專利名稱：用于光動(dòng)力學(xué)治療的水溶性卟啉衍生物、其用途和制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性化合物化學(xué)，即涉及一種新的制備水溶性卟啉衍生物，特別是類型1和2的二氫卟酚、菌綠素、脫鎂葉綠酸和細(xì)菌脫鎂葉綠酸的衍生物的制備方法。本發(fā)明的化合物可以在癌癥、感染及其它疾病的光動(dòng)力學(xué)治療中，以及在其它情況下的光輻射療法中用作光敏劑。
其中B是具有下面結(jié)構(gòu)的環(huán)
或 或 或 或 其中R1＝-CH＝CH2、-CH(OAlk)CH3、-CHO、-C(O)CH3、-CH2CH3、-CH(Alk)CH(COAlk)2、-CH2CH(COAlk)2、-CH(Alk)CH2COAlk、-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3、-CHO、-CH(OH)Alk、-CH＝CHAlk、CH2OH和CH2OAlk；R3＝-OH、-OAlk、-NH-Alk、NH-X-COO-(HG)+、-NH-Y-NR8R9和-NH-Y-OH；R4＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和NH-X-COO-(HG)+；R5＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；R6＝H和-COOAlk；R7＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；R8＝H和AlkR9＝H和Alk其中-NH-X-COO-＝有機(jī)氨基酸的殘基；X＝亞烷基、肽、寡肽和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；Y＝亞烷基和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；G＝親水性有機(jī)胺(例如，N-甲基-D-葡糖胺以及其它含氨基的碳水化合物衍生物、TRIS、氨基酸、寡肽)；和Alk＝烷基取代基。
背景技術(shù)：
在各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)是一種最有前途的新技術(shù)(Photodynamic therapy，basic principles and clinical applications，編輯B.W.Henderson，Th.J.Dougherty，Marcel Dekker，1992，New York}，并且光動(dòng)力學(xué)治療特別是公認(rèn)的治療腫瘤的方法(Photodynamic tumortherapy.2ndand 3rdgeneration photosensitizers，J.G.Moser編輯，HarwoodAcademic Publishers，1998，Amsterdam)。在PDT中，卟啉是廣泛使用的化合物。但是在卟啉的藥物應(yīng)用中，一個(gè)主要的問題是它們?cè)谏砣芤褐械娜芙舛群艿?。這使得它幾乎不可能制備用于PDT及其它應(yīng)用的有效的藥物級(jí)的可注射溶液。
制備用于PDT的水溶性卟啉衍生物的方法是本領(lǐng)域已知的。Smith等的USP 5,330,741公開了一種制備賴氨酰-二氫卟酚P6三鈉的方法，該方法包括在吡啶存在下，由脫鎂葉綠酸甲酯a轉(zhuǎn)變得到的紅紫素18甲酯和含水賴氨酸在二氯甲烷中反應(yīng)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢璺磻?yīng)12小時(shí)，接著高真空下除去溶劑。這樣制得的粗產(chǎn)物用反相高壓液相色譜法進(jìn)行提純，隨后冷凍干燥。為了制備用于癌癥PDT的可注射溶液，首先將其溶于磷酸鹽緩沖液中，然后加入0.1N的氫氧化鈉，用0.1N的HCl將溶液的pH值調(diào)節(jié)到7.35，接著通過微孔過濾器進(jìn)行滅菌過濾。
上述方法的缺點(diǎn)包括缺少重現(xiàn)性、后處理困難以及使用有毒試劑，這使得其幾乎不適合于制備藥物。另外，在4℃下并且在黑暗中，制得的水溶性目標(biāo)產(chǎn)物在水溶液中僅穩(wěn)定存在24小時(shí)；在4℃以及在黑暗中，固態(tài)形式的水溶性目標(biāo)產(chǎn)物僅穩(wěn)定存在4個(gè)月[M.W.Leach，R.J.Higgins，J.E.Boggan，S.-J.Lee，S.Autry，K.M.Smith，Effectivenessof a Lysylchlorin P6/Chlorin P6mixture in Photodynamic Therapy of theSubcutaneous 9L Glioma in the Rat，Cancer Res.，1992，52，1235-1239；USP 5,330,741}。
Nakazato在USP 5,378,835中描述了水溶性脫鎂葉酸a(3)鈉鹽的制備方法。根據(jù)該發(fā)明，將脫鎂葉綠酸a(4)溶于乙醚中，然后向其中非常緩慢地滴加堿在正丙醇、異丙醇或者它們的混合物中的非常稀的溶液。保持反應(yīng)，直至完全析出脫鎂葉綠酸a鹽沉淀，離心分離并在真空中干燥。然后將產(chǎn)物溶于水中，得到濃度為0.5％、pH為9.2-9.5的溶液，然后用pH為7.4-7.8的磷酸鹽緩沖劑稀釋該溶液。
Nakazato描述的方法的缺點(diǎn)是通過該技術(shù)不能得到濃的(＞1％)可注射的脫鎂葉綠酸a的水溶液。另外，該發(fā)明的作者證明了這樣的鹽在干燥儲(chǔ)存時(shí)的化學(xué)不穩(wěn)定性，并且它們?cè)诟稍餇顟B(tài)下儲(chǔ)存后，不能在水中完全溶解。
(3)R＝Na(4)R＝H(5)R＝Me(6)R＝Et 與本發(fā)明方法最相似的方法公開在G.V.Ponomarev等的俄羅斯專利RU2144538中，通過多級(jí)簡(jiǎn)單序列化學(xué)反應(yīng)，用空間大的有機(jī)胺包括N-甲基-D-葡糖胺制備二氫卟酚e6(7)的水溶性絡(luò)合物，該方法包括從盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌(Spirulina Platensis)的藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)葉綠素A，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為二氫卟酚e6[S.Ltjnen，P.H.Hynninen，An improved method for the preparation of(10R)-and(10S)-pheophytins a and b，Synthesis，1983，705-708；P.H.Hynninen，S.Ltjnen，Preparation of phorbin derivatives from chlorophyll mixtureutilizing the principle of selective hydrolysis，Synthesis，1980，539-541；S.Ltjnen，P.H.Hynninen，A convenient method for the preparation of wetchlorin e6and rhodin g7trimethyl esters，Synthesis，1980，541-543]，通過逐步加入水至它的丙酮溶液中，析出二氫卟酚e6沉淀，接著離心分離沉淀，用3倍的水洗滌沉淀，然后用2g-eq.空間大的有機(jī)胺水溶液處理濕的二氫卟酚e6，得到總收率超過50％的產(chǎn)物。
該方法的主要缺點(diǎn)使得很難合成水溶性二氫卟酚、特別很難在工業(yè)上合成水溶性二氫卟酚以及難以進(jìn)行藥物制備，該方法的主要缺點(diǎn)如下1.作為中間產(chǎn)物的二氫卟酚e6是濕塊，未知其確定的含量，所得到的二氫卟酚e6含量上的不穩(wěn)定性造成了下一步所得溶液的標(biāo)準(zhǔn)化能力的不確定性。
2.在合成工序中的關(guān)鍵中間體是脫鎂葉綠酸a(4)，由于它的酸性，其很難提純并且難以標(biāo)準(zhǔn)化，通過重復(fù)沉淀方法(如用Ponomarev的方法)分離得到的脫鎂葉綠酸a(4)是不定量的，因此不利于大規(guī)模制備。
3.通過指出的方法得到的脫鎂葉綠酸a(4)包含難以分離的雜質(zhì)。該缺點(diǎn)引起脫鎂葉綠酸a(4)定量上的不確定，并且在脫鎂葉綠酸a(4)轉(zhuǎn)變?yōu)槎溥卜拥倪^程中擾亂了環(huán)戊酮環(huán)的化學(xué)開環(huán)。
4.應(yīng)該注意到，按照Ponomarev制得的二氫卟酚e6水溶性鹽的樣品包含各種非卟啉型和卟啉型雜質(zhì)，用其中描述的方法并不能將這些雜質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)物二氫卟酚e6分離。具體地說，通過TLC和HPLC方法，人們應(yīng)該注意到卟啉的雜質(zhì)是脫鎂葉綠酸a(4)、紅紫素18(8)、二氫卟酚p6(9)以及其它一些附隨物。
人們認(rèn)為，與它們各自的二氫卟酚e6鹽相比，上述發(fā)明的類型(4)、(8)和(9)的化合物與親水性胺形成的鹽的特征是水溶性顯著降低。然而類型(4)、(8)和(9)的化合物與上述發(fā)明的親水性胺形成的鹽卻大大提高了水溶性，這可能是因?yàn)榕c二氫卟酚e6鹽形成了絡(luò)合物，這種現(xiàn)象使得不可能通過利用它們的不同的水溶性從雜質(zhì)，例如類型(4)、(8)和(9)的化合物中分離二氫卟酚e6產(chǎn)物。
5.被Ponomarev用于制備水溶性二氫卟酚的有機(jī)胺在實(shí)際應(yīng)用中不是最佳的，特別是D-葡糖胺，其與具有較高溶解度的二氫卟酚形成絡(luò)合物，由于其醛基可能氧化，因此是不夠穩(wěn)定的。同時(shí)，D-葡糖胺在溶液中可以以各種異構(gòu)體形式存在，這引起結(jié)構(gòu)上的不確定性，很難進(jìn)行各自詳細(xì)的結(jié)構(gòu)表征，不能滿足藥物制備上質(zhì)量控制的需要。另一個(gè)Ponomarev使用的空間大的胺，即N-甲基-D-葡糖胺，其與上述的D-葡糖胺具有相同的缺點(diǎn)，而且由于它很難制備，因此不容易得到。
6.Ponomarev認(rèn)為二氫卟酚e6衍生物與空間大的有機(jī)胺形成的水溶性鹽是很不確定的，因?yàn)橥ǔ５目臻g大的有機(jī)胺，例如包含叔丁基、新戊基、金剛烷基、環(huán)己基基團(tuán)的那些胺，由于空間大的有機(jī)部分的高疏水性，不能用于制備水溶性二氫卟酚e6鹽。
由于上述提及的這方面以及其它方面的缺點(diǎn)，使得Ponomarev要求保護(hù)的方法不可能用于制備GMP標(biāo)準(zhǔn)的有效藥物級(jí)組合物。
用于合成本發(fā)明化合物的初始卟啉衍生物通常從純的和標(biāo)準(zhǔn)的粗卟啉材料脫鎂葉綠酸a甲酯(5)或脫鎂葉綠酸a乙酯(6)中獲得。目前已知的用于從生物原料中分離卟啉的一般方法為用有機(jī)溶劑繁重的洗滌和/或冷凍步驟以破壞生物材料的細(xì)胞壁，以及重復(fù)萃取并且化學(xué)處理生物質(zhì)，首先轉(zhuǎn)化為葉綠素，然后其變?yōu)槊撴V葉綠素以及隨后水解得到脫鎂葉綠酸(K.M.Smith，D.A.Goff和D.J.Simpson，J.Amer.Chem.Soc.，1985，107，4946-4954；R.K.Pandey，D.A.Bellnier，K.M.Smith和T.J.Dougherty，Photochem.Photobiol.，1991，53，65-72}。
