四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針在檢測鋅離子方面的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析檢測技術領域，具體涉及到四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針分子通過熒光特性高選擇性地識別檢測鋅離子，并且進一步可以用于細胞中鋅離子濃度變化的檢測。
【背景技術】
[0002]鋅是人體必需微量元素之一，也是生物體中繼鐵之后第二富集的過渡金屬。大量的鋅離子都集中在神經(jīng)組織中，如在腦組織中的濃度是0.1-0.5mM。鋅離子具有神經(jīng)調節(jié)功能，鋅離子能夠能夠從突觸囊中釋放出來通過電位調控型離子通道進入細胞，通過金屬蛋白(鋅指蛋白)來改變染色質的構象或阻斷DNA的合成從而影響基因表達。生物體中大部分的鋅離子都與蛋白質緊密結合，其在金屬蛋白中作為一種輔助因子調控蛋白質或酶的活性。在某些細胞中存在著“游離鋅池”，游離鋅的濃度在各種哺乳細胞內低至納摩爾級。鋅是人體內200多種酶和蛋白質的重要組成成分，也是許多酶的催化劑，廣泛參與生命活動的各個方面。其中最重要的含鋅的酶和蛋白質有DNA聚合酶、RNA聚合酶、蛋白轉錄因子、堿性磷酸酶、味覺蛋白、消化酶等。鋅是這些重要生命大分子的活性結構成分。DNA聚合酶是DNA復制的關鍵物質之一，缺乏鋅元素時DNA聚合酶數(shù)量減少，活性降低，導致DNA復制速度減慢，結果使細胞的分裂速度降低甚至停滯。鋅缺乏還使RNA聚合酶的數(shù)量和質量降低，直接影響基因的表達，從而使上述含鋅蛋白質和酶的合成受到阻礙。所以說鋅直接參與核酸蛋白質的合成、細胞的分化和增殖以及許多代謝，人體內還有一些酶需要鋅的激活，而發(fā)揮其活性作用。迄今為止，人們已經(jīng)認識到鋅在生命過程中起著許多不同的作用。鋅能提高人體的免疫功能，并達到抗衰老的作用；微量鋅可強化記憶力，延緩腦的衰老；鋅可以加速創(chuàng)傷愈合；鋅能保護心肌免遭損害；鋅與利尿劑合用能加強降壓作用，有利于控制高血壓、冠心病的發(fā)生。對生長發(fā)育中的嬰兒、兒童和青少年具有更重要的營養(yǎng)價值。
[0003]對金屬離子的分析測定已經(jīng)存在很多方法，比如原子吸收光譜法，電化學、分光光度法、化學發(fā)光法、催化動力學方法等，但是這些方法不能夠對生物體內離子進行實時檢測，且這些方法測定時樣品的預處理比較復雜，使得其應用受到了一定的限制。由于熒光探針法具有靈敏度高、選擇性好、反應時間快、能夠進行實時區(qū)域離子測試而受到普遍的重視。理想的鋅離子熒光分子探針應具有化學、光穩(wěn)定性高，激發(fā)波長在可見光區(qū)(> 400nm)、對鋅離子熒光有選擇性和敏感性、快速響應、水溶性、對細胞毒性小等特點。
[0004]卟啉是生物體內的一種具有大共軛環(huán)狀結構的金屬有機化合物。卟啉及其衍生化合物廣泛存在于生物體內和量轉移相關的重要細胞器內。卟啉在生物體內具有重要的生理功能，如血紅素是含鐵卟啉的化合物，葉綠素是含鎂的卟啉化合物，維生素B12是含鈷的卟啉化合物。早期的卟啉是從含有卟啉化合物的天然產物中通過提取、分離、純化等方法得到的，如血紅素、葉綠素等。目前有兩種途徑得到目標卟啉分子:天然卟啉的結構修飾和卟啉化合物的全合成。天然卟啉的結構修飾雖然能很方便地進行結構的改造，但是受到結構本身的限制，同時外環(huán)官能基團的選擇上也十分有限，此外，也限制了卟啉化合物的本身生理活性。因此，通常人們需要通過全合成的辦法，來獲得具有特定生理活性和功能的卟啉分子。通過合成設計，獲取不同種類和功能的卟啉化合物推進了卟啉化學的發(fā)展，擴寬了其應用前景。卟啉化合物在高分子材料、化學催化、電致發(fā)光材料等不同領域的各個方面得到很大應用。本發(fā)明充分利用卟啉與金屬離子的配合作用，結合鋅離子檢測對熒光探針的要求，對卟啉衍生物分子的結構進行改良，使其具有良好的水溶性、熒光穩(wěn)定性，從而成功用于鋅離子檢測。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術問題是:
為改進現(xiàn)有鋅離子檢測方法的不足，提供一種四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針分子通過熒光特性高選擇性地應用于檢測鋅離子，對鋅離子進行快速簡便的檢測；解決了現(xiàn)有技術中無法對生物體內離子進行實時檢測、測定樣品的預處理比較復雜等不足。
[0006]為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:
