專利名稱：膽甾-4-烯-3-酮衍生物用于獲得細胞保護藥物的用途的制作方法
膽甾-4-烯-3-酮衍生物用于獲得細胞保護藥物的用途
本發(fā)明涉及膽齒-4-烯-3-酮衍生物在獲得細胞保護藥物中的用 途，其中不包括神經保護藥物。
細胞變性過程的特征在于細胞的功能障礙，常常會導致不希望的 細胞活性和細胞死亡。
細胞已經發(fā)展出對應激應答的適應機制，該機制延長了它們的生 命或者延遲或防止了細胞死亡(細胞保護機制)。
但是，這些細胞保護機制有時是不足夠、不適當的或誘導的太遲 而并不有效，因此細胞死亡。因此，人們感興趣的是發(fā)展新的可以促 進細胞保護的細胞保護藥物。這是本發(fā)明的目的之一。
術語"細胞保護"是指天然或非天然藥劑保護細胞免于細胞死亡， 特別是病理性細胞死亡，和/或防止細胞功能障礙而導致細胞死亡的能 力。這些細胞功能障礙可以是例如，線粒體源的例如產生ATP的能力 降低，不能獲得和/或保留鈣，或產生自由基。
在細胞死亡的主要機制中，細胞壞死、細胞凋亡和壞死性細胞凋 亡(necroptosis )之間的區(qū)別是4艮大的。
細胞壞死是所謂的"意外的"細胞死亡，其在組織受到損害時發(fā) 生。最受影響的是細胞的質膜，導致細胞的內穩(wěn)態(tài)改變。細胞將會吸 收水至一定程度，導致質膜溶解。這種細胞溶解導致細胞質的內容物 釋放到周圍的介質中。細胞壞死是炎癥過程的起點。
細胞壞死會影響 一 系列的細胞或組織，而其他相鄰的部分會保持 存活。所導致的轉變是細胞或組織壞疽。
換句話說，細胞壞死只限于形態(tài)學的改變，其是在當細胞到達其 生命的終點時所發(fā)生的，是例如顯著的損傷例如器官的血液供應中斷 或減少，體溫過高(溫度顯著升高)，化學中毒，物理性休克等等事件 的結果。最為人所知的一種細胞壞死是由于冠狀動脈的阻塞(梗阻)而在梗 塞形成時(心肌血流供應中斷)心肌發(fā)生的壞死。
細胞凋亡是生物體的正常生理學的一個完整部分。它是受到高度 調節(jié)的細胞死亡的生理學形式，是多細胞生物體的生存所需要的。細 胞凋亡是一種在胚胎發(fā)生期間發(fā)揮基本作用的過程。
凋亡中的細胞或凋亡的細胞會將它們自己與其他細胞分離開。細
胞凋亡通常涉及組織中的個體細胞，不會導致炎癥。細胞凋亡的一個 特征性的形態(tài)學重點是細胞核和細胞質的顯著凝縮，誘導細胞體積顯 著減小。然后細胞核破碎，每個碎片被雙層膜所包圍。然后釋放出凋 亡小體(細胞質和細胞核成分)，并由鄰近的細胞通過吞噬作用而吸收。 可以以不同的方法誘導細胞凋亡。例如，輻射、化學品或激素的 存在是刺激物，可以在細胞中導致凋亡事件的級聯。細胞內的信號例
如不完全的有絲分裂或DNA損害也可以誘導細胞凋亡。
在遺傳毒物的作用后或在疾病期間也會發(fā)生細胞凋亡。某些病狀 的特征在于異常的細胞凋亡，導致某些細胞群的缺失，例如肝臟毒性、
視網膜病、心臟毒性。
因此生理性細胞凋亡和病理性細胞凋亡之間是有差別的。本發(fā)明 主要關注的是病理性細胞凋亡。
還存在其他的細胞死亡機制，例如壞死性細胞凋亡，其具有細胞 壞死和細胞凋亡的特征。由于壞死性細胞凋亡而死亡的細胞具有與由 于細胞壞死而死亡的細胞類似的特征，但是該機制的生化步驟更類似 于細胞凋亡的步驟。這種細胞死亡的機制是例如在局部缺血中發(fā)生的。
因此，本發(fā)明的一個目的也是制備新的能夠用于預防和/或治療細 胞壞死和/或病理性細胞凋亡和/或壞死性細胞凋亡的藥物(抗壞死和/ 或抗細胞凋亡和/或抗壞死性細胞凋亡藥物)。
細胞變性過程可以特別地是由統(tǒng)稱為變性疾病或感染、創(chuàng)傷或暴 露在各種因素下的病理性情況而導致的。