因此，需要提供一種容易的并且有效的方法，用于制備純的和在化學(xué)上穩(wěn)定的水溶性藥物級(jí)卟啉衍生物，該水溶性藥物級(jí)卟啉衍生物具有標(biāo)準(zhǔn)含量的所需物質(zhì)并且適用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用，特別是光動(dòng)力學(xué)治療應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這種需要并進(jìn)一步提供了其它相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明目的和概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化學(xué)上穩(wěn)定的并具有標(biāo)準(zhǔn)含量的所要物質(zhì)的水溶性卟啉衍生物，其適用于各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用，特別是PDT應(yīng)用。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供藥物級(jí)高純度的水溶性卟啉衍生物，其在藥物組合物中是有效的。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種制備化學(xué)上穩(wěn)定的水溶性卟啉衍生物的方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種容易的并且節(jié)省時(shí)間的從生物原料制備化學(xué)上穩(wěn)定的水溶性卟啉衍生物的方法，該方法其避免了現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供在藥學(xué)上可接受的制劑中化學(xué)穩(wěn)定的水溶性卟啉衍生物，其用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用，例如用于治療癌癥及其它過度增生性疾病、感染等等。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種制備水溶性卟啉衍生物的方法，其包括一步或兩步的生物原料的直接酸性醇解，制備脫鎂葉綠酸烷基酯的晶體，然后將得到的脫鎂葉綠酸烷基酯轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝赃策?，接著酸性卟啉在水中或在一種含水有機(jī)溶液中與親水性有機(jī)胺反應(yīng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種制備水溶性卟啉衍生物的方法，其包括酸性卟啉在水中或在含水有機(jī)溶液中與親水性有機(jī)胺反應(yīng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是制備水溶性卟啉衍生物的方法，該方法包括下述多個(gè)步驟一步或兩步的生物原料的直接酸性醇解，制備脫鎂葉綠酸烷基酯的晶體，將得到的脫鎂葉綠酸烷基酯轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝赃策?，然后使所述酸性卟啉在水中或在含水有機(jī)溶液中與親水性有機(jī)胺反應(yīng)，并通過反相色譜法使用揮發(fā)性溶劑提純所得的水溶性卟啉衍生物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備水溶性卟啉衍生物的方法，該方法包括使酸性卟啉在水中或在含水有機(jī)溶液中與親水性有機(jī)胺反應(yīng)，并通過反相色譜法使用揮發(fā)性溶劑提純水溶性卟啉衍生物。
此外，本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法得到的式(1)和(2)的水溶性卟啉衍生物，其用于光動(dòng)力學(xué)治療和其它醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的藥物組合物。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1測(cè)定用二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)制得的本發(fā)明(實(shí)施例9)水溶性鹽(A)和根據(jù)Ponomarev(RU2144538)制得的水溶性鹽(B)的暗毒性(dark toxicity)(細(xì)胞毒性，實(shí)施例14)；測(cè)試在OV2774細(xì)胞中進(jìn)行，加入不同濃度的如下指出的光敏劑。
圖2測(cè)定用二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)制得的本發(fā)明(實(shí)施例9)水溶性鹽(A)和根據(jù)Ponomarev(RU2144538)制得的水溶性鹽(B)的光毒性(phototoxicity)(實(shí)施例15)的測(cè)定；測(cè)試在OV2774細(xì)胞中進(jìn)行，加入不同濃度的如下指出的光敏劑并且在670nm處輻射。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明在描述本發(fā)明之前，規(guī)定用于本發(fā)明公開中使用的某些術(shù)語的定義是有幫助的。
卟啉是大環(huán)化合物，分別具有一個(gè)碳原子或一個(gè)氮原子的橋，連接多個(gè)吡咯以形成特征性的四吡咯環(huán)狀結(jié)構(gòu)。有許多不同類型的卟啉衍生物，包括那些含二氫吡咯單元的卟啉衍生物。在此使用的術(shù)語卟啉是指適用于PDT和藥物制劑的卟啉、酞菁、二氫卟酚、脫鎂葉綠酸、其金屬衍生物以及其它擬卟啉化合物。
在此使用的生物原料是用于制備本發(fā)明化合物的原料，例如包括植物、藻類、血液組分和昆蟲分泌物。
本發(fā)明的目的通過下面描述的方法得以實(shí)現(xiàn)，該方法包括酸性卟啉在水中或在含水有機(jī)溶液中與親水性有機(jī)胺反應(yīng)，親水性有機(jī)胺優(yōu)選為N-甲基-D-葡糖胺(10)，其是一種多羥基化的穩(wěn)定并且是無毒的用于制備藥物的化合物，或者與氨基烷基和氨基芳基苷，例如麥芽糖衍生物(11)和(12)，或者與碳水化合物衍生物相連的其它氨基基團(tuán)反應(yīng)。其它可行的試劑包括但不限于，三(羥甲基)氨基甲烷(亦稱為TRIS)(13)，它也是一種穩(wěn)定的和無毒的用于制備藥物的化合物，或者是TRIS衍生物例如化合物(14)和(15)，以及其它類型的親水性胺例如雙(2-羥乙基)胺(16)。根據(jù)本發(fā)明，氨基酸或寡肽例如賴氨酸低聚物，優(yōu)選是五和六賴氨酸，也可以用作制備水溶性卟啉衍生物的親水性有機(jī)胺。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，如實(shí)施例9中所述，在室溫下以及惰性氣氛下，在黑暗中進(jìn)行化學(xué)純的卟啉(如游離酸)和合適的親水性有機(jī)胺的定量化學(xué)計(jì)量反應(yīng)。所用的溶劑或者是用惰性氣體(例如氬氣、氦氣、或其它氣體)脫氣的化學(xué)純的水，或者如有必要，可以是水與合適的化學(xué)純的并脫氣的有機(jī)溶劑的混合物。有機(jī)溶劑隨后在不加熱的情況下在真空中蒸發(fā)(以避免初始卟啉的可能破壞)，并將產(chǎn)物冷凍干燥。在某些情況下，有必要加入有機(jī)溶劑以溶解初始卟啉，以便于卟啉(如游離酸)和合適的親水性有機(jī)胺發(fā)生反應(yīng)?？赡艿挠袡C(jī)溶劑的例子是丙酮或二氯甲烷和甲醇的混合物。所得的冷凍干燥的水溶性卟啉是化學(xué)純的，無需更進(jìn)一步的提純，滅菌后即可以用于醫(yī)學(xué)或生物應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，可以使用的不純成分包括初始卟啉的濕糊。除了用過量親水性有機(jī)胺與所有卟啉組分反應(yīng)外，反應(yīng)類似于如上所述的方法進(jìn)行。反應(yīng)混合物在真空中濃縮后，所得水溶性卟啉用具有合適的反相吸附劑的柱子，優(yōu)選是RP C-8或C-18型柱，進(jìn)行色譜提純。收集含目標(biāo)產(chǎn)物的餾分，不加熱下在真空中蒸發(fā)以除去有機(jī)溶劑，然后冷凍干燥，得到所要的水溶性卟啉衍生物。通過反相色譜法使用揮發(fā)性溶劑提純水溶性卟啉衍生物，得到標(biāo)準(zhǔn)的高質(zhì)量產(chǎn)物，這對(duì)于制備醫(yī)用制劑是重要的。
本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案是一種容易的并且有效的從生物原料中得到卟啉化合物的方法。該方法包括對(duì)生物原料進(jìn)行一步或兩步的直接酸性醇解，優(yōu)選甲醇醇解或乙醇醇解，得到關(guān)鍵中間體脫鎂葉綠酸烷基酯(優(yōu)選甲基酯和乙基酯)的晶體，然后將該關(guān)鍵中間體進(jìn)一步進(jìn)行多種化學(xué)轉(zhuǎn)化以得到目標(biāo)卟啉衍生物。這種方法可以從生物原料中簡(jiǎn)單并且相對(duì)快速的制備卟啉衍生物，而無需通過用有機(jī)溶劑對(duì)初始生物材料進(jìn)行繁重的洗滌或冷凍(以破壞細(xì)胞壁)以及前述已知方法中需要的重復(fù)萃取。
使用脫鎂葉綠酸烷基酯的晶體(優(yōu)選甲基酯和乙基酯)作為合成的中間產(chǎn)物，使得簡(jiǎn)單的提純和標(biāo)準(zhǔn)化成為可能，這對(duì)制備醫(yī)療方法如PDT中使用的藥物制劑中是關(guān)鍵的。
醇解的性能取決于初始生物原料的質(zhì)量，特別是它的干燥程度，在醇解期間，保持必要的酸濃度是很重要的。因此，在充分干燥的材料中，例如干燥的螺旋蘭細(xì)菌屬(Spirulina)或小球藻屬(Chlorella)生物質(zhì)或粉末狀干燥蕁麻葉(參見實(shí)施例1-5)有可能進(jìn)行直接的一步醇解以制備脫鎂葉綠酸烷基酯。
在不充分干燥的原料中，通過兩步醇解以制備脫鎂葉綠酸烷基酯，例如從菠菜(參見實(shí)施例6)中制備脫鎂葉綠酸a(5)和b(17)甲基酯。在該情況中，在初始原料中存在的大量水阻止了形成適合于裂解植醇酯的合適的酸濃度。然而，在第一步醇解之后得到的脫鎂葉綠素是足夠干燥的，可以在第二步醇解中用于制備脫鎂葉綠酸烷基酯的晶體。
根據(jù)本發(fā)明描述的方法，通過卟啉原料的化學(xué)轉(zhuǎn)化，例如由生物原料得到的脫鎂葉綠酸烷基酯晶體制備酸性卟啉，該酸性卟啉適用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘男问健?br> 具體地，2-脫乙烯基-2-(1-烷氧基乙基)-二氫卟酚e6例如乙氧基衍生物(19)可以通過脫鎂葉綠酸a的甲酯或乙酯用HBr在乙酸中的飽和溶液進(jìn)行溴氫化作用得到，各自生成2-脫乙烯基-2-(1-溴甲基)-脫鎂葉綠酸a，進(jìn)一步醇解得到2-脫乙烯基-2-(1-烷氧基乙基)-脫鎂葉綠酸a(例如化合物18)(C.Rimington，A.Roennestad，A.Western，和J.Moan，Int.J.Biochem.，1988，20，11 39-1149；K.R.Adams，C.R.Berembaum，R.Bonnett，A.N.Nizhnik，A.Salgado，和M.A.Valles，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1，1992，1465-1470)，并且隨后進(jìn)行皂化反應(yīng)，分別形成三酸化合物2-脫乙烯基-2-(1-烷氧基乙基)-二氫卟酚e6(19)或者例如與N-甲基-D-葡糖胺(10)形成水溶性鹽(實(shí)施例10)。
根據(jù)本發(fā)明，其它類型的親核試劑與2-脫乙烯基-2-(1-溴甲基)-脫鎂葉綠酸可以按類似方式進(jìn)行反應(yīng)，而不是它們的醇解，形成各種可能的卟啉衍生物，用于制備它們的水溶性形式。
此外，本發(fā)明用于制備不同的二氫卟酚和脫鎂葉綠酸衍生物的水溶性形式的方法可以通過實(shí)施例15-30(下面提供)進(jìn)行說明，以制備酸(4)和(20)-(33)與胺(10)的水溶性鹽。
(22)R＝COOMe (24)R1＝CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2COOH，R2＝COOMe(23)R＝H(25)R1＝CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2COOH，R2＝H(26)R1＝CH2CH2(OCH2CH2)5OCH2COOH，R2＝H(27)R1＝CH2COOH，R2＝H(28)R1＝(CH2)5COOH，R2＝H
(29) (30)R1＝H，R2＝(CH2)3N(CH3)2(31)R1＝H，R2＝(CH2)7NH2(32)R1＝OCH3，R2＝(CH2)5COOH(33)R1＝OCH3，R2＝(CH2)2OH根據(jù)本發(fā)明，酸性卟啉衍生物與親水性胺的反應(yīng)形成水溶性鹽。具體地，在脫鎂葉綠酸衍生物的情況中生成的是單鹽，而二鹽則是由三酸二氫卟酚(34)形成[通過形成一種可能的單鹽中間體，例如中間體(35)，如反應(yīng)流程1中所示]，因?yàn)?位的羧基(原子編號(hào)如化合物4-6所示)沒有顯現(xiàn)出足夠的用于形成鹽的酸性。
反應(yīng)流程1.
