的結合，進而導致熒光極化值降低。因此通過檢測熒光極化值的變化情況就可以測得化合物的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物。本發(fā)明的第二個目的是提供一種噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物用于制備抑制Bcl-XL與天然底物多肽結合的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的應用。本發(fā)明所提供的一種新的噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物具有如下的結構式式中R為(Z)-l-芐基-lH卩引哚-3-亞甲基；R2為4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3,4-二乙酰氧基苯基或2,5-二甲氧基苯基；R3為苯胺基或乙氧基。限制條件是當R3為苯胺基時，&為(Z)-l-芐基-lH卩引哚-3-亞甲基，R2為4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3,4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；當R3為乙氧基時，R！為(Z)-l-節(jié)基-lH吲哚-3-亞甲基，R2為4-乙基苯基。本發(fā)明的用于制備抑制Bc1-xl與天然底物多肽結合的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物沒有上述的限制，具體地說是具有如下的結構式的2-(芳基亞甲基)-5-芳基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氫-5H-噻唑射3,2-a]嘧啶類化合物式中Ri為(Z)-l-芐基-lH吲哚-3-亞甲基、(Z)-l-(2-氟芐基)-lH吲哚-3-亞甲基、(E)-l-乙氧羰基甲基-lH吲哚-3-亞甲基、2-吲哚啉酮、(Z)-卩比啶-4-亞甲基、(￡)-5-甲基呋喃-2-亞甲基、(￡)-3-甲基苯基亞甲基、(巧-3-氟苯基亞甲基、(Z)-2，3-二氯苯基亞甲基或(Z)-2,5-二甲氧基苯基亞甲基；R2為苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3,4-二乙酰氧基苯基、2,4-二甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基或噻吩-2-基；R3為苯胺基或乙氧基。沒有前述的限制條件。可以進一步描述為如下的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式VI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式VIIu實驗表明，上述噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物為抑制Bcl-2家族蛋白成員Bcl-x^與天然底物多肽(BidBH3多肽)相結合的有效成分，基于熒光偏振(FP)原理的活性測試表明該類化合物具有微摩爾級的活性。FP方法檢測此類化合物抑制Bc1-xl與N端用5-FAM標記的BidBH3多肽(序列為5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)結合的活性如下1)(2)-2-((1-(2-氟芐基)-111-吲哚)-3-亞甲基)-7-甲基-3-氧代-^苯基-5-(噻吩-2-基)-2，3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIa)的抑制常數(shù)&為0.53^M;2)(Z)-2-((l-節(jié)基1H-卩引哚)-3-亞甲基)-5-(3-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIb)的抑制常數(shù)&為1.8^M;3)(Z)陽5-(2,4-二甲氧基苯基)-7-甲基陽3陽氧代-2-(2-氧代吲哚啉-3-亞基)-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIc)的抑制常數(shù)&為24.5^M;4)0-2-((1-(2-氟芐基)-111-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-氟苯基)-7-甲基-3-氧代-]^苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIId)的抑制常數(shù)&為2.4^M;5)(E)-2-(3-((5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-6-(苯基氨甲?；?-2,3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-2-亞基)甲基)-lH-吲哚)-l-乙酸乙酯(式VIIe)在10^M下的抑制率為44.1%;6)(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(2，5-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代->^-苯基-2,3-二氫-511-噻唑并[3，2-&]嘧啶-6-酰胺(式VIIf)在10下的抑制率為44.1%;7)(￡)-7-甲基-2-((5-甲基呋喃)-2-亞甲基)-3-氧代-乂5-二苯基-2，3-二氫-511-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIg)在10nM下的抑制率為23.4。