這些創(chuàng)傷和因素可以是例如暴露在輻射(UV、 y輻射)下、缺氧或 少氧、缺乏營養(yǎng)素、缺乏生長因子、毒藥、細胞毒素、廢物、環(huán)境毒素、自由基、活性氧或者甚至某些醫(yī)藥事件和/或方法例如手術創(chuàng)傷包 括細胞、組織和器官的移植?；瘜W或生物學試劑也可以在醫(yī)學治療范 圍內用作治療劑，例如細胞抑制劑或抗炎劑。
本發(fā)明的目的不是治療病理性或變性過程的細胞外原因，所述原 因會導致細胞死亡，但實際上是在所述病理性過程或所述病狀的細胞 水平上的結果，特別是保護細胞免于產生所述的結果。
在特征在于變性過程的最顯著的病理性情況中，本發(fā)明不涉及神
經性或神經變性疾病，發(fā)現是下列疾病
骨、關節(jié)、結締組織和軟骨的疾病，例如骨質疏松癥，骨髓炎， 關節(jié)炎包括例如骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬關節(jié)炎，無血管 性壞死，進行性骨化性纖維發(fā)育不良、佝僂病、庫興綜合征；
肌肉的疾病例如肌營養(yǎng)不良，例如Duchenne， s肌營養(yǎng)不良、強 直性肌營養(yǎng)不良、肌病和肌無力；
皮膚疾病，例如皮炎、濕滲、牛皮癬、老化或者甚至瘢痕改變；
心血管疾病，例如心臟和/或血管缺血、心肌梗塞、缺血性心臟病、 慢性或急性充血性心力衰竭、心律失常、心房顫動、心室顫動、 paroxystic心動過速、充血性心力衰竭、肥厚型心臟病、缺氧、少氧、 由于用抗癌劑治療而導致的繼發(fā)效應；
循環(huán)疾病，例如動脈粥樣硬化、動脈硬化和外周血管病、腦血管 卒中、動脈瘤；
血液和血管疾病，例如貧血、血管淀粉樣變、出血、鐮狀細胞 病、紅細胞分裂綜合征、嗜中性白細胞減少癥、白血球減少癥、髓發(fā) 育不全、各類血細胞減少癥、血小板減少癥、血友??；
肺部疾病包括肺炎、津喘；肺的阻塞性慢性疾病例如慢性支氣管 炎和肺氣肺；
胃腸道的疾病，例如潰瘍；
肝的疾病例如肝炎，特別是病毒性或有其他感染因子作為致病因 子的肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、暴發(fā)性肝炎、某些遺傳性 代謝性障礙、Wilson， s病、肝硬化、酒精性肝病(ALD)、由于毒素和藥物而發(fā)生的肝病；皮脂腺病例如
-非酒精性脂肪性肝炎(MSH)，或酒精、藥物、病毒或中毒性肝
炎伴隨的外源性中毒，外科操作的并發(fā)癥、代謝性疾病(例如糖尿病、 葡萄糖不耐受綜合征、肥胖、高脂血癥、下丘腦-垂體軸的功能障礙、 血P脂蛋白缺乏癥、半乳糖血癥、糖原病、Wilson， s病、 Weber-Christian， s病、Refsum， s綜合征、肉毒堿缺乏癥)，
-消化道的炎癥疾病的肝并發(fā)癥，
-自身免疫性肝炎。
通過不管何種原因的對皮脂腺病的作用或對肝細胞凋亡的作用，
發(fā)生。0 、、 ，， 、 ，。、、
-胰臟疾病，例如急性或慢性胰腺炎； -代謝性疾病，例如糖尿病和insipid糖尿病、甲狀腺炎； -腎的疾病，例如急性腎障礙或腎小球腎炎； -由化學品、毒素或藥物導致的重度中毒； -與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關的變性疾病； -與老化有關的障礙，例如加速老化的綜合征； -牙齒疾病，例如由組織變性導致的那些，例如牙周炎； -眼科疾病或障礙，包括包括糖尿病性視網膜病、青光眼、上瞼 下垂、視神經萎縮、慢性進行性外眼肌麻痹、黃斑變性、視網膜變性、 色素性視網膜炎、視網膜裂孔或撕裂、視網膜剝離、視網膜缺血、與 創(chuàng)傷有關的急性視網膜病、炎性變性、手術后并發(fā)癥、醫(yī)學視網膜病、 白內障；