G-親水性胺因?yàn)楸景l(fā)明的水溶性卟啉鹽在溶于水的同時(shí)可以進(jìn)行水解(例如反應(yīng)流程2中的二氫卟酚)，所以需要在過量親水性胺存在下制備本發(fā)明的水溶鹽并將它們?cè)谌芙鉅顟B(tài)下儲(chǔ)存。
本發(fā)明的水溶性二氫卟酚二鹽可以通過如實(shí)施例9B中描述的柱色譜法提純而以單個(gè)狀態(tài)得到。將提純過的二鹽溶于水中進(jìn)行可逆水解，得到單鹽(例如，類型35，參見反應(yīng)流程2)，該單鹽與其二鹽相比，甚至與在水中溶解度差的母體二氫卟酚(1)相比，水溶性可能降低。這種方法可導(dǎo)致在溶液儲(chǔ)存期間形式少量的沉淀。
反應(yīng)流程2.
G-親水性胺為了避免這種不理想的方法并使溶液保持澄清和均相，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中例如PDT中使用這些溶液時(shí)是有嚴(yán)格要求的，優(yōu)選在少量和已知量的親水性胺(例如小于2摩爾當(dāng)量，更優(yōu)選在0.05-0.5當(dāng)量之間)存在下將二鹽溶于水中，以使所要的卟啉衍生物保持二鹽的形式，從而避免了由于二鹽的水解而形成單鹽和母體二氫卟酚。
本文公開的二氫卟酚和脫鎂葉綠酸衍生物與親水性胺形成的鹽具有0.1mg/L數(shù)量級(jí)的水溶性，這使得它們能夠在各種應(yīng)用中使用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備帶有通過肽鍵連接的氨基酸單元的脫鎂葉綠酸衍生物，以便與親水胺形成鹽，所述鹽的特征在于與沒有氨基酸片段的母體脫鎂葉綠酸化合物相比，其水溶性高出100以上。
具體地，脫鎂葉綠酸衍生物(36)與N-甲基-D-葡糖胺(10)形成的鹽的溶解度為40mg/L，而帶有連接氨基酸殘基的肽鍵的衍生物(7，20-33)的溶解度大于5g/L。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將化學(xué)穩(wěn)定的并且是水溶性的式(1)和(2)的卟啉衍生物用于各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用。所述化合物特別優(yōu)選用于PDT以治療癌癥和其它過度增生性疾病、感染、牛皮癬、動(dòng)脈粥樣硬化、AMD以及其它適于用光動(dòng)力治療的疾病和感染。由于其水溶性，所述化合物可以制成各種藥學(xué)上可接受的并且是活性的制劑，以用于不同的給藥方法，例如注射。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明制得的高純度水溶性卟啉衍生物在癌癥和其它過度增生性疾病以及感染的光動(dòng)力學(xué)治療中的應(yīng)用。PDT通過如下方法實(shí)現(xiàn)首先將所述的衍生物與藥學(xué)上可接受的應(yīng)用賦形劑混合，然后將衍生物輸送到特定的治療部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于疾病例如皮膚癌或其它皮膚病，應(yīng)用的賦形劑通常是皮膚用的乳膏、凝膠或者有時(shí)是氣霧劑的液體分散劑。將賦形劑中的衍生物給予治療區(qū)域之后，使藥物在治療區(qū)域停留足夠的時(shí)間，優(yōu)選在患病組織中積累卟啉衍生物。最后，將治療區(qū)域在合適波長(zhǎng)和足夠能量的光下進(jìn)行輻射，以激活卟啉衍生物，從而使其殺死所述患病組織的細(xì)胞。
本發(fā)明的卟啉衍生物之一，即由二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)根據(jù)實(shí)施例9B中的方法制得的水溶性鹽在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的暗毒性(實(shí)施例31，圖1)和光毒性(實(shí)施例32，圖2)的結(jié)果表明，本發(fā)明化合物用于PDT時(shí)表現(xiàn)出極好的性能。而用根據(jù)Ponomarev技術(shù)(RU2144538)制得的相同化合物進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，該化合物卻表現(xiàn)出差的特性(高的暗毒性和低的光毒性)。
然而，在特定情況下，如果不同卟啉衍生物的親水性胺鹽的特定混合物對(duì)患病組織表現(xiàn)出較高的光毒性時(shí)，給予這些混合物可能是有利的。這種提高的光毒性可能是由于在二氫卟酚e6的相同鹽存在下，化合物(4)、(7)和(8)與親水性胺形成的鹽的混合物的水溶性提高，這種現(xiàn)象是可以觀察到的。
本發(fā)明其它實(shí)施例的水溶性形式的良好光毒性提供在表1和2中，酸(4)、(7)、(22)和(25)與N-甲基-D-葡糖胺(10)形成的水溶鹽在HeLa細(xì)胞中的暗毒性和光毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在表1和2中。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開的二氫卟酚和脫鎂葉綠酸衍生物的水溶性形式在抗微生物光動(dòng)力療法中的應(yīng)用。這通過表3中的數(shù)據(jù)說明，表3總結(jié)了使用酸(4)、(7)、(22)和(25)與N-甲基-D-葡糖胺(10)形成的水溶性鹽對(duì)一些微生物進(jìn)行光動(dòng)力療法處理的結(jié)果。
實(shí)施例下面的實(shí)施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供全面和說明性的公開和描述，描述了如何制備本發(fā)明的水溶性卟啉衍生物，該水溶性卟啉衍生物用于制備藥物組合物，這些實(shí)施例并不是用來限制本發(fā)明的范圍。雖然在實(shí)驗(yàn)中盡量保證使用的數(shù)據(jù)(例如數(shù)量、溫度等等)的準(zhǔn)確性，但是也應(yīng)該考慮到某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
實(shí)施例1從盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌(Spirulina platesis)中獲得脫鎂葉綠酸甲酯(5)(A)將20g盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌、60mL甲醇和10mL濃硫酸的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)，接著用30mL甲醇稀釋，然后用硅藻土(Celite)墊過濾。用甲醇(70mL)洗滌過濾漏斗中的物質(zhì)，用己烷(2×30mL)萃取上述溶液，用氯仿(100mL)稀釋，然后將其倒入飽和氯化鉀水溶液(300mL)中。所得混合物用硅藻土墊過濾，水相用氯仿(2×50mL)萃取。用水洗滌合并的萃取液，用棉花過濾后濃縮。將殘余物溶解在氯仿-己烷(1∶1，30mL)的混合物中，用氧化鋁墊過濾，首先用己烷(以除去非極性非-二氫卟酚組分)洗滌，接著用二氯甲烷(以得到脫鎂葉綠酸甲酯)洗滌。將二氯甲烷溶液濃縮，殘余物首先用二氯甲烷-甲醇(3mL+7mL)進(jìn)行重結(jié)晶，然后用二氯甲烷-甲醇(1mL+10mL)進(jìn)行重結(jié)晶，最后用甲醇(10mL)洗滌，得到113mg純的脫鎂葉綠酸甲酯a(5)。1H-NMR光譜9.41，9.23，8.56(3H，全部s，meso-H)；7.88(1H，q，-CH＝CH2)，6.25-6.10(2H，CH＝CH2)，6.28(1H，s，環(huán)戊酮-H)，4.50，4.25(2H，m，7-H，8-H)；3.55(2H，q，4-CH2CH3)；3.93，3.70，3.63，3.39，3.15(15H，全部s，5x-CH3)；2.75-2.20(4H，m，-CH2CH2COOCH3)；1.85(3H，d，8-CH3)；1.71(3H，m，4-CH2CH3)；0.55和-1.68ppm(2H，2br s，2x-NH-)。經(jīng)鑒定該產(chǎn)物與從Porphylin Products Inc.，USA得到的化合物相同。
(B)將10g盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌、30mL甲醇和5mL濃硫酸的混合物在室溫(r.t.)下攪拌3小時(shí)，然后用冷水(70mL)稀釋，用硅藻土墊過濾。用水將過濾漏斗中的物質(zhì)洗至pH為7，乙醇(50mL)，己烷(4×30mL)，用丙酮(120mL)將所需的脫鎂葉綠酸甲酯從過濾漏斗中的物質(zhì)中移出。將上述溶液濃縮，并溶于氯仿中，用無水硫酸鈉墊(無水)過濾，濃縮，殘余物首先用二氯甲烷-甲醇(1.5mL+5mL)進(jìn)行重結(jié)晶，然后用二氯甲烷-甲醇(1.5mL+10mL)進(jìn)行第二次重結(jié)晶，最后用甲醇(15mL)洗滌，得到60mg純的脫鎂葉綠酸甲酯a(5)。
(C)在室溫以及攪拌下將濃硫酸(250mL)加入到500g盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌在甲醇(1500mL)中的懸浮液中。形成的混合物在室溫下保持3小時(shí)，然后倒入水(6L)中，用硅藻土墊(直徑12cm，高度2cm；在過濾器Schott N3上)過濾。過濾器上的糊狀物質(zhì)用水(3×800mL)洗滌，直至pH為6，然后用乙醇(3×300mL)和石油醚(40-60℃，3×250mL)洗滌。接著用丙酮(總共1.2L)從墊上移出目標(biāo)產(chǎn)物，濃縮，并將殘余物溶于氯仿(200mL)中，用棉絮過濾，然后在真空中濃縮，殘余物用二氯甲烷(40mL)和甲醇(200mL)的混合物結(jié)晶，得到2.45g脫鎂葉綠酸甲酯a，約90％的純度(TLC，95∶5的氯仿/丙酮)。將后者溶于氯仿(20mL)中，并將其通過氧化鋁墊(中性，Grade II；直徑8cm，高度5cm)，用氯仿進(jìn)行洗脫；濃縮并用二氯甲烷(50mL)和甲醇(250mL)的混合物進(jìn)行重結(jié)晶，得到2.38g純的(TLC對(duì)照)脫鎂葉綠酸甲酯a(5)。其它數(shù)量的脫鎂葉綠酸甲酯a(約10-15％)可以通過對(duì)兩次結(jié)晶的母液進(jìn)行常規(guī)后處理(色譜法和重結(jié)晶)得到。
實(shí)施例2從盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌中得到脫鎂葉綠酸乙酯a(6)將20g盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌在60mL 96％的含水乙醇和10mL濃硫酸中進(jìn)行乙醇解，隨后按照實(shí)施例1A中描述的制備脫鎂葉綠酸a甲酯(5)的方法進(jìn)行后處理，只是在所有步驟中用乙醇代替甲醇，得到110mg脫鎂葉綠酸乙酯a(6)的晶體。1H-NMR光譜9.57，9.42，8.61(3H，全部s，meso-H)；7.99(1H，q，-CH＝CH2)，6.32，6.26(2H，dd，-CH＝CH2)，6.27(1H，s，環(huán)戊酮-H)，4.51，4.28(2H，m，7-H，8-H)；4.07(2H，q，-COOCH2CH3)；3.71(2H，q，4-CH2CH3)；3.89，3.72，3.41，3.27(12H，全部s，4x-CH3)；2.69，2.47，2.37，2.22(4H，m，-CH2CH2COOCH2CH3)；1.83(3H，d，8-CH3)；1.73(3H，t，4-CH2CH3)；1.12(3H，t，-COOCH2CH3)；0.57，-1.46ppm(2H，2br s，2x-NH-)。
實(shí)施例3從最大螺旋藍(lán)細(xì)菌(Spirulina maxima)中得到脫鎂葉綠酸甲酯a(5)用30mL甲醇和5mL濃硫酸處理10g最大螺旋藍(lán)細(xì)菌，隨后按照實(shí)施例1B所述制備脫鎂葉綠酸甲酯a(5)的方法進(jìn)行后處理，得到64mg脫鎂葉綠酸a甲酯(5)。
實(shí)施例4
