一種青霉噻唑酸和/或脫羧青霉噻唑酸的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 青霉嚷挫酸和脫簇青霉嚷挫酸是青霉素類抗生素的降解物。青霉素類藥物的 0-內酷胺環(huán)化學性質不穩(wěn)定，與堿、酸、重金屬、徑胺和青霉素酶作用時，均易發(fā)生水解反 應和分子重排，導致內酷胺環(huán)開環(huán)而失去抗菌活性。青霉嚷挫酸和脫簇青霉嚷挫酸就是 0-內酷胺環(huán)發(fā)生水解反應和分子重排后的降解產(chǎn)物。
[0003] 牛奶是一種大眾日常的消費品，隨著人們對食品安全要求日益提高，牛奶的安全 質量問題也越來越為人們重視。但從我國國內養(yǎng)殖環(huán)境來看，在我國大部分地區(qū)，特別是廣 大農(nóng)村地區(qū)的動物和飼料生產(chǎn)過程中，仍存在超量或超范圍使用抗生素、不嚴格執(zhí)行藥物 配伍禁忌或停藥期規(guī)定的情況，甚至會存在使用違禁抗生素等現(xiàn)象。因食物鏈傳遞，牛奶中 大量殘留的抗生素會對人體造成危害。另外，從乳制品加工的角度來看，原料乳中殘留的抗 生素會嚴重影響干酪、黃油和發(fā)酵乳的起酵或后期風味的形成。
[0004] 現(xiàn)有技術匯中，原料乳和/或液態(tài)乳制品中殘留的青霉嚷挫酸和脫簇青霉嚷挫酸 的檢測方法主要有高效液相色譜法（冊LC)和液相色譜-質譜（HPLC-MS/M巧方法等；其預 處理多采用液液萃取等方法。運些預處理方法存在的主要問題是操作步驟多、耗時長、有機 溶劑使用量大、去除基質效應效果差W及不利于環(huán)保的缺陷。該現(xiàn)象亟待解決。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服了現(xiàn)有技術對原料乳和/或液態(tài)乳制品中殘 留的青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸的含量進行檢測前，其預處理方法操作步驟多、耗 時長W及有機溶劑使用量大的缺陷，提供了一種青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸的檢測 方法。本發(fā)明的預處理方法快速、簡單、經(jīng)濟、可靠，能夠有效地提取出待測組分，去除復雜 基質影響，有益于待測樣品的快速檢測。而且在保持較高提取率的同時，節(jié)約了有機溶劑 的使用、排放和損失，有利于環(huán)境保護，節(jié)約了預處理步驟、時間和能耗，具有較強的應用價 值。本發(fā)明的檢測方法可用于青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸，且檢測方法快速，簡單， 精密度高，準確性高。
[0006] 本發(fā)明通過W下技術方案解決上述技術問題。
[0007] 本發(fā)明提供了一種青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸的檢測方法，其包括W下步 驟：
[0008] (1)將待測樣品和乙臘的混合物，離屯、，收集上清液；所述的待測樣品為不含固體 顆粒的乳制品；
[0009] (2)將所述上清液上樣至已經(jīng)活化的OasisP化MEHLB固相萃取小柱，收集流出 液，即得預處理后的待測樣品；
[0010] (3)將所述預處理后的待測樣品去除溶劑，再用溶劑A溶解，過濾，得進料樣品；所 述溶劑A為甲醇水溶液、乙臘水溶液或水；
[0011] (4)將步驟（3)中所述進料樣品再進行高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)二級質譜 (LC-MS/M巧檢測青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸，即可。
[0012] 步驟（1)中，所述的待測樣品較佳地為原料乳和/或液態(tài)乳制品。
[0013] 其中，所述的液態(tài)乳制品為本領域常規(guī)的液態(tài)乳制品，較佳地為高巧牛奶、高鐵牛 奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一種或多種，更佳地為高巧牛奶和/或低乳糖牛奶。
[0014] 其中，所述的原料乳為本領域常規(guī)的原料乳，較佳地為牛乳和/或羊乳。除所述待 測組分外，所述牛乳的成分及含量一般如表1所示： |；001引表1
[0016]
[0017]
[001引其中，上述百分比為各組分相對于牛乳的質量百分比。
[0019] 步驟（1)中，所述的待測樣品可能含有青霉嚷挫酸和/或脫簇青霉嚷挫酸。該些 組分可能是由于養(yǎng)殖動物和生產(chǎn)飼料過程中，超量或超范圍使用抗生素、不嚴格執(zhí)行藥物 配伍禁忌或停藥期規(guī)定或使用違禁抗生素等現(xiàn)象造成的。