-聽覺道的疾病，例如耳硬化和抗生素誘發(fā)的耳聾； -與線粒體(線粒體病狀)有關的疾病，例如脊髓小腦共濟失調、 線粒體結構異常的先天性肌營養(yǎng)不良癥、某些肌病(MELAS綜合征、 MERFF綜合征、Pearson， s綜合征)、MIDD (線粒體性糖尿病和耳聾) 綜合征、Wolfram， s綜合征、張力失常。
本發(fā)明也關注保護細胞、組織和/或移植的器官，不管是在移植之前、期間(去除、運輸和/或再移植)或之后。
藥理活性的化合物仍然尋求控制上述的變性過程。
本發(fā)明滿足了對細胞保護性化合物的需求。實際上，申請人發(fā)現
了膽甾-4-烯-3-酮衍生物，特別是膽齒-4-烯-3-酮肟具有顯著的細胞 保護性質。
這就是為什么本發(fā)明的目的是至少一種滿足式I的化合物
A代表氫原子或與B —起代表碳-碳鍵， B代表氫原子、羥基或與A—起代表碳-碳鍵, C代表氫原子或與D —起代表碳-碳鍵， D代表氫原子或與C 一起代表碳-碳鍵， E代表氫原子或與F —起代表碳-碳鍵， F代表氫原子或與E —起代表碳-碳鍵，
其中X代表-N-OH基團， 和R代表選自下列的基團或其與藥學可接受的酸的加成鹽中的一種，或其酯中的一種或與 所述酯的藥學可接受酸的加成鹽中的一種，
在制備除神經保護藥物以外的細胞保護藥物中的用途。
如上定義的式I的化合物是已知的(WO2004/082581)。
與藥學可接受的酸的加成鹽可以是例如與鹽酸、氫溴酸、硝酸、 硫酸、磷酸、乙酸、甲酸、丙酸、苯甲酸、馬來酸、延胡索酸、琥珀 酸、酒石酸、檸檬酸、草酸、乙醛酸、門冬氨酸、烷-磺酸例如甲或乙 磺酸、芳基磺酸例如苯或對曱苯磺酸或羧酸。
根據本發(fā)明，肟基代表純或混合的順式和反式異構體，與相對于 C-N雙鍵的N-0鍵的方向有關。
在上述的化合物中，特別優(yōu)選的上述化合物是，其中
-A與B—起代表碳-碳鍵，C、 D代表氫原子，E、 F代表氫原子 或一起代表碳-碳鍵，且R具有Rl的含義，
-A與B—起代表碳-碳鍵，C、 D代表氫原子，E、 F代表氫原子， 且R具有R2或R3或R4的含義，
-A與B —起代表雙鍵，C與D —起代表碳-碳鍵，E、 F代表氫原 子，且R具有Rl或R6的含義，
-A與B —起代表雙鍵，C與D —起代表碳-碳鍵，E與F —起代 表碳-碳鍵，且R具有R1的含義，
-E與F —起代表雙鍵，C、 D、 A、 B代表氫原子，且R具有Rl 的含義，
以及它們與藥學上可接受的酸的加成鹽。
有利地，根據本發(fā)明，使用至少一種式I的化合物，選自
-膽甾烷-3-酮將，
-膽齒-4-烯-3-酮肟，
-膽甾-1， 4-二烯-3-酮將，
或其與藥學可接受的酸的加成鹽中的一種，或其酯中的一種或與
所述酯的藥學可接受酸的加成鹽中的一種。
優(yōu)選地，使用膽甾-4-烯-3-酮肟或膽甾-l， 4-二烯-3-酮肟，或其與藥學可接受的酸的加成鹽中的一種，或其酯中的一種或與所述酯的 藥學可接受酸的加成鹽中的一種。
式I的化合物的令人感興趣的細胞保護性質為下列用途提供了理
由制備細胞保護藥物，特別是打算用于治療或預防壞死、和/或病理 性細胞凋亡和/或壞死性細胞凋亡(抗壞死和/或抗細胞凋亡和/或抗壞 死性細胞凋亡藥物)或其他疾病例如
骨、關節(jié)、結締組織和軟骨的疾病，
肌肉疾病，
皮膚疾病， 心血管疾病，
循環(huán)疾病， 血液和血管疾病，