/o;8)-5-(4-氯苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2-(吡啶-4-亞甲基)-2,3-二氫-511-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIh)在10pM下的抑制率為18.7%;9)(Z)-5-(3-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2-(吡啶-4-亞甲基)-2,3-二氫-511-噻唑并[3,2-3]嘧啶-6-酰胺(式VIIi)在10nM下的抑制率為13.7%;10)(E)-2-(3-氟苯基亞甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIj)在10下的抑制率為6.9%;11)(Z)-2-(2,3-二氯苯基亞甲基)-5-(4-氟苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氫-511-噻唑并[3,2-3]嘧啶-6-酰胺(式VIIk)在10nM下的抑制率為4.6%;12)(Z)-2-(2，5-二甲氧基苯基亞甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧淀-6-甲酸乙酯(式VII1)在10tiM下的抑制率為2.5%;13)(E)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-2-(3-甲基苯基亞甲基)-3-氧代-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIm)在10pM下的抑制率為1.6%;14)02-((1-芐基-111-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-^苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIn)的抑制常數(shù)&為11.6^M;;15)(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-溴苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基陽2,3-二氫-5H-噻挫并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIo)的抑制常數(shù)&為3.8^M;;16)(Z)-2-((1-芐基-111-吲哚)-3-亞甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2,3-二氫-511-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIp)的抑制常數(shù)&為1.4pM;17)(Z)-2-((1-芐基-111-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-乙基)苯基-7-甲基-3-氧代-2,3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIq)的抑制常數(shù)&為1.218)(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-7-甲基-3-氧代—5-苯基-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIr)的抑制常數(shù)&為4.8^M;19)(Z)-2-((1-節(jié)基-11^引哚)-3-亞甲基)-5-(4-乙基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基陽2，3國二氫-5H-噻唑射3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIs)的抑制常數(shù)&為11.2^M;20)(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIt)的抑制常數(shù)&為2.6一21)(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代隱N-苯基-2,3隱二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶陽6-酰胺(式VIIu)的抑制常數(shù)&為4.5^M;本發(fā)明的噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物還可以用于制備抗腫瘤藥物。實驗表明，噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞顯示出抑制活性，是一類具有廣泛應用價值的抗腫瘤先導化合物。其中化合物VIIb對MDA-MB-231的CC5o值(50%CytotoxicConcentration,半數(shù)細胞毒濃度)為5.45^M;化合物VIIc對MCF-7的CCso值為24.56pM。本發(fā)明的有益效果在于所涉及的噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物是一類結構新穎的Bcl-2家族蛋白抑制劑，具有微摩爾級的分子水平抑制活性，而且對腫瘤細胞具有較強的細胞毒活性，因此作為先導化合物具有良好的潛力和應用前景，有望開發(fā)成為靶向Bcl-2家族蛋白的抗腫瘤藥物。圖1-圖12為噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物(Vna~VIIa)的熒光偏振測活曲線圖13-圖14為噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物的MTT測活曲線其中，圖13為噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物VIIb對MDA-MB-231細胞系細胞毒性測定(CC5o=5.45^M);圖14為噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物VIIc對MCF-7細胞系細胞毒性測定(CC50=24.56pM)。