[0020] 步驟（1)中，所述的待測樣品中，青霉嚷挫酸的含量較佳地為20~1000μg/Kg， 更佳地為20~50μg/Kg。所述的待測樣品中，脫簇青霉嚷挫酸的含量較佳地為10~ 1000μg/Kg，更佳地為 20 ~50μg/Kg。
[OOW步驟（1)中，所述乙臘的添加量為本領域常規(guī)的添加量，較佳地為3~40mL/l~ 4g待測樣品，更佳地為3~lOmL/lg待測樣品。
[00巧步驟（1)中，較佳地，在所述離屯、的操作之前，先將所述混合物進行縱滿震蕩。所 述旋滿震蕩的方法和條件為本領域常規(guī)的方法和條件，所述的旋滿震蕩的時間較佳地為 1~lOmin，更佳地為5min。所述縱滿震蕩的溫度本領域常規(guī)，一般為室溫。所述旋滿震蕩 是為了利于提取，使乙臘進一步提取所述待測成分。
[0023]步驟（1)中，較佳地，所述混合物中還包含酸。所述酸為本領域常規(guī)的酸，較佳地 為甲酸和/或乙酸。所述酸的添加量為本領域常規(guī)，較佳地為0. 1~2%，更佳地為0. 8~ 1. 2%，最佳地為1 % ;上述百分比為所述酸占所述乙臘的體積百分比。添加所述酸后，所述 待測樣品中所述青霉嚷挫酸或所述脫簇青霉嚷挫酸的提取率至少能提高10%W上。
[0024]步驟（1)中，根據(jù)本領域常識可使用所述乙臘和酸進行多次離屯、操作，較佳地使 用所述乙臘和酸進行兩次離屯、操作。所述酸的種類和用量如前所述。根據(jù)本領域常識，將 多次離屯、后所得上清液進行合并。
[00巧]步驟（1)中，所述的離屯、的方法和條件為本領域常規(guī)的方法和條件。所述的離屯、 的轉速較佳地為5000~1500化pm。所述的離屯、的時間較佳地為5~30min。
[00%] 步驟（1)中，較佳地，將所述上清液先進行定容后再進行步驟（2)的操作。所述定 容的操作過程中，較佳地使用水或乙臘進行定容，更佳地使用乙臘進行定容。所述定容的終 點較佳地為10~25mL/g待測樣品，更佳地為lOmL/g待測樣品。所述定容的目的是為了使 后續(xù)進行測試時，用量基本相同。
[0027] 步驟似中，所述OasisP化MEHLB固相萃取小柱較佳地為沃特世科技（上海） 有限公司市售產(chǎn)品。
[0028] 步驟（2)中，所述活化的操作和條件為本領域常規(guī)的操作和條件。活化采用的溶 劑種類較佳地為乙臘水溶液。所述乙臘水溶液中，乙臘占水的體積百分比較佳地為20~ 90 %，更佳地為60 %。所述乙臘水溶液的用量為本領域常規(guī)，較佳地為3~10血，更佳地為 4mL。
[0029] 步驟（2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速為本領域常規(guī)的流速，較 佳地為0. 025~0. 30血/s，更佳地為0. 05血/s。
[0030] 步驟（3)中，所述去除溶劑的方法和條件為本領域常規(guī)，較佳地使用平行蒸發(fā)儀 在20~50°C下濃縮至干，更佳地使用平行蒸發(fā)儀在25°C下濃縮至干。
[00川步驟（3)中，所述乙臘水溶液中，乙臘占水的體積百分比較佳地為1~20%，更佳 地為6 %。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的體積百分比較佳地為1~20 %，更佳地為6 %。 陽0巧步驟（3)中，所述溶劑A較佳地為乙臘水溶液。所述溶劑A的用量較佳地為1~ 2mL/g所述待測樣品，更佳地為ImL/g所述待測樣品。
[0033] 步驟（3)中，所述的過濾的方法為采用有機微孔濾膜進行過濾，較佳地采用孔徑 為0. 22μm或0. 45μm的有機微孔濾膜進行過濾。根據(jù)本領域常識，所述的過濾為微濾。
[0034] 步驟（4)中，所述的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)二級質譜（LC-MS/M巧檢測的條件 和方法為本領域常規(guī)的條件和方法。
[0035] 步驟（4)所述的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)二級質譜檢測中，高效液相色譜法檢 測的色譜柱較佳地為十八硅烷鍵合硅膠色譜柱（WaterxselectCiscolumn)。所述的十八 硅烷鍵合硅膠色譜柱的規(guī)格較佳地為4. 6mmX250mm或4. 6mmX150mm。
[0036] 步驟（4)所述的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)二級質譜檢測中，高效液相色譜法較 佳地使用梯度洗脫的方法，流動相A為乙臘，流動相B為甲醇水溶液。所述流動相B中，甲 醇的體積分數(shù)較佳地為0. 05~1 %，更佳地為0. 1 %