肺的疾病，
胃腸道的疾病，
肝的疾病，
胰臟的疾病，
代謝性疾病，
腎的疾病，
重度中毒，
與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關的變性疾病，
與老化有關的障礙，
牙齒疾病，
眼科疾病或障礙，
聽覺道的疾病，
與線粒體(線粒體病狀)有關的疾病。
本發(fā)明同時感興趣的是保護細胞、組織和/或移植的器官，不管是 在移植之前、期間(去除、運輸和/或再移植)或之后。
有利地，式I的化合物可以用于制備用于保護心臟細胞的藥物(心 臟保護藥物)，保護肝臟細胞的藥物(肝保護藥物)或用于治療或預防與
ii線粒體有關的疾病。
根據本發(fā)明，式I的化合物有利地以生理有效劑量存在于細胞保
護藥物中；所述藥物特別地包含有效細胞保護劑量的至少一種式I的 化合物。
作為藥物，滿足式I的化合物，它們的酯，它們的與藥學可接受 的酸的加成鹽以及與所述酯的藥學可接受的酸的加成鹽可以配制成用 于消化或胃腸外途徑。
根據本發(fā)明的藥物可以進一 步包含至少 一種其他治療活性成分， 其對于相同病理或不同病理具有活性，用于同時、分別使用或順序使 用，特別是當治療受前述病狀中的一種影響的患者的時候。
根據本發(fā)明，式I的化合物可以在藥物中使用，與一種或多種惰 性，即，藥理無活性和無毒性的賦形劑或載體混合。所提及的例子是 由與藥學用途相容并且本領域技術人員已知的鹽水、生理溶液、等張
溶液、緩沖溶液等等制成。該組合物可以包含一種或多種選自分散劑、 增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等等的試劑或載體?？梢栽谥苿?液體和/或 注射劑，和/或固體制劑)中使用的試劑或載體特別是甲基纖維素、羥 甲基纖維素、羧甲基纖維素、環(huán)糊精、聚山梨酯80、甘露醇、明膠、 乳糖、植物或動物油、阿拉伯膠等。優(yōu)選地，使用植物油。該組合物 可以配制成可注射的混懸液、凝膠劑、油、片劑、栓劑、粉末劑、明 膠膠嚢、膠囊等等，可以通過蓋倫制劑或裝置產生延長和/或延遲釋放。 對于這種類型的制劑，有利地使用試劑例如纖維素、碳酸酯或淀粉。
可以通過本領域技術人員已知的任意方法來進行施用，優(yōu)選口服 或注射，典型地，通過腹膜內、大腦內、鞘內、靜脈內、動脈內或肌 內途徑。優(yōu)選口服。如果是長期治療，優(yōu)選的施用途經是舌下、口服 或經皮。
對于注射，該化合物一般包裝成液體混懸液，其可以通過例如注 射器或灌注裝置來注射。應當理解的是，流速和/或注射劑量或一般的 給藥劑量可以是本領域技術人員根據患者、病狀、施用方法等等來調 節(jié)。應當理解的是，可以與其他活性成分或任何藥學可接受的栽體(在穩(wěn)定劑存在下緩沖劑、鹽水、等張溶液等等)組合進行重復施用。 本發(fā)明可以在哺乳動物，特別是人中使用。
一般地，該化合物的每日劑量是獲得期望的治療效果的最小劑量。
上述化合物，例如膽甾-4-烯-3-酮厲的劑量一般是，對于人每日0. 001 到100 mg/kg。
如果需要，可以將每日劑量以每日2， 3， 4， 5， 6或更多次或在 全天以適當間隔以多次亞劑量施用。
所選擇的量將取決于多種因素，特別是施用途徑、施用持續(xù)時間、 施用的時點、化合物的清除率、與化合物聯合施用的不同產品、患者 的年齡、體重和身體情況，以及他/她的醫(yī)療史和醫(yī)學已知的任何其他 信息。
主治醫(yī)師的處方可以以小于 一 般使用量的劑量開始，然后逐漸增 加劑量以更好地控制可能的繼發(fā)效應的發(fā)生。