從小球藻中得到脫鎂葉綠酸a甲酯(5)和b甲酯(17)將10g干燥的小球藻生物質(zhì)進(jìn)行甲醇解，隨后按照實(shí)施例3中描述的方法進(jìn)行后處理，得到20∶7的脫鎂葉綠酸a甲酯和脫鎂葉綠酸b甲酯的混合物(140mg)，由1H NMR光譜測(cè)得。用硅膠60(Fluka，70-230目)柱色譜進(jìn)行分離，用15∶30∶1.5的氯仿-甲苯-丙酮作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到單一的脫鎂葉綠酸a甲酯(5)和脫鎂葉綠酸b甲酯(17)。脫鎂葉綠酸a甲酯(5)與上述描述的產(chǎn)物相同。脫鎂葉綠酸b甲酯(17)的1H-NMR光譜數(shù)據(jù)11.0(1H，s，CHO)，10.22，9.50，8.55(3H，全部s，meso-H)；7.98(1H，q，-CH＝CH2)，6.40-6.15(2H，-CH＝CH2)，6.25(1H，s，環(huán)戊酮-H)，4.48，4.20(2H，m，7-H，8-H)；3.60(2H，q，4-CH2CH3)；3.93，3.78，3.75，3.40(12H，全部s，4x-CH3)；2.75-2.20(4H，m，-CH2CH2COOCH3)；1.85(3H，d，8-CH3)；1.71(3H，m，4-CH2CH3)；0.48和-1.60 ppm(2H，2br s，2x-NH-)。
實(shí)施例5從粉末狀干蕁麻葉中得到脫鎂葉綠酸a甲酯(5)和脫鎂葉綠酸b甲酯(17)將500g粉末狀干蕁麻葉進(jìn)行甲醇解，隨后按照實(shí)施例1C中描述的方法進(jìn)行后處理，由1H NMR光譜測(cè)定得知，得到6.5∶1的脫鎂葉綠酸a甲酯(5)和脫鎂葉綠酸b甲酯(17)的混合物(1.74g)。
實(shí)施例6從冷凍菠菜葉中得到脫鎂葉綠酸a甲酯(5)和脫鎂葉綠酸b甲酯(17)在室溫和攪拌下，將濃硫酸(5mL)加入到100g冷凍菠菜葉和甲醇(100mL)的混合物中。形成的混合物在室溫下保持16小時(shí)，用水(100mL)稀釋，用硅藻土過濾。殘余物用丙酮(3×50mL)洗滌，丙酮萃取物用二氯甲烷-水(1∶1，100mL)稀釋，分離有機(jī)相并濃縮，殘余物在100mL含5％濃硫酸的甲醇中進(jìn)行甲醇解，隨后按照實(shí)施例1C中描述的方法進(jìn)行后處理，由1H NMR光譜測(cè)定得知，得到2∶1脫鎂葉綠酸a甲酯(5)和脫鎂葉綠酸b甲酯(17)的混合物(40mg)。
實(shí)施例72-脫乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-脫鎂葉綠酸a甲酯(18)的制備將脫鎂葉綠酸a甲酯(5)(3.5g，5.8mmol)溶于溴化氫和乙酸(密度1.44，50mL)的混合物中，并放置18小時(shí)。然后在真空中將混合物在50℃蒸發(fā)至干，攪拌下加入無水乙醇(100mL)。18小時(shí)后，攪拌下將反應(yīng)混合物倒入碎冰中并用二氯甲烷(3×40mL)萃取。合并的萃取物用水(4×70mL)洗滌，并在真空中蒸發(fā)至干。殘余物用硅膠(40-63μm，Merck)柱色譜進(jìn)行分離，用二氯甲烷作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到2.95g產(chǎn)物(18)，收率77％。1H-NMR光譜9.82，9.58，8.55(3H，全部s，meso-H)；6.31(1H，s，10-H)，5.96(1H，q，2-CHCH3)；4.53，4.25(2H，m，7-H，8-H)；3.71(4H，dq，4-CH2CH3，-OCH2CH3)；3.93，3.87，3.63，3.41，3.28(15H，全部s，5x-CH3)；2.67，2.51，2.37，2.23(4H，m，-CH2CH2COOCH3)；2.11(3H，d，2-CHCH3)；1.80(3H，d，8-CH3)；1.75(3H，t，4-CH2CH3)；1.36(3H，t，-OCH2CH3)；0.55，-1.41(2H，2br s，2x-NH)。
實(shí)施例8二氫卟酚e6(7)的制備在氬氣氛中，攪拌下將氫氧化鉀水溶液(脫氣，10％的溶液，10mL)加入到140mg(231μmol)脫鎂葉綠酸a甲酯(35)在脫氣(用氦氣)丙酮(12mL)中的溶液?；旌衔镌?0℃下攪拌40分鐘，加熱至65℃，然后加入3％的氫氧化鉀水溶液(由5mL脫氣的10％的氫氧化鉀水溶液和11mL脫氣的水制備)。在氬氣氛下以及65℃下，將所得混合物加熱攪拌2.5小時(shí)，然后冷卻至室溫，用100mL水稀釋，用2N HCl(12mL)酸化。離心分離沉淀物(3分鐘，5000rpm)，然后用水(3×30mL)洗滌，再次離心分離，再次懸浮在10mL水中，冷凍干燥得到游離酸形式的粗二氫卟酚e6(120mg，87％，約90％的純度，用TLC對(duì)照)。TLCRP-18TLC板(Merck)，甲醇-二氯甲烷(3∶1)，Rf為0.6；污染物Rf＜0.3的極性更大的雜質(zhì)。最后純化將20mg粗二氫卟酚e6溶于甲醇-二氯甲烷-水(3∶1∶1，4mL)中，然后在RP-8柱(Merck，#11447，240×10，40-63μm)上進(jìn)行MPLC分離，用甲醇-二氯甲烷-水(4∶3∶1，2mL/min)進(jìn)行洗脫，得到純的二氫卟酚e6(7)(15mg，75％)。雜質(zhì)用甲醇-二氯甲烷(3∶1)洗出。1H-NMR光譜(DMSO-d6)9.88，9.78，9.18(3H，全部s，meso-H)；8.33(1H，dd，-CH＝CH2)；6.47(1H，d，cis-CH＝CH2)；6.22(1H，d，trans-CH＝CH2)；5.38(2H，m，-CH2COOH)；4.62(1H，m，-CHCH3)；4.48(1H，m，-CHCH2)；3.83(2H，m，-CH2CH3)；3.59，3.53，3.33(9H，全部s，-CH3)；2.62，2.27，2.14，(4H，m，-CH2CH2COOH)；1.70，1.66(6H，m，-CHCH3+-CH2CH3)；1.64，-1.90(2H，2br s具有不同的強(qiáng)度，2x-NH-)。13C-NMR光譜(DMSO-d6)特征信號(hào)僅為174.15，173.46，172.34(COOH)；129.21(-CH＝CH2)；122.25(-CH＝CH2)；103.74(γ)；101.12(β)；98.09(α)；94.67(δ)；52.66(CHCH2)；48.19(CHCH3)；37.80(-CH2COOH)；30.82，29.50(-CHCH2CH2COOH)；22.92(CHCH3)；18.91(CH2CH3)；17.58(CH2CH3)；11.00，10.98(ArMe)。
實(shí)施例9二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備(A)將N-甲基-D-葡糖胺(10)(4mg，21μmol)在水(4mL)中的溶液加入到5mg(8.4μmol)二氫卟酚e6(7)在甲醇-二氯甲烷(3∶1，20mL)(或在丙酮中)中的溶液中。在真空中蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。所得水溶液用膜(20μm)過濾，冷凍干燥，定量得到水溶性鹽(9mg，包括過量的N-甲基-D-葡糖胺)。
(B)將10％脫氣的氫氧化鉀水溶液(10mL)加入到50mg脫鎂葉綠酸a甲酯(5)在脫氣丙酮(12mL)中的溶液。在惰性氣體(氬氣)氣氛中，將混合物在40℃攪拌30分鐘，接著加入15mL 3％的脫氣的氫氧化鉀水溶液。所得混合物在惰性氣體(氬氣)氣氛下于65℃攪拌2小時(shí)，然后用水(100mL)稀釋，加入2N HCl水溶液(直至pH為6)，析出二氫卟酚e6(7)。離心分離沉淀物(3000rpm，5分鐘)，然后沉淀物用水(3×10mL)進(jìn)行洗滌。得到二氫卟酚e6的濕餅，可直接用于下一步反應(yīng)，無需進(jìn)一步純化。在氬氣氛下，將得到的全部二氫卟酚e6(7)樣品與N-甲基-D-葡糖胺(10)(30mg，2eq.)和水(10mL)混合，得到約5％的水溶性鹽的溶液。將所得混合物進(jìn)行攪拌直至其完全溶解，蒸發(fā)至干，然后使用RP C-8柱進(jìn)行HPLC分離，用水-甲醇進(jìn)行梯度洗脫(從40％至80％)。收集含目標(biāo)產(chǎn)物的混合物樣品，將其冷凍干燥，得到約75-80％收率的水溶性二鹽。它的結(jié)構(gòu)通過1H NMR光譜確認(rèn)。具體地，二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)部分的比例為1∶2的水溶性二鹽通過葡糖胺組分中N-Me基團(tuán)的信號(hào)(在2.70ppm)和二氫卟酚單元的8-Me基團(tuán)(在1.75ppm)信號(hào)的結(jié)合確認(rèn)。
(C)在氬氣氛及黑暗中，將50mg(84μmol)粉末狀二氫卟酚e6(7)、40mg(0.21mmol)N-甲基-D-葡糖胺(10)和水(50mL，預(yù)先用惰性氣體脫氣)的混合物進(jìn)行攪拌，直至完全溶解。用膜(20μm)將所得溶液過濾，冷凍干燥得到定量的水溶性鹽(90mg，包括過量的N-甲基-D-葡糖胺)。
實(shí)施例102-脫乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-二氫卟酚e6(19)的制備按照制備二氫卟酚e6(實(shí)施例8)的方法，將2-脫乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-脫鎂葉綠酸a甲酯(18)(2.8g，4.1mmol)進(jìn)行皂化，柱色譜分離后，得到2.1g產(chǎn)物(19)，收率79％。1H-NMR光譜(DMSO-d6)9.88，9.78，9.18(3H，全部s，meso-H)；6.47(1H，d，cis-CH＝CH2)；6.22(1H，d，trans-CH＝CH2)；5.5.1(2H，m，-OCH2CH3)；5.38(2H，m，-CH2COOH)；4.62(1H，m，-CHCH3)；4.48(1H，m，-CHCH2)；4.29(1H，q，-CHCH3)；3.83(2H，m，-CH2CH3)；3.59，3.53，3.33(9H，全部s，-CH3)；2.62，2.27，2.14(4H，m，-CH2CH2COOH)；1.83(1H，d，-CH(O-)CH3)；1.70，1.66(6H，m，-CHCH3+-CH2CH3)；1.54(3H，t，-OCH2CH3)；-1.90(2H，2br s具有不同的強(qiáng)度，2x-NH-)。13C-NMR光譜(DMSO-d6)特征峰僅為174.15，173.46，172.34(COOH)；129.21(-CH＝CH2)；103.74(γ)；101.12(β)；98.09(α)；94.67(δ)；67.97(-CH(O-)CH3)；63.49(-OCH2CH3)；52.66(CHCH2)；48.19(CHCH3)；37.80(CH2COOH)；30.82，29.50(-CHCH2CH2COOH)；22.92(CHCH3)；20.20(-CH(O-)CH3)；18.91(CH2CH3)；17.58，15.23(CH2CH3+-OCH2CH3)；11.00，10.98(ArMe).
實(shí)施例11二氫卟酚e6衍生物(19)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備按照實(shí)施例9C中描述的方法，將30mg 2-脫乙烯基-2-(1-乙氧基乙基)-二氫卟酚e6(19)與20mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，冷凍干燥，定量得到50mg水溶性鹽。