提供一種四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針在檢測鋅離子方面的應用，其中，四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為檢測鋅離子的熒光探針激發(fā)光的有效光波長為405、430、515、550、580nm。上述激發(fā)光的作用下，可以得到發(fā)射光譜峰在640nm的近紅外光，該發(fā)射光譜峰不隨激發(fā)光的改變而改變。
[0007]此外，四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為檢測鋅離子的熒光探針對鋅離子的最低檢測限為0.8μΜ，且可以通過共聚焦熒光顯微鏡測得的熒光強度對細胞中的鋅離子濃度變化進行檢測。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下:四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為檢測鋅離子的熒光探針與鋅離子的結合絡合能力高，絡合后熒光明顯增強。細胞毒性實驗結果表明該探針對細胞幾乎沒有毒性，生物相容性和細胞滲透性好，可以通過細胞熒光共聚焦成像對細胞內鋅離子的濃度變化進行檢測。本發(fā)明的方法應用簡便易行、快速，直觀，毒性低、靈敏度高、方法簡單，為金屬離子的檢測提供了高效可行的方法。
【附圖說明】
[0009]圖1為四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物的分子結構示意圖。
[0010]圖2為四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物本身的激發(fā)光譜(圖2Α)和發(fā)射光譜(圖2Β)。圖2Α橫坐標是激發(fā)波長，縱坐標是激發(fā)光譜的熒光強度，從激發(fā)光譜中看到激發(fā)峰有五個分別在405，430，515，550，580nm。圖2B橫坐標是發(fā)射波長，縱坐標是發(fā)射光譜的熒光強度，曲線a，b，c，d，e分別是使用405，430，515，550，580nm激發(fā)光激發(fā)所得到的對應發(fā)射光譜。
[0011 ]圖3是本發(fā)明的四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物熒光探針分子與各種金屬離子作用后的熒光光譜圖(激發(fā)波長515nm)，曲線a是卟啉衍生物分子本身的熒光光譜，曲線b是加入鋅離子后的熒光光譜，鈉、鉀、鈣金屬離子加入后熒光光譜沒有任何變化與曲線a幾乎重合，曲線c是加入鎂離子后的熒光光譜，曲線d，e是分別加入銅、鐵離子后的光譜。光譜結果明顯表明，只有鋅離子明顯增強卟啉衍生物熒光表現(xiàn)出良好的選擇性識別。干擾金屬離子鈉、鉀、鈣、鎂、銅和鐵對檢測沒有影響。
[0012]圖4是本發(fā)明的四-對-磺酸基-苯基卟啉衍生物熒光探針分子的熒光強度和鋅離子濃度的關系。橫坐標為波長(納米)，縱坐標為熒光強度。箭頭表示鋅離子的濃度變化從低到高依次為 0、0.8,2.5,7.5、15、40、80、93、123、135μΜ。
[0013]圖5是本發(fā)明的卟啉衍生物熒光探針分子對細胞的毒性。橫坐標是加入的卟啉的濃度，縱坐標是細胞存活率。
[0014]圖6是本發(fā)明的卟啉衍生物熒光探針分子用于細胞內鋅離子檢測。圖6a是明場下的Hela細胞；圖6b是在加入熒光探針分子和鋅離子后的細胞內熒光成像圖，細胞呈現(xiàn)出很強的紅色熒光。
【具體實施方式】
[0015]下面將結合說明書附圖，對本發(fā)明作進一步的說明。
[0016]實施例1:四-對-磺酸基-苯基卟啉熒光探針分子本身的熒光特性
首先，考察卟啉衍生物熒光探針四-對-磺酸基-苯基卟啉本身的熒光特性。將固體四-對-磺酸基-苯基卟啉化合物溶于超純水或者磷酸緩沖溶液(pH 7.2，0.02mM)配制成濃度為1.0mM的母液。取一定量的母液用相應的溶劑如超純水或者磷酸緩沖溶液稀釋到實驗所用的濃度6.25μΜο稀釋后的四-對-磺酸基-苯基卟啉化合物溶液加到干凈的4mL石英比色皿中，使用島津型號為RF-5301 PC的熒光儀進行測定，實驗結果如圖2A激發(fā)光譜圖所示，激發(fā)光波長具有五個激發(fā)峰，分別在405，430，515，550，580nm處。用得到的五個激發(fā)峰波長分別去激發(fā)得到如圖2B所示發(fā)射光譜圖，當激發(fā)光波長分別為405，430，515，550，580nm，探測樣品發(fā)射出的熒光波長發(fā)現(xiàn)，五個激發(fā)光所得到的發(fā)射光波