實施例1:膽甾-4-烯-3-酮肟的抗細胞凋亡效杲
在心肌細胞上，通過多柔比星誘導的收縮機能障礙分析膽甾-4-烯-3-酮將的抗細胞凋亡性質。
使用濃度為10mM的膽甾-4-烯-3-酮肟的100仰MSO母液。不依賴 于所使用的分子濃度，在所有實驗點，在DMS0中的最終濃度都是相同 的。測定在Tyrode的溶液(組合物的組成mmol/L: NaCl 135，KC1 5. 4， NaH2P04 0.33， CaCl2 1.2， MgCl2 1.0， Hepes 10;用NaOH將pH調節(jié) 為7.4)中稀釋成濃度為0. 3， l和3 jiM的脬甾-4-烯-3-酮肟。
方法
兔心室心肌細胞的收縮和凋亡
A. 1獲得兔心室心肌細胞的分離細胞
如A. d， Anglemont de Tassigny等人，Fund. Clin. Pharmacol.， 18: pp. 531-38， 2004所述，從新西蘭雄兔的心臟獲得分離的心室細 胞。簡言之，用戊巴比妥(50 mg/kg)溶液麻醉兔子(2. 0-2. 5 kg),然 后接受肝素(200 IU/kg)。切除心臟，并立即通過Langendorff裝置用 氧化(無鈣)的tyrode等張溶液(95。/。， 2-5% C02)(單位mM: NaCl 135，KC1 5.4， Na2P04 0. 33， MgCl2 1.0， Hepes 10，在37T下用NaOH將 pH調節(jié)為7. 4， 280-300 mOsmol/kg H20)灌注10-15分鐘，而無再循 環(huán)。接著，在"再循環(huán)"模式下，在加入1 mg/mL的II型膠原酶和 0.28 mg/mL的XIV型蛋白酶的相同的無釣Tyrode溶液(冠狀流速， 10-15 mL/分鐘)灌注所有心臟3分鐘。最后，在無再循環(huán)的模式下， 用補充有0. 3 mM CaCl2的相同Tyrode溶液灌注所有心臟10分鐘。去 除左心室，切成小片；通過溫和的機械攪拌實現細胞分離。通過每15 分鐘增量來加入細胞外的鉀，以使生理學濃度達到1. 0mM。將所分離 的肌細胞保持在沒有血清的介質中，該介質包含(mM) NaCl 110, KC1 5.4, Na2P04 0.33， NaHC03 25 ，葡萄糖5, MgCl2 0.8， CaCl2 1， pH 調節(jié)為7.4，在實驗前維持1.5小時。所有細胞都是桿狀的，具有淡 白色的交叉紋，并且在光學顯微鏡下它們的表面上沒有任何載體。 A. 2用膜聯蛋白V標記
通過使用MiniMacs細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec， Bergisch: Gladbach， Germany)將用膜聯蛋白V標記的磷脂酰絲氨酸用作測定細 胞凋亡的定量方法。簡言之，用膜聯蛋白V微珠通過磁力標記暴露著 磷脂酰絲氨酸的細胞，然后使其通過位于磁場中的柱。將標記的細胞 (其具有磁力標記的磷脂酰絲氨酸)保存在柱中，而未標記的細胞(壞 死的細胞和未凋亡的細胞)不保存。從磁場中移出該柱；洗脫磁力保持 的暴露著磷脂酰絲氨酸的細胞作為陽性部分，并用Mallassez細胞計 數器進行計數。然后計算相對于細胞初始數目的凋亡細胞的百分比。
A. 3半胱天冬酶-3活性的測定