實(shí)施例12雙[2-(β-麥芽糖氧基)乙基]胺(11)的制備在-20℃下，攪拌下，將過-O-乙酰基-麥芽糖基溴化物(500mg，0.7mmol)、N-芐氧基羰基-N，N-雙(2-羥乙基)胺(56mg，0.233mmol)和2，4，6-三甲基吡啶(80μl，0.605mmol)的溶液滴加到三氟甲磺酸銀(208mg，0.805mmol)和1.5mL無水二氯甲烷的混合物中。將混合物溫?zé)嶂潦覝兀缓笥?.5mL三乙胺處理，用200mL二氯甲烷稀釋，用飽和Na2S2O3水溶液(50mL)和水(50mL)洗滌，濃縮，使用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)進(jìn)行快速色譜純化，得到粗的N-芐氧基羰基-N，N-雙[2-(七-O-乙?；?β-麥芽糖氧基)乙基]胺(57mg)。選擇結(jié)構(gòu)的特定13C NMR數(shù)據(jù)(500MHz，CDCl3)20.41(CH3CO)；46.92，47.24，48.00和48.02(OCH2CH2N和OCH2CH2N)；61.30，61.50，61.98，和62.52(葡萄糖部分的C-6)；67.18(NCOOCH2C6H5)；67.81，68.33，69.14，69.84，72.02，72.55，75.10(C-2-C-5，葡萄糖部分)；95.38(C-1，α-葡萄糖部分)；100.18和101.10(C-1，β-葡萄糖部分)；127.73，128.01和128.40(OCH2C6H5)；164.00(NCOO)；169.24，169.42，169.76，169.98，170.35(CH3CO)。[α]D38.9°(c1，乙酸乙酯)。將得到的產(chǎn)物溶解在0.1M甲醇鈉的無水甲醇溶液中，并放置2小時(shí)，然后用離子交換樹脂KU-2(H+)中和并過濾。濾液在Pd/C催化劑下氫化反應(yīng)過夜，過濾，冷凍干燥得到23mg化合物(11)，[α]D7(1c 1，水)。選擇結(jié)構(gòu)的特定13C NMR數(shù)據(jù)(500MHz，D2O)48.74(OCH2CH2N)，5O.85(OCH2CH2N)；61.72(C-6，α-葡萄糖部分)，61.92(C-6，β-葡萄糖部分)，77.28(C-4，β-葡萄糖部分)；100.83(C-1，α-葡萄糖部分)；103.40(C-1，β-葡萄糖部分)。
實(shí)施例13二氫卟酚e6(7)與雙[2-(β-麥芽糖氧基)乙基]胺(11)的水溶性鹽的制備按照實(shí)施例9C描述的方法，使5mg二氫卟酚e6(7)與18.6mg胺(11)反應(yīng)，幾乎定量地得到23mg冷凍干燥的水溶性鹽。
實(shí)施例14制備中脫鎂葉綠酸-a甲酯(37)將脫鎂葉綠酸-a甲酯(5)(130mg，0.2mmol)溶于5mL四氫呋喃，在室溫和約1大氣壓的H2以及在30mg碳載的10％Pd(OH)2上氫化反應(yīng)1小時(shí)。過濾除去催化劑，將溶液進(jìn)行濃縮，得到純的中(meso)脫鎂葉綠酸-a甲酯(37)(125mg，定量)。
實(shí)施例15制備中二氫卟酚-e6(20)按照實(shí)施例9B中的方法將中脫鎂葉綠酸-a甲酯(37)(20mg，0.033mmol)進(jìn)行堿性水解，得到中二氫卟酚-e6(17mg，86％)。MS(-)(電霧化)597.3(M-H)。
實(shí)施例16中二氫卟酚e6(20)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備按照實(shí)施例9C中描述的方法，15mg中二氫卟酚e6(20)與12mgN-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，定量得到27mg冷凍干燥的水溶性鹽。
(37)R1COOMe，R2＝Me(38) (39)(40)R1＝H，R2＝Me(41)R1＝H，R2＝C6F5 實(shí)施例17脫鎂葉綠酸a(4)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備將脫鎂葉綠酸a甲酯(5)(30mg，0.049mmol)溶于2mL 50％的硫酸，混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，用冰水稀釋，然后用氯仿萃取。萃取物用水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，濃縮后得到粗脫鎂葉綠酸-a(4)。然后將后者溶于3mL N-甲基-D-葡糖胺(10)(11.6mg，1.2eq.)的水溶液中。用45μm過濾器過濾所得溶液，冷凍干燥后得到29mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸4組分)591.2(M-H)。
實(shí)施例18二氫卟酚e6二甲酯(21)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備二氫卟酚-e6三甲酯(38)[根據(jù)Ltjnen S.，Hynninen P.H.，Synthesis，1980，541-543制備](25mg，0.039mmol)用50％硫酸進(jìn)行酸性水解，然后按照實(shí)施例17中描述的方法與9mg N-甲基-D-葡糖胺(10)進(jìn)行反應(yīng)，冷凍干燥后得到32mg的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸21組分)623.5(M-H)。
實(shí)施例19中(meso)焦(pyro)脫鎂葉綠酸a衍生物(25)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備將脫鎂葉綠酸-a甲酯(5)(1.3g，2.09mmol)溶于100mL吡啶，在氮?dú)夥占昂诎抵?，攪拌回流反?yīng)8小時(shí)。蒸發(fā)除去吡啶，殘余物用二氯甲烷/甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到1.08g(92％)的焦(pyro)脫鎂葉綠酸-a甲酯(39)。UV/vis λmax(ε)(CH2Cl2)410(112500)，509(11400)，537(9800)，611(8500)，669(47000)nm。
焦脫鎂葉綠酸a甲酯(39)(1.0g，1.78mmol)溶于100mL丙酮，在室溫和約8-10大氣壓的H2中，在300mg 10％的碳載Pd催化劑中進(jìn)行氫化反應(yīng)2小時(shí)。過濾除去催化劑，濃縮溶液得到純的中焦脫鎂葉綠酸-a甲酯(40)(1.0g，定量的)。UV/vis λmax(ε)(CH2Cl2)408(136000)，501(12400)，534(11800)，603(10500)，656(54600)nm；1H-NMR(200MHz，CDCl3)9.40(s，1H，(β-meso H)，9.16(s，1H，α-meso H)，8.46(s，1H，δ-meso H)，5.26和5.08(AB，J＝19.7Hz，10-CH2)，4.46(dq，1H，J7,8＝2.0Hz，8-H)，4.27(dt，1H，7-H)，3.80和3.64(每個(gè)q，4H，J＝7.5Hz，2a-和4a-CH2)，3.63，3.52，3.28和3.21(每個(gè)s，12H，1-、3-、5-Me和COOMe)，2.80-2.20(m，4H，7a，b-CH2CH2)，1.80(d，3H，J＝7.3Hz，8-Me)，1.71和1.63(每個(gè)t，6H，J＝7.5Hz，2b-和4b-Me)，0.60和-1.60(每個(gè)br s，2H，NH)。
將中焦脫鎂葉綠酸a甲酯(40)(250mg，0.443mmol)溶于5mL50％的硫酸，混合物在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，用冰水稀釋，并用氯仿萃取。萃取物用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，濃縮得到粗中焦脫鎂葉綠酸a(36)。然后將后者溶于20mL二氯甲烷中，然后向其中加入0.3mL(2.22mmol，約5eq.)的三乙胺，接著加入0.1mL(0.576mmol，1.3eq.)的三氟乙酸五氟苯基酯。混合物在室溫下攪拌反應(yīng)20分鐘(以制備化合物41)，向其中加入0.5mL水，然后向其中加入化合物42(200mg，GlycoSense AG的產(chǎn)品，Jena，Germany)的5mL二氯甲烷溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘，用二氯甲烷稀釋，然后用水和5％的硫酸洗滌，干燥，濃縮。殘余物用硅膠快速色譜法進(jìn)行純化，使用丙酮-二氯甲烷(20∶80)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到290 mg(88％)胺43。UV/visλmax(ε)(CH2Cl2)408(136500)，501(12300)，534(11800)，603(10000)，656(54500)nm；1H-NMR(300MHz，CDCl3)9.41(s，1H，β-meso H)，9.20(s，1H，α-meso H)，8.47(s，1H，δ-meso H)，6.08(br s，1H，CONH)，5.26和5.08(AB，J＝19.7Hz，10-CH2)，4.51(br q，1H，8-H)，4.32(br d，1H，7-H)，3.82和3.66(每個(gè)q，4H，J＝7.5Hz，2a-和4a-CH2)，3.78(s，2H，OCH2COOMe)，3.63，3.32和3.21(每個(gè)s，9H，1-、3-和5-Me)，3.52(s，3H，COOMe)，3.28(br s，12H，NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O)，2.80-1.90(m，4 H，7a，b-CH2CH2)，1.80(d，3H，J＝7.3Hz，8-Me)，1.72和1.68(每個(gè)t，6H，J＝7.5Hz，2b-和4b-Me)，0.70和-1.60(每個(gè)br s，2H，NH)。13C-NMR(75MHz，CDCl3)196.3，172.4，172.3，160.2，155.2，150.3，149.0，145.0，142.3，141.6，137.3，136.9，135.6，131.3，130.1，127.8，105.9，104.1，95.8，92.5，70.5，70.2，69.9，69.6，68.2，51.6，50.1，48.0，39.1，39.0，32.6，30.2，23.1，19.5，19.4，17.5，17.0，12.0，11.3，11.0。
將胺43(195mg，0.263mmol)溶于4mL 50％的硫酸，混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，用冰冷的水稀釋，離心分離所得沉淀物(5000rpm，3分鐘)，然后沉淀物用水(2×50mL)洗至pH為7(形成25)，然后將其溶于丙酮(50mL)、甲醇(15mL)和水(6mL)的混合物中。然后向上述溶液中加入N-甲基-D-葡糖胺(10)(56mg，0.29mmol，1.1eq.)。在40℃下將所得溶液在真空(約20mmHg)中濃縮，除去有機(jī)溶劑。將濃縮后的殘余物溶于40mL水中，用45μm過濾器過濾，冷凍干燥后得到239mg水溶性鹽。UV/vis λmax(ε)(H2O)375(46550)，514(5750)，548(5750)，608(6320)，660(21260)。MS(-)(電霧化)(酸25組分)724.7(M-H)。
(44) (45)R＝Me(48)(46)R＝H(47)R＝C6F5
實(shí)施例20細(xì)菌脫鎂葉綠酸衍生物(29)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備攪拌下，將0.5mL吡啶加入到中焦脫鎂葉綠酸-a甲酯(40)(650mg，1.152mmol)的130mL二氯甲烷溶液中，接著向其中加入600mg(2.361mmol，2.05eq.)的四氧化鋨。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，然后向溶液中鼓入H2S氣體5分鐘以將鋨酸鹽轉(zhuǎn)化為游離二醇(44)，混合物用硅膠柱進(jìn)行分離，使用丙酮-氯仿(5∶95)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到初始化合物40(190mg，29％)。用丙酮-氯仿(15∶85)進(jìn)行洗脫得到二醇(44)(350mg，51％)。后者在室溫下用20mL濃硫酸處理30分鐘。反應(yīng)混合物用冰水稀釋，接著用氯仿萃取。萃取物分別用碳酸氫鈉水溶液和水洗滌，在無水硫酸鈉中干燥，濃縮。殘余物用硅膠柱色譜進(jìn)行純化，使用丙酮-氯仿(1∶99)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到酮(45)(180mg，從化合物(40)開始計(jì)算的收率為27％)[參見R.K.Pandey等人，J Org.Chem.，1997，62，1463-1472]。將后者溶于5mL50％的硫酸中，然后將混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，用冰冷卻的水稀釋，用氯仿萃取。萃取物用水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，濃縮后得到粗化合物46。將后者溶于20mL二氯甲烷中，接著加入0.2mL(1.58mmol，約5eq.)的三乙胺，然后加入70μL(0.411mmol，1.3eq.)