具體實施例方式實施例1:(Z)-2-((l-芐基-lH-H引哚)-3-亞甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-23-二氫-5H-噻唑并[3,2-a嘧啶-6-酰胺(式VIIt)的制備一、4-(3，4-二羥基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2，3，4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVd)的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將1.772g(lOmmol)的乙酰乙酰苯胺，761.2mg(lO腿ol)的硫脲，1.381g(lO腿ol)的3，4-二羥基苯甲醛混合，加入25ml乙醇，再加入250mg(1.45mmol)的對甲基苯磺酸，回流反應24小時，直接抽濾，得灰色粉末狀固體式IVd(1.767g，產(chǎn)率50%)。經(jīng)檢測，結構正確，檢測結果如下mp162_166。C;IR(KBr):v3195,1568,1479,1444，1384，1332，1286，1236,1194,1152,1118,932，879,752,692,506cm-1;&NMR(300MHz,DMSO—^):59.87(s,1H)，9.64(s,1H)，9.31(s,1H),8.94(s，1H),8.87(s,1H),7.54(d,/=7.5Hz,2H),7.25(t，/=7.8Hz,2H),7.00(t，《/=7.5Hz，1H),6.65(d，/=8.1Hz，2H)，6.50(dd，/=8.4Hz,/=2.1Hz，1H)，5.24(d,/=2.4Hz,1H),2.04(s，3H);13CNMR(100MHz,CD3OD):5175.4，167.9，146.7，146.5,139.2,135.6，135.0，129.7，125.5,121.8,119.2，116.4,114.9，109.9，57.6，16.7;MS(ESI)(一356(M+Pf),378(M+Na+);HRMS(ESI)(附/z):CalcdforC18H18N303S(M+H+):356.1069,Found:356.1069.二、(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIt)的合成IV_y__yil<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>將0.118g(0.33mmol)的4-(3,4-二羥基苯基)-6-甲基-^苯基-2-硫代-1,2，3，4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVd)，0.032g(0.34mmol)的氯乙酸，0.078g(0.33mmol)的l-節(jié)基-lHB引哚-3-甲醛，0.200g(2.44mmo1)的醋酸鈉，1.0mL(17.47mmol)的醋酸和0.5mL(5.30mmo1)的醋酸酐攪拌混合，換氬氣三次，油浴80度反應過夜，得紅褐色溶液，TLC顯示原料已經(jīng)反應完畢，加冰水10mL，得黃褐色懸濁液，抽濾，水洗，乙醇重結晶得化合物式Vllt(深黃色結晶52mg，產(chǎn)率22%)。經(jīng)檢觀!l，結構正確，檢測結果如下mp247—254°C;IR(KBr):v3277，3059,2924，1771，1706,1641，1598，1568，1519,1502，1467，1440，1385，1370,1335，1257,1214，1186,1162，1111,1013，892,743，701cm";力NMR(300MHz,DMSO—^):(510.06(s,1H),8.12(s,1H),8.07(s，1H)，7.93(d,J=7.5Hz,1H)，7.56(t,/=6.9Hz,3H),7.37—7.16(m,12H),7.07(t,/=7.5Hz,1H),6.26(s,1H),5.62(s，2H)，2.24((!，/=1.5Hz，6H)，2.14(s,3H);13C畫R(100MHz,CDC13):(5168.4，168.1,165.5,165.2，154.4,142.6,142.5,142.0,137.9,137.4,136.7,135.7，130.4，129.2，129.1，129.0，129.0，128.5，128.1,127.3，126.8,126.4,125.2,124.8,124.0，123.9,123.0，122.0,120.5，119.2,114.2，113.6，111.7,110.6，55.5，51.1，21.5,20.9,20.7;MS(ESI)(w妙697(M+f),719(M+Na+),735(M+K+);HRMS(MALDI)(w/z):CalcdforC40H33N4O6S(M+H+):697.2121，F(xiàn)ound:697.2115.實施例2:式VIIf，VIII，VIIn，VIIo，VIIp，VIIq，VIIr，VIIs和VIIu的制備一、式IVa-c,IVe-i的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在與實施例i中合成IVd類似的條件下，從相應的P二羰基化合物式Ia-c，Ie-i，不同取代的醛式IIa-c，IIe-i和硫脲式III得到化合物式IVa-c，IVe-i:4-苯基-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l，2，3,4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVa);4-(4-乙基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l，2，3，4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVb);4-(2，5-二甲氧基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l，2,3，4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVc);4-(4-甲氧基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVe);4-(4-羥基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2,3，4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVf);4-(4-溴苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酰胺(式IVg);4-苯基-6-甲基-2-硫代-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酸乙酯(式IVh);4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫代-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酸乙酯(式IVi)。