使用半胱天冬酶-3活性用作測定細胞凋亡的定量方法。簡言之， 細胞溶解，通過4吏用AK-005試劑盒(Biomol Research Labortories， Plymouth Meeting, PA, USA)將上清液用于半胱天冬酶-3活性的測定。 用熒光染料，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)標記用于測定半胱天冬珠3 活性的熒光產生底物(DEVD)，其中AMC在360/460 nm處在UV光下產 生210分鐘的可檢測的黃-綠熒光。通過半胱天冬酶-3的分離，AMC 從底物中釋放出來，酶的表達表示為fmol/分鐘。A. 4收縮性的測定
在371c下將肌細胞轉移一個室中，連續(xù)灌注并放置在倒置顯微鏡 臺上。用生理緩沖液灌注該室，該緩沖液包含(mM): NaCl 140; KC1 5. 4; CaCl2 1; MgCl20. 8; HepeslO和葡萄糖5.6(pH-7. 4; 290 mOsmol / kgH20)。
用放置在該室中并與模擬器連接的鉑場電極每秒1次(l Hz)誘導 肌細胞收縮。用x 20物鏡連續(xù)捕捉圖像，并以240個樣品/s的速度 傳送到CCD照相機中。將CCD照相機的圖像投射到視頻屏幕上。
根據下列標準選擇用于研究的肌細胞桿狀外形，具有非常明顯 的紋，沒有細胞內空泡，當用1 mM Ca2+刺激時沒有自發(fā)性收縮，具有 恒定的靜息長度和收縮幅度。通過視頻圖像分析程序測定sarcomers 的長度，以240個樣品/s的速度捕捉數據。將照相機圖像轉變成 sarcomer長度的測量值。根據sarcomers長度的這些數據計算收縮的 百分比。
A. 5數據分析
所有數據都表示為平均值±標準誤差。通過AN0VA,然后Student 檢驗來進行不同組之間的數據比較，將顯著性差異設定為p < 0.05。 畫實驗方法
通過將心肌細胞暴露在加入到等張溶液的1 nM多柔比星中3到 8小時來誘導其凋亡，其中該等張溶液包含(mM): NaCl 110， KC15. 4， Na2P04 0.33， Na跳25，葡萄糖5， MgCl2 0.8， CaCl2 1， pH調節(jié)為 7.4。在開始暴露于多柔比星3小時后開始進行膜聯蛋白V標記，因為 此現象在細胞凋亡級聯中出現的非常早。在開始暴露于多柔比星8小 時后開始進行半胱天冬酶-3活性的測定，因為該現象在凋亡現象中發(fā) 生的較晚。在暴露于多柔比星的8小時期間，每小時測量心肌細胞的 收縮性。在所有的處理后，將該細胞與未暴露于多柔比星的對照心肌 細胞進行比較。
在暴露于多柔比星前，用膽甾-4-烯-3-酮肟預處理該心肌細胞15 分鐘。在該研究期間測定三種濃度的化合物0.3|iM， 1iuM和3hM。，結果
在各組中，該研究所使用的細胞的sarcomers的平均長度并沒有 顯著地差異。
多柔比星對于心肌細胞的收縮性和凋亡的作用
暴露于多柔比星導致sarcomers的縮小量隨著時間而減小。在前 3個小時，多柔比星峰的縮小與對照組類似，在暴露4小時后，其顯 著減小(分別相對于多柔比星和對照組的基線為-53. 20 ± 7. 70°/。對 —19.49 ± 2.06%， p < 0.05， n=5)。
用ljjM的多柔比星處理誘導了細胞凋亡，同時膜聯蛋白V標記和 半胱天冬酶-3活性顯著增強。
在多柔比星誘導的收縮水平上，膽甾-4-烯-3-酮肟對機能障礙 和細胞凋亡的作用
用ljaM的多柔比星處理導致心室心肌細胞的峰的縮小量顯著減 小，而在膽甾-4-烯-3-酮肟存在下(0. 3|uM， 1 jLiM和3 jiM)消除了這種 現象。確實，在暴露4小時后，相對于基線在多柔比星下峰的縮小 (-53.20 ± 7. 70%)在0.3pM(-25. 35 ± 0.18%)， ljaM(-15. 66 土 5. 72%)和3juM(-13. 95 ± 3. 17%)的該化合物存在下顯著減小.