的三氟乙酸五氟苯基酯?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘(以得到47)，然后向其中加入0.5mL的水，接著加入化合物42(150mg，GlycoSense AG的產(chǎn)品，Jena，Germany)在5mL二氯甲烷中的溶液。混合物在室溫下攪拌30分鐘，用二氯甲烷稀釋，用水和5％硫酸洗滌，干燥，濃縮。殘余物用硅膠進(jìn)行快速色譜純化，使用丙酮-二氯甲烷(20∶80)洗脫，得到205 mg(85％)的酰胺(48)。UV/vis λmax(ε)(CH2Cl2)394(42300)，412(44100)，506(7650)，539(9100)，597(4500)，652(15750)，712(30600)nm；1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.18，8.72，8.50(每個(gè)s，3H，meso H)，6.10(br s，1H，CONH)，5.20(m，2H，10-CH2)，4.50和4.30(兩個(gè)都是m，2H，8-H和7-H)，3.88(s，2H，OCH2COOMe)，3.58，3.41和3.21(每個(gè)s，9H，1-、3-和5-Me)，3.51(s，3H，COOMe)，3.30(brs，12H，NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O)，2.80-1.90(m，4H，7a，b-CH2CH2)，1.90-1.65(m，6H，2xCH2CH3)，0.5(m，3H，CH2CH3)，-0.10和-1.70(每個(gè)br s，2H，NH)。13C-NMR(75MHz，CDCl3)201.4，199.2，172.3，171.7，153.3，141.0，137/2，98.2，95.0，91.3，89.7，87.1，79.4，70.7，70.4，70.1，69.8，68.4，53.4，51.8，49.9，48.0，39.3，36.2，32.9，32.1，30.5，28.5，25.9，23.2，19.3，16.9，11.9，11.0，9.0，8.1。
將所述酰胺衍生物(48)(205mg，0.270mmol)溶于4mL 50％的硫酸中，混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，用冰冷卻的水稀釋。離心分離所得沉淀物(5000rpm，3分鐘)，用水(2×50mL)洗滌至pH為7(以得到29)，并將其溶于丙酮(50mL)、甲醇(15mL)和水(6mL)的混合物中。將N-甲基-D-葡糖胺(10)(56mg，0.29mmol，1.1eq.)加入到該溶液中。所得溶液在40℃下真空(約20mmHg)濃縮以除去有機(jī)溶劑。將殘余物溶于40mL水中，用45μm過濾器過濾，溶液在40℃下真空(約20mmHg)濃縮，并在40℃下真空(約1mmHg)干燥，得到240mg水溶性鹽。UV/visλmax(ε)(H2O)420(40400)，515(5380)，561(6150)，668(9610)，776(51200)。MS(-)(電霧化)(酸29組分)740.7(M-H)。
實(shí)施例21脫鎂葉綠酸a衍生物(22)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化脫鎂葉綠酸a(4)(17mg，0.028mmol)，接著在過量三乙胺存在下與化合物42(25mg，GlycoSense AG的產(chǎn)品，Jena，Germany)反應(yīng)，然后用50％的硫酸進(jìn)行酸性水解，并按照實(shí)施例19中描述的方法與6.5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，冷凍干燥后得到23mg水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸22組分)780.1(M-H)。
實(shí)施例22
焦脫鎂葉綠酸a衍生物(23)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備用50％的硫酸對(duì)焦脫鎂葉綠酸a甲酯(39)(15mg)進(jìn)行酸性水解，接著用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化，然后在過量三乙胺存在下與化合物42(25mg，GlycoSense AG的產(chǎn)品，Jena，Germany)反應(yīng)，然后用50％的硫酸進(jìn)行酸性水解，按照實(shí)施例19中描述的方法與6mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到19mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸23組分)722.1(M-H)。
實(shí)施例23中脫鎂葉綠酸a衍生物(24)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備用50％的硫酸對(duì)中脫鎂葉綠酸a甲酯(37)(16mg)進(jìn)行酸性水解，接著用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化，然后在過量三乙胺存在下與化合物42(25mg，GlycoSense AG的產(chǎn)品，Jena，Germany)反應(yīng)，然后用50％的硫酸進(jìn)行酸性水解，按照實(shí)施例19中描述的方法與6mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到18mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸24組分)782.1(M-H)。
實(shí)施例24中焦脫鎂葉綠酸a衍生物(26)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備用三氟乙酸五氟苯基酯(20μL)活化中焦脫鎂葉綠酸a(36)(20mg，0.034mmol)，接著在過量三乙胺存在下與化合物49(40 mg，GlycoSenseAG的產(chǎn)品，Jena，Germany)反應(yīng)，然后按照實(shí)施例19中描述的方法與7mg的N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到32mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸26組分)856.7(M-H)。
實(shí)施例25中焦脫鎂葉綠酸a衍生物(27)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化中焦脫鎂葉綠酸a(36)(15mg，0.026mmol)，接著在過量三乙胺存在下與20mg甘氨酸甲酯反應(yīng)，接著用50％的硫酸進(jìn)行酸性水解，然后按照實(shí)施例19中描述的方法與5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到19mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸27組分)592.6(M-H)。
實(shí)施例26中焦脫鎂葉綠酸a衍生物(28)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備用三氟乙酸五氟苯基酯(15μL)活化中焦脫鎂葉綠酸a(36)(14mg，0.024mmol)，接著在過量三乙胺存在下與25mgε-氨基己酸甲酯反應(yīng)，接著用50％的硫酸進(jìn)行酸性水解，然后按照實(shí)施例19中描述的方法與5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到20mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸28組分)648.5(M-H)。
實(shí)施例27二氫卟酚-e6衍生物(30)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備將脫鎂葉綠酸a甲酯(5)(38mg，0.063mmol)與N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷(100μL)在1，4-二噁烷(3mL)中的混合物在室溫下保持10小時(shí)(以制備化合物50)。向該溶液中加入6M NaOH水溶液(0.1mL)，將所得混合物回流10分鐘。然后加入5mL水，再回流10分鐘。將混合物冷卻，用30mL水稀釋，用乙酸酸化至pH為4-5。離心分離形成的沉淀物(5000rpm，3分鐘)，用水洗滌沉淀物，得到二酸衍生物(30)。將后者溶于7mL N-甲基-D-葡糖胺(10)(30mg，1.2eq.)水溶液中。用45μm過濾器過濾所得溶液，冷凍干燥后得到62mg水溶性鹽。MS(+)(電霧化)(酸30組分)681.3(M+H)。
實(shí)施例28
二氫卟酚e6衍生物(31)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備將脫鎂葉綠酸a甲酯(5)(22mg，0.036mmol)與1，7-二氨基庚烷(100μL)反應(yīng)，接著用NaOH水溶液進(jìn)行堿性水解，然后按照實(shí)施例27中描述的方法與18mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到41mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸31組分)709.4(M+H)。
實(shí)施例29二氫卟酚e6衍生物(32)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備將脫鎂葉綠酸a(4)(20mg，0.033mmol)和ε-氨基己酸甲酯(50mg，約10eq.)在1，4-二噁烷(3mL)中的溶液在室溫下保持120小時(shí)?；旌衔镉枚燃淄橄♂?，然后用0.5N HCl水溶液和水洗滌，干燥，濃縮，用硅膠快速色譜法進(jìn)行純化，使用3％的甲醇-二氯甲烷作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到22mg(88％)的酰胺衍生物(51)。后者用50％硫酸進(jìn)行酸性水解，然后按照實(shí)施例17中描述的方法與13.5mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到33mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸32組分)722.3(M-H)。
實(shí)施例30二氫卟酚e6衍生物(33)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的制備將脫鎂葉綠酸a(4)(20mg，0.034mmol)和2-氨基乙醇(50μL)在1，4-二噁烷(3mL)中的溶液在室溫下保持1小時(shí)?；旌衔镉枚燃淄橄♂專?.5N HCl水溶液和水洗滌，干燥，濃縮，用硅膠快速色譜法，使用3％的甲醇-二氯甲烷作為洗脫液進(jìn)行純化，得到20mg(91％)的酰胺衍生物(33)。然后按照實(shí)施例17中描述的方法與8mg N-甲基-D-葡糖胺(10)反應(yīng)，得到28mg冷凍干燥的水溶性鹽。MS(-)(電霧化)(酸33組分)652.2(M-H)。