二、式VIIf，VIII，VIIn，VIIo，VIIp，VIIq，VIIr，VIIs和VIIu的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>產(chǎn)率\(%)(Z)-l-節(jié)基-lHn引哚-3-亞甲基(Z)-2,5-二甲氧基苯基亞甲基(Z)-l-節(jié)基-lH口引哚-3-亞甲基(Z)-l-節(jié)基-lHB引哚-3-亞甲基(Z)-l-節(jié)基-lHn引哚-3-亞甲基(Z)-1陽節(jié)基-1HB引哚-3-亞甲基(Z)-1-節(jié)基陽1Hn引哚-3-亞甲基(Z)-1-節(jié)基隱1H2,5-二甲氧苯胺基2,5-二甲氧吲哚-3-基2,5-二甲氧4-甲氧基苯4-甲氧基苯4-溴苯基4-溴苯基苯胺基苯胺基乙氧基4-乙基苯基乙氧基4-乙基苯基苯胺基4-乙基苯基苯胺基4-乙基苯基l-節(jié)基-lH吲哚-3-基l-卡基-lH口引哚-3-基1-芐基-1H吲哚-3-基i-節(jié)基-m卩引哚-3-基l-節(jié)基-lH口引哚-3-基l-節(jié)基-lH2072241917712uB引哚-3-亞甲基(z)-i-節(jié)基-m口引哚-3-亞甲基4-乙酰氧基苯胺基4-羥基苯基H引哚-3-基i-節(jié)基-mB引哚-3-基29在與實施例1中合成VIIt類似的條件下，從相應的Biginelli產(chǎn)物式IVa陽c，IVe-i和相應的醛式Vf，VI，Vn-s，Vu得到化合物VIIf，VIII，VIIn-s，Iu:(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(2，5-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氫-511-噻唑并[3，2-&]嘧啶-6-酰胺(式VIIf);(Z)-2-(2，5-二甲氧基苯基亞甲基》7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII1);(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3誦二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIn);(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-溴苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIo);(Z)-2-((l-節(jié)基-lH-H引哚)-3-亞甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2,3-二氫-511-噻唑并[3,2-&]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIp);(Z)-2-((l-節(jié)基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-乙基)苯基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氫-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIq);(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-7-甲基-3-氧代—5-苯基-N-苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIr);(Z)-2-((l-芐基-lH-吲哚)-3-亞甲基)-5-(4-乙基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIs);(Z)-2-((l-節(jié)基-lH』引哚)-3-亞甲基)-5-(4-乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIu)。實施例3:噻唑并[3^2-al嘧啶類化合物對Bcl-化抑制作用的熒光偏振檢測谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合的Bc1-xl(GST-Bc1-xl)蛋白在大腸桿菌BL21中表達，經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱親和層析的方法分離純化；熒光標記多肽為N端用5-FAM標記的BidBH3多肽(序列為5-FAM陽QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR);化合物VIIf和VII1，VIIn—VIIu用上述方法制備，其余化合物購自SPECS公司。一、化合物式VlIa-VIId，VIIn-VIIu的抑制常數(shù)測定在測試緩沖液(1x磷酸鹽緩沖溶液，含0.02%(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的lxPBS溶液和化合物不同濃度的DMSO溶液，混勻后室溫避光孵育30min;再加入熒光標記多肽的lxPBS溶液(終濃度為10nM)，使各溶液的總體積均為200pL，混勻后室溫避光孵育20min;將上述溶液及校正溶液l(1nMfluorescein)和校正溶難2(10mMNaOH)各取60pL轉移至黑色384孔板中(平行三組)，立即在酶標儀上進行熒光偏振的檢測，以485nM為激發(fā)波長，535nM為發(fā)射波長，將校正溶液的熒光偏振值定為20mP，測得各濃度下的熒光偏振值(mP)并計算抑制率，擬合得到半數(shù)抑制濃度/C5Q，抑制常數(shù)使用如下公式求得&=50/a丄]50/^l+[尸]0/^l+l)(MM):達到半數(shù)抑制時游離的抑制劑的濃度；[丄]50:達到半數(shù)抑制時游離的熒光標記多肽的濃度；[戶]o:沒有抑制時游離的蛋白濃度；蛋白與熒光標記多肽的解離常數(shù))。