此外，由于O. 3pM， ljaM和3pM的膽甾-4-烯-3-酮肟阻斷了多 柔比星，因此膜聯蛋白V標記和半胱天冬酶-3活性增強。
用暴露于多柔比星3小時后膜聯蛋白v標記的改變y。來評價細胞凋
亡，得到下列結果對照組100%;多柔比星291% ± 32;多柔比 星+0. 3 nM膽齒-4-烯-3-酮肟130% 士 12.43;多柔比星+lpM膽甾 -4-烯-3-酮肝121% ± 4.74;多柔比星+3 jli M膽甾-4-烯-3-酮肟 115.5% ± 16.35。測定半胱天冬酶-3活性的結果如下對照組18 ± 9 fmol/分鐘；多柔比星120 ± l5 fmol/分鐘；多柔比星+0. 3 pM膽甾-4-烯-3-酮肟33 ± 9 fmol/分鐘；多柔比星+1 ju M膽甾-4-烯-3-酮將18 ± 8fmol/分鐘；多柔比星+3 mM膽甾-4-烯-3-酮肟 11 ± 4 fmol/分鐘. "注釋和結論
16對于分離的兔心肌細胞，膽甾-4-烯-3-酮肝化合物對于多柔比星 誘導的收縮機能障礙和對細胞凋亡顯示了心臟保護效果。當以適當劑 量使用時，該分子可以確實地保護心臟免于多柔比星誘導的心臟毒性 的損害，人們已知這種毒性是用該蒽環(huán)類抗生素治療癌癥的限制性因 素。因此，膽甾-4-烯-3-酮肟化合物可以用于在這些患者中限制多柔 比星的心臟毒性。
實施例2:膽甾-4-烯-3-酮將在急性肝毒性的體內模型中的效果
像許多其他細胞一樣，肝細胞在它們的細胞質膜上具有Fas/CD95 受體。通過激活半胱天冬酶級聯，刺激Fas途徑會誘導細胞死亡。
單次注射Jo2抗-Fas抗體可以誘導急性肝損害模型(Ogasawara 等人，Nature, 1993年8月)，產生了嚴重的肝損害，類似于病毒性、 自身免疫性或藥物誘導性肝炎。
丙氨酸氨基轉換酶(ALAT)也稱作血清谷丙轉氨酶(SGPT)，是一種 存在于肝細胞中的酶。在肝臟溶解后其活性在血漿中顯著增強，因此
是評價肝損害的良好標志。
所進行的實驗包括，用Jo2麻醉動物，然后進行ALAT s的測定， 并測定膽甾-4-烯-3-酮肟保護肝細胞的能力。
物質和方法
動物
使用來自培養(yǎng)者"Elevage Janvier" (Le Genest-Saint-lse， France)的雄性成年CD1小鼠。分別鑒定這些動物，并自由攝取水和食 物。
將裝置維持在可控的明亮循環(huán)(7: 00 am-7: 00 pm)中，溫度為 20 ± 2'C，濕度為50 ± 2%。 Jo2抗體的制備
單克隆侖鼠抗-小鼠CD95受體(Fas)抗體稱作Jo2，其來自于 Pharmingen(BD Biosciences, ref. 554254批次66081)，其母液是濃 度為1 mg/mL的水溶液。在0. 9%氯化鈉的水溶液中制備所使用的稀釋 液。受試化合物的制備
稱取需要量的膽甾-4-烯-3-酮肟，并研磨成精細粉末，然后懸浮 在玉米油中(60 mg/mL)。 口服(通過強制喂食)濃度為5 ml/kg的化合 物。
方法
在施用Jo2抗體前，以300 mg/kg 口服來進行膽甾-4-烯-3-酮肺 的預治療。以5mL/kg體重的體積，以125 Mg/kg的劑量，通過腹膜 內注射來施用Jo2抗體。
在施用抗體前，讓動物接受用于制備受試化合物相同體積而沒有 該化合物的玉米油口服預治療4小時，用該動物獲得對照。
觀'J定ALATs
在施用Jo2后24小時，從麻醉的小鼠中取血樣。根據IFCC(國際 化學家聯合會)的標準化方法，通過使用具有分光光度計(Hitachi Modular)的試劑盒(Roche Diagnostics)進行ALATs的測定。
結果和結論
在注射后24小時內，在對照組的19只小鼠中，以125 pig/kg
腹膜內施用Jo2導致3只小鼠死亡。
300 mg/kg的受試化合物顯著降低了 ALAT活性。 表l:在施用Jo2 24小時后測定的ALAT活性
治療ALAT活性(U/L) 平均值+/-SEM (n)
對照2, 586 ± 474 (16)
膽甾-4-烯-3-酮肟(300 mg/kg)1，136 ± 175 (20)**
**: p = 0.0037，相對于對照組進行t-檢驗
在施用Jo2抗體4小時前施用300 mg/kg的膽甾-4-烯-3-酮肝， 可以