實(shí)施例31在OV2774細(xì)胞中，測(cè)定根據(jù)本發(fā)明制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽與根據(jù)Ponomarev等(RU2144538)制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的暗毒性(細(xì)胞毒性)為了測(cè)定根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例9B制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽(化合物A)和根據(jù)Ponomarev等人的RU2144538制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽(化合物B)的細(xì)胞毒性(暗毒性)，將OV2774細(xì)胞(接種密度50-75細(xì)胞/mm2在RPMI-1640w.P.(用酚紅)中，5％胎牛血清，2mM Glutamax I，100μg/mL青霉素/鏈霉素)用逐漸增加至50μM的濃度培育24小時(shí)。在無敏化劑的介質(zhì)中再經(jīng)過24小時(shí)后，使用中性紅分析法測(cè)定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率的數(shù)值以未培育的對(duì)照樣品的百分比表示。對(duì)于每個(gè)培育濃度，三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行4次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于圖1中。化合物A與化合物B相比，其對(duì)OV2774細(xì)胞的毒性更低。培育濃度至25μM(化合物B10μM)時(shí)，細(xì)胞存活率沒有明顯降低。在此范圍內(nèi)不能測(cè)定IC50值(培育濃度，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)降低50％)。最高測(cè)試培育濃度的細(xì)胞存活率大于80％。
實(shí)施例32在OV2774細(xì)胞中，測(cè)定根據(jù)本發(fā)明制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽與根據(jù)Ponomarev等(RU2144538)制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的光毒性(細(xì)胞毒性)為了測(cè)定根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例9制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽(化合物A)和根據(jù)Ponomarev等人的RU2144538制得的二氫卟酚e6(7)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽(化合物B)的光毒性，將OV2774細(xì)胞(接種密度50-75細(xì)胞/mm2在RPMI-1640w/oP.(用酚紅)，5％胎牛血清，2mM Glutamax I，100μg/mL青霉素/鏈霉素)用前面實(shí)驗(yàn)中使用的的相同濃度化合物B(10μM，24h)培育。在無光敏劑和無酚紅的介質(zhì)中進(jìn)行第二階段的培育，然后用670nm的光(10-25mW/cm2，0.1-2.5J/cm2)進(jìn)行照射，使用中性紅分析法測(cè)定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率的數(shù)值以培育的、但未照射的對(duì)照組的百分比表示。五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行4次。樣品的ID50值(能流(能量密度)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)降低50％)用作光毒性的定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于圖2中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物A與化合物B相比，其對(duì)OV2774細(xì)胞的光毒性更高一些?；衔顰的ID50值約為化合物B的ID50值的一半(0.1J/cm2對(duì)0.2J/cm2)。
實(shí)施例33在HeLa細(xì)胞中，測(cè)定二氫卟酚(7)和脫鎂葉綠酸[(4)、(22)和(25)]衍生物與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的暗毒性(細(xì)胞毒性)為了測(cè)定根據(jù)實(shí)施例9、17、19和21制得的二氫卟酚e6(7)和脫鎂葉綠酸a衍生物(4、22、25)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的暗毒性，在光敏劑濃度從2μg/mL增加至500μg/mL的同時(shí)，將HeLa(人類頸部癌細(xì)胞)細(xì)胞單層培養(yǎng)物在96孔板(接種密度7000細(xì)胞/孔，具有10％胎牛血清的Dulbeco改性的必需培養(yǎng)基(Dulbeco-modifiedessentional medium)(DMEM))中培育48小時(shí)。
該細(xì)胞用純的DMEM進(jìn)行洗滌，然后在室溫下用10％的福爾馬林處理15分鐘。用水洗滌細(xì)胞兩次，細(xì)胞用0.1％的結(jié)晶紫(50μl/孔)溶液培育15分鐘，然后用水洗滌，用乙醇(100μl/孔)處理。形成的乙醇溶液的光密度用Specord 100(Analytik Jena AG，Germany)分光光度計(jì)在594nm處測(cè)定，以檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
細(xì)胞存活率的數(shù)值以未培育的對(duì)照組的百分比表示。對(duì)于每個(gè)培育濃度，進(jìn)行八個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表1中，表1中列出IC50和IC80值(培育濃度，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)降低達(dá)到50％和20％)。
表1.在HeLa細(xì)胞中，二氫卟酚(7)和脫鎂葉綠酸[(4)、(22)和(25)]衍生物與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的暗毒性(細(xì)胞毒性)數(shù)據(jù)(實(shí)施例33)
*不能測(cè)定(＞1000μg/mL)。
實(shí)施例34在HeLa細(xì)胞中，測(cè)定在662nm的輻射下二氫卟酚(7)和脫鎂葉綠酸[(4)、(22)和(25)]衍生物與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的細(xì)胞毒性為了測(cè)定根據(jù)實(shí)施例9、17、19和21制得的二氫卟酚e6(7)和脫鎂葉綠酸a衍生物(4、22、25)與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的細(xì)胞毒性，在光敏劑濃度從0.01μg/mL增加至40μg/mL的同時(shí)，將HeLa(人類頸部癌細(xì)胞)細(xì)胞單層培養(yǎng)物在96孔板(接種密度30,000細(xì)胞/孔，在含10％胎牛血清的DMEM中)中培育。培育30分鐘后，用662nm的光[Ceralas PDT激光器，BioLitec AG，德國(guó)；150mW/cm2，5-20J/cm2]照射。用MTT分析法測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率的值以輻射的、但未培育的對(duì)照組的百分比表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行8次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表2中，表2中列出在進(jìn)行10J/cm2輻射后的IC50和IC90值。
表2.在HeLa細(xì)胞中，二氫卟酚(7)和脫鎂葉綠酸[(4)、(22)和(25)]衍生物與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)(實(shí)施例34)
實(shí)施例35在抗菌光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定二氫卟酚(7)和脫鎂葉綠酸[(4)、(22)和(25)]衍生物與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽的細(xì)胞毒性使用的微生物是館藏的和臨床的菌株，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC25923)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(ATCC29212)和假絲酵母菌屬種(Candida spp)(臨床的)。
菌落在下面類型的固體介質(zhì)上培養(yǎng)金黃色葡萄球菌在葡萄球菌瓊脂110上培養(yǎng)、糞腸球菌在帶5％馬血的Columbia瓊脂上培養(yǎng)、假絲酵母菌屬種在Saburo葡萄糖瓊脂上培養(yǎng)。
根據(jù)McFarland標(biāo)準(zhǔn)制備等滲NaCl溶液中的最初細(xì)菌懸浮液(IBS)，該懸浮液的數(shù)值為0.5-1.0(在1mL懸浮液中有1.5-5×108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞)，接著按1∶100進(jìn)行稀釋。
為了正確控制細(xì)菌細(xì)胞數(shù)，IBS的一部分用等滲NaCl溶液稀釋1∶1000(直到為最初濃度的10-3)，取出3等分的0.1mL，每個(gè)接種在單獨(dú)的含微生物合適的介質(zhì)的培養(yǎng)皿中。菌落在37℃培育24小時(shí)(對(duì)于金黃色葡萄球菌，培育48小時(shí))，然后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3個(gè)培養(yǎng)皿的平均值用作對(duì)照值。
A).控制溫度和激光輻射行為將2.0mL最初細(xì)菌懸浮液(IBS)在37℃儲(chǔ)存30分鐘，然后用等滲NaCl溶液稀釋1∶1000(直到為最初濃度的10-3)，取出3個(gè)等分試樣，每個(gè)0.1mL，將每個(gè)試樣接種在單獨(dú)的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿含有微生物合適的介質(zhì)。將菌落在37℃培育24小時(shí)，然后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3個(gè)培養(yǎng)皿的平均值用作對(duì)照值。
將IBS(2.0mL)的另一個(gè)樣品在37℃儲(chǔ)存30分鐘，然后在40mm的培養(yǎng)皿(懸浮液層的厚度-2mm)中用輸出功率為3W的“CeralasPDT”激光輻射210秒，以使輸出光能的劑量是50J/cm2?；旌衔镉玫葷BNaCl溶液稀釋至1∶1000(直到為最初濃度的10-3)，取3個(gè)等分試樣，每個(gè)0.1mL，并將它們?cè)趩为?dú)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，按上述方法計(jì)數(shù)。
表3中的數(shù)據(jù)[處理體系B和C表示(7)]表明IBS在37℃下儲(chǔ)存30分鐘，在沒有光敏劑和在劑量為50J/cm2的激光輻射下幾乎沒有影響細(xì)菌的成活力。
B).暗毒性測(cè)定將0.5mL濃度為500μg/mL的光敏劑的儲(chǔ)備溶液加入到2.0mLIBS中，使所得光敏劑的濃度為100μg/mL。將形成的懸浮液在37℃下儲(chǔ)存30分鐘，然后用等滲NaCl溶液稀釋至1∶1000(直到為最初濃度的10-3)，取3個(gè)等分試樣，每個(gè)0.1mL，并將它們?cè)趩为?dú)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，按上述方法計(jì)數(shù)。
表3中的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的光敏劑在濃度為100μg/mL的情況下培育30分鐘幾乎沒有暗毒性作用。