結果見表1-表12:表l:化合物VIIa的熒光偏振檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7:化合物VIIp的熒光偏振檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>二、化合物VIIe-VIIm的抑制活性檢測在測試緩沖液(lx磷酸鹽緩沖溶液，含0.02%(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-x^的lxPBS溶液，分別加入DMSO(2pL)和待測化合物的DMSO溶液(終濃度為10pM)，混勻后室溫避光孵育30min;再加入熒光標記多肽的lxPBS溶液(終濃度為10nM)，使各溶液的總體積均為200pL，混勻后室溫避光孵育20min;將上述溶液及校正溶液l(1nMfluorescein)和校正溶液2(10mMNaOH)各取60pL轉移至黑色384孔板中(平行三組)，立即在酶標儀上進行熒光偏振的檢測，以485nM為激發(fā)波長，535nM為發(fā)射波長，將校正溶液的熒光偏振值定為20mP，測得各化合物的熒光偏振值(mP)。抑制率—對照(GST-Bcl-xL/DMSO/熒光標記多肽)mP值-待測化合物mP值°—對照(GST-Bcl-xL/DMSO/熒光標記多肽)mP值-熒光標記多肽mP值X結果見表13:表13:化合物VIIe-VIIm的熒光偏振檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例5:噻唑并3J-a嘧啶類化合物對人乳腺癌MCF-7細胞系的細胞毒性檢測一、化合物VIIb-VIIe在10下對MCF-7細胞抑制率測定6X104/mlMCF-7細胞懸液100[iL每孔，孵育一天后，與不同的待測化合物溶液混合(終濃度10pM)，37°C，5。/。C02培養(yǎng)4天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算細胞抑制率。細胞抑制率％=陰性對照組OD值-化合物組OD值陰性對照組OD值xl00%表8:化合物VIIb-VIIe在10下對MCF-7細胞抑制率測定<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>二、化合物VIIc對MCF-7的細胞毒性檢測6xlO"mlMCF-7細胞懸液100jaL每孔，孵育一天后，加入混合了不同濃度化合物的DMEM培養(yǎng)液，37°C，5%0)2培養(yǎng)4天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算0:5()值(50%CytotoxicConcentration)為24.56^M。細胞存活率％=實驗孔OD值-空白孔OD值對照孑LOD值-空白孔OD值表9:化合物VIIc對MCF-7細胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權利要求1、一類噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物，其特征是具有如下的結構式式中R1為(Z)-1-芐基-1H吲哚-3-亞甲基；R2為4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；R3為苯胺基或乙氧基。限制條件是當R3為苯胺基時，R1為(Z)-1-芐基-1H吲哚-3-亞甲基，R2為4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；當R3為乙氧基時，R1為(Z)-1-芐基-1H吲哚-3-亞甲基，R2為4-乙基苯基。2、一類噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物用于制備Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑或抗腫瘤藥物的應用，所述的噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物具有如下的結構式式中為(Z)-l-芐基-lHB引哚-3-亞甲基、(Z)-l-(2-氟卡基)-lH噴哚-3-亞甲基、(J5)-l-乙氧羰基甲基-lHU引哚-3-亞甲基、2-吲哚啉酮、(2)-吡啶-4-亞甲基、(￡)-5-甲基呋喃-2-亞甲基、(￡)-3-甲基苯基亞甲基、(￡)-3-氟苯基亞甲基、(Z)-2,3-二氯苯基亞甲基或(Z)-2,5-二甲氧基苯基亞甲基；R2為苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基、2，4-二甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基或噻吩-2-基；R3為苯胺基或乙氧基。3、如權利要求2所述的一類噻唑并[3,2-a]嘧啶類化合物的應用，其特征是所述的Bcl-2家族蛋白是Bc1-xl、Bcl-2或Mcl-l。全文摘要本發(fā)明公開了一類噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物及其制備Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的應用。本發(fā)明的噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物具有如上的結構式該噻唑并[3，2-a]嘧啶類化合物具有微摩爾級的抑制Bcl-x_L與天然底物多肽(BidBH3多肽)結合的活性，可作為Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑，抑制其抗凋亡活性；而且該類化合物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞顯示出一定的抑制活性，有望開發(fā)成為靶向Bcl-2家族蛋白的抗腫瘤藥物。文檔編號A61P35/00GK101348495SQ20081004190公開日2009年1月21日申請日期2008年8月20日優(yōu)先權日2008年8月20日發(fā)明者飚俞,周炳城,張興龍,朱翠俠,勛李,李雯雯,王任小,石志敏申請人:中國科學院上海有機化學研究所