-預防接受Jo2抗體的小鼠在注射后24小時內死亡； -限制不致命劑量的抗體誘導的細胞死亡；用膽甾-4-烯-3-酮肟治 療的小鼠中，血漿中ALAT活性作為肝細胞溶解的生物標記顯著低于未治療的對照小鼠。 結論
在通過抗-Fas (Jo2)抗體誘導的小鼠急性肝毒性模型中，可以證明 膽甾-4-烯-3-酮肝的肝保護性質。
由于這些顯著的效果，可以關注式I的化合物在制備一般的細胞 保護藥物中的用途。
毒理學研究
通過每日施用的治療方法，以高達300 mg/kg/天的劑量范圍，經 口服、皮下、腹膜內和靜脈內途徑在小鼠中施用，特別是膽齒-4-烯-3-酮將，可以延長至最長28天，都沒有顯示任何明顯的毒性。
在猴子中，在10天時間中，口服逐漸增加的每日劑量，最高達 1， 500 mg/kg，沒有顯示任何毒性。
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權利要求
1. 至少一種滿足式I的化合物其中X代表＝N-OH基，和R代表選自下列的基團A代表氫原子或與B一起代表碳-碳鍵，B代表氫原子、羥基或與A一起代表碳-碳鍵，C代表氫原子或與D一起代表碳-碳鍵，D代表氫原子或與C一起代表碳-碳鍵，E代表氫原子或與F一起代表碳-碳鍵，F代表氫原子或與E一起代表碳-碳鍵，或其與藥學可接受的酸的加成鹽中的一種，或其酯中的一種或與所述酯的藥學可接受酸的加成鹽中的一種，在獲得除神經保護藥物以外的細胞保護藥物中的用途。
2. 根據權利要求l的用途，其特征在于在式I中，A與B—起代 表碳-碳鍵，C、 D代表氫原子，E、 F代表氫原子或一起代表碳-碳鍵， 且R具有Rl的含義。
3. 根據權利要求1的用途，其特征在于在式I中，A與B —起代 表碳-碳鍵，C、 D代表氫原子，E、 F代表氫原子，且R具有R2或R3 或R4的含義。
4. 根據權利要求l的用途，其特征在于在式I中，A與B—起代 表雙鍵，C與D—起代表碳-碳鍵，E、 F代表氫原子，且R具有R1或 R6的含義。
5. 根據權利要求l的用途，其特征在于在式I中，A與B—起代 表雙鍵，C與D —起代表碳-碳鍵，E與F —起代表碳-碳鍵，且R具有 Rl的含義。
6. 根據權利要求1的用途，其特征在于在式I中，E與F—起代 表雙鍵，C、 D、 A、 B代表氫原子，且R具有R1的含義。
7. 根椐權利要求l的用途，其特征在于該式的化合物選自 -膽甾烷-3-酮肟，-膽甾-4-烯-3-酮肝，-膽甾-l, 4-二烯-3-酮肟，或其與藥學可接受的酸的加成鹽中的一種，或其酯中的一種或與 所述酯的藥學可接受酸的加成鹽中的一種。
8. 根據權利要求1的用途，其特征在于所述式I的化合物選自膽 甾-4-烯-3-酮肝或膽甾-l， 4-二烯-3-酮肟，或其與藥學可接受的酸的 加成鹽中的一種，或其酯中的一種或與所述酯的藥學可接受酸的加成 鹽中的一種。
9. 根據前述任一權利要求的用途，其特征在于該藥物是用于治療 或預防壞死和/或病理性細胞凋亡和/或壞死性細胞凋亡(抗壞死和/或 抗細胞凋亡和/或抗壞死性細胞凋亡藥物)或其他疾病例如骨、關節(jié)、結締組織和/或軟骨的疾?。?肌肉疾??；皮跌疾病;心血管疾病；循環(huán)疾??；血液和血管疾病；肺的疾病；胃腸道的疾病；肝的疾病；胰臟的疾?。?戈謝性疾??；腎的疾病；重度中毒；與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關的變性疾?。慌c老化有關的障礙；牙齒疾病；眼科疾病或障礙；聽覺道的疾?。慌c線粒體(線粒體病狀)有關的疾病。
10. 根據前述任一權利要求的用途，其特征在于該藥物是用于保 護心臟細胞(心臟保護藥物)。
11. 根據權利要求1到9任一的用途，其特征在于該藥物是用于 保護肝臟細胞(肝保護藥物)。
12. 根據權利要求1到9任一的用途，其特征在于該藥物是用于 治療或預防與線粒體有關的疾病。
13. 根據權利要求1到9任一的用途，其特征在于該藥物是用于 在移植之前、期間或之后保護細胞、組織或器官。
全文摘要
本發(fā)明涉及膽甾-4-烯-3-酮衍生物在獲得細胞保護藥物中的用途，其中不包括神經保護藥物。
文檔編號A61P39/00GK101443019SQ200780017357
公開日2009年5月27日 申請日期2007年3月28日 優(yōu)先權日2006年3月31日
發(fā)明者B·布伊森, R·普拉斯, T·伯德特 申請人:特羅福斯公司