C).光毒性測(cè)定將0.125或0.5mL濃度為500μg/mL的光敏劑的儲(chǔ)備溶液加入到2.0mL IBS中，使所得光敏劑的濃度分別為25和100μg/mL。形成的懸浮液在37℃下儲(chǔ)存30分鐘，然后用強(qiáng)度為50J/cm2的激光進(jìn)行輻射。取3個(gè)等分試樣，每個(gè)0.1mL，并將它們?cè)趩为?dú)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，剩余懸浮液部分用等滲NaCl溶液稀釋至1∶100或1∶1000(直到為最初濃度的10-2或10-3)，取3個(gè)等分試樣，每個(gè)0.1mL，并將它們?cè)趩为?dú)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，按上述方法計(jì)數(shù)。
表3中的數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的水溶性鹽可以作為抗菌光動(dòng)力療法的光敏劑。
表3.二氫卟酚(7)和脫鎂葉綠酸[(4)、(22)和(25)]衍生物與N-甲基-D-葡糖胺(10)的水溶性鹽在抗菌光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用(實(shí)施例35)
*處理體系A(chǔ)，使用的最初細(xì)菌懸浮液(IBS)中對(duì)照組細(xì)菌數(shù)目；B，IBS在37℃恒溫儲(chǔ)存30分鐘后的細(xì)菌數(shù)目；C，用劑量為50J/cm2的激光(Ceralas PDT，3W，210秒)輻射后的細(xì)菌數(shù)目；
D，用光敏劑(濃度100μg/mL)培育30分鐘后的細(xì)菌數(shù)目；E，用濃度為25μg/mL的光敏劑進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)處理后的細(xì)菌數(shù)目；F，用濃度為100μg/mL的光敏劑進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)處理后的細(xì)菌數(shù)目；上述實(shí)施例公開了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但是應(yīng)該理解的是，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施方案，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員在不脫離后附的本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)和精神下，可以作出各種變化和改變。
權(quán)利要求
1.一種制備高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物的方法，該方法包括以下步驟a)生物原料的一步或兩步直接酸性醇解，得到脫鎂葉綠酸烷基酯的晶體；b)將得到的脫鎂葉綠酸烷基酯轉(zhuǎn)化為酸性卟啉；和c)使酸性卟啉與親水性有機(jī)胺在選自水和含水有機(jī)溶液的介質(zhì)中反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物原料選自天然存在的植物、藻類、血液組分、昆蟲分泌物、微生物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中天然存在的植物和藻類包括盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌、最大螺旋藍(lán)細(xì)菌、小球藻、蕁麻和菠菜。
4.權(quán)利要求1的方法，其中直接一步或兩步酸性醇解優(yōu)選為甲醇醇解和乙醇醇解。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的親水性有機(jī)胺選自N-甲基-D-葡糖胺、氨基烷基苷、TRIS和其衍生物、氨基酸和寡肽。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的有機(jī)胺是N-甲基-D-葡糖胺。
7.一種制備高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物的方法，該方法包括使酸性卟啉與親水性有機(jī)胺在選自水和含水有機(jī)溶液的介質(zhì)中反應(yīng)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的親水性有機(jī)胺選自N-甲基-D-葡糖胺、氨基烷基苷、TRIS和其衍生物、氨基酸和寡肽。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述的有機(jī)胺是N-甲基-D-葡糖胺。
10.一種制備高高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物的方法，該方法包括以下步驟a)使生物原料一步或兩步直接酸性醇解，得到脫鎂葉綠酸烷基酯的晶體；b)將得到的脫鎂葉綠酸烷基酯轉(zhuǎn)化為酸性卟啉；c)使酸性卟啉與親水性有機(jī)胺在選自水和含水有機(jī)溶液的介質(zhì)中反應(yīng)；以及d)使用揮發(fā)性溶劑用反相色譜法純化水溶性卟啉衍生物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的生物原料選自天然存在的植物、藻類、血液組分、昆蟲分泌物、微生物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中天然存在的植物和藻類包括盤狀螺旋藍(lán)細(xì)菌、最大螺旋藍(lán)細(xì)菌、小球藻、蕁麻和菠菜。
13.權(quán)利要求10的方法，其中直接一步或兩步酸性醇解優(yōu)選為甲醇醇解和乙醇醇解。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述的親水性有機(jī)胺選自N-甲基-D-葡糖胺、氨基烷基苷、TRIS和其衍生物、氨基酸和寡肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的有機(jī)胺是N-甲基-D-葡糖胺。
16.一種制備高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物的方法，該方法包括a) 使酸性卟啉與親水性有機(jī)胺在選自水和含水有機(jī)溶液的介質(zhì)中反應(yīng)；和b)使用揮發(fā)性溶劑用反相色譜法純化水溶性卟啉衍生物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的親水性有機(jī)胺選自N-甲基-D-葡糖胺、氨基烷基苷、TRIS和其衍生物、氨基酸和寡肽。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的有機(jī)胺是N-甲基-D-葡糖胺。
19.通式1或2的高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物 其中B是具有下面結(jié)構(gòu)的環(huán) 或 或 或 或 其中R1＝-CH＝CH2、-CH(OAlk)CH3、-CHO、-C(O)CH3、-CH2CH3、-CH(Alk)CH(COAlk)2、-CH2CH(COAlk)2、-CH(Alk)CH2COAlk、-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3、-CHO、-CH(OH)Alk、-CH＝CHAlk、CH2OH和CH2OAlk；R3＝-OH、-OAlk、-NH-Alk、NH-X-COO-(HG)+、-NH-Y-NR8R9和-NH-Y-OH；R4＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和NH-X-COO-(HG)+；R5＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；R6＝H和-COOAlk；R7＝-O-(HG)+、-OAlk、-NH-Alk和-NH-X-COO-(HG)+；R8＝H和AlkR9＝H和Alk其中-NH-X-COO-＝有機(jī)氨基酸的殘基；X＝亞烷基、肽、寡肽和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；Y＝亞烷基和-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-30；G＝親水性有機(jī)胺(例如，N-甲基-D-葡糖胺以及其它含氨基的碳水化合物衍生物、TRIS、氨基酸、寡肽)；和Alk＝烷基取代基。
20.權(quán)利要求19的所述高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物在癌癥、其它過度增生性疾病和感染的光動(dòng)力學(xué)治療中的應(yīng)用，包括以下步驟a)將所述衍生物與藥學(xué)上可接受的應(yīng)用賦形劑混合；b)然后將所述賦形劑給予治療區(qū)域；c)使所述卟啉衍生物在治療區(qū)域停留足夠的時(shí)間，優(yōu)選在所述治療區(qū)域積累卟啉衍生物；和d)將治療區(qū)域在合適波長(zhǎng)和足夠能量的光下進(jìn)行輻射，以激活所述卟啉衍生物，從而使其殺死所述患病組織的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用賦形劑是皮膚用乳膏。
22.權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中還包括附加的起始步驟，即將所述衍生物的二鹽在一定量所述親水性胺存在下溶于水，其中所述親水性胺的量不超過2摩爾當(dāng)量，優(yōu)選0.05-0.5當(dāng)量，以使所述衍生物在儲(chǔ)存期間保持其水溶性的穩(wěn)定性。
23.一種穩(wěn)定的水溶液，包括權(quán)利要求19的所述高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物和一定量所述親水性胺，所述親水性胺的量不超過2摩爾當(dāng)量，優(yōu)選0.05-0.5當(dāng)量，以使所述衍生物在儲(chǔ)存期間保持其水溶性的穩(wěn)定性。
24.用于治療癌癥和其它過度增生性疾病的藥物組合物，其中權(quán)利要求19的所述的高純度水溶性卟啉衍生物是活性組分。
25.根據(jù)權(quán)利要求19的，由選自權(quán)利要求1、7、10和16的方法制備的高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物。
26.權(quán)利要求25的所述高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物在癌癥、其它過度增生性疾病和感染的光動(dòng)力學(xué)治療中的應(yīng)用，包括以下步驟a)將所述衍生物與藥學(xué)上可接受的應(yīng)用賦形劑混合；b)然后將所述的水溶性卟啉衍生物給予治療區(qū)域；c)讓所述卟啉衍生物在治療區(qū)域停留足夠的時(shí)間，優(yōu)選在所述治療區(qū)域積累卟啉衍生物；和d)將治療區(qū)域用合適波長(zhǎng)和足夠能量的光進(jìn)行輻射，以激活卟啉衍生物，從而使其殺死所述患病組織的細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用賦形劑是皮膚用乳膏。
28.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中還包括附加的起始步驟，即將所述衍生物的二鹽在一定量所述親水性胺存在下溶于水，其中所述親水性胺的量不超過2摩爾當(dāng)量，優(yōu)選0.05-0.5當(dāng)量，以使所述衍生物在儲(chǔ)存期間保持其水溶性的穩(wěn)定性。
29.用于治療癌癥和其它過度增生性疾病的藥物組合物，其中權(quán)利要求19所述的高純度水溶性卟啉衍生物是活性組分。
全文摘要
通式(1)或(2)的高純度藥物級(jí)水溶性卟啉衍生物，及其新的制備方法和應(yīng)用，這些卟啉衍生物為其中B是具有結(jié)構(gòu)(a)(b)(c)(d)(e)的環(huán)，其中R
文檔編號(hào)A61K31/409GK1512994SQ02811141
公開日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者尼古拉·E·尼凡蒂耶夫, 德米特里·V·亞順?biāo)够? 尼古拉 E 尼凡蒂耶夫, 里 V 亞順?biāo)够?申請(qǐng)人:塞拉莫普泰克工業(yè)公司