快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.5所示，下游引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.6所示。本發(fā)明還公開(kāi)了一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常規(guī)PCR檢測(cè)的常規(guī)試劑。本發(fā)明提供的引物、試劑盒可以用于鑒定番茄褪綠病毒，以及檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有番茄褪綠病毒。采用本發(fā)明的特異引物或試劑盒檢測(cè)ToCV，操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高，非常適合應(yīng)用在口岸現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，對(duì)于早期檢測(cè)診斷、田間疫情調(diào)查及進(jìn)出口岸檢測(cè)具有重要作用。
【專利說(shuō)明】快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程中病毒檢測(cè)技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域，尤其涉及快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的特異引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]番爺褪綠病毒(Tomato Chlorosis Virus, ToCV)為長(zhǎng)線形病毒科下的毛型病毒屬成員，主要侵染番茄和辣椒，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成嚴(yán)重危害。該病毒于1998年在佛羅里達(dá)州首次報(bào)道，然后在法國(guó)、意大利、巴西、以色列等世界各地相繼發(fā)現(xiàn)，可侵染番茄等重要農(nóng)作物，在番茄上產(chǎn)生的典型癥狀為葉片脈間發(fā)病初期變黃，后期葉片發(fā)紅，葉脈顏色加深，葉片增厚，極大降低了番茄產(chǎn)量與品質(zhì)。番茄褪綠病毒可通過(guò)多種方式傳播，包括種苗調(diào)運(yùn)、粉虱帶毒等。
[0003]目前，ToCV在中國(guó)僅有兩份報(bào)道，分別為山東和北京，且在山東多個(gè)番茄產(chǎn)區(qū)都已檢測(cè)到，并造成番茄減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。因此，如何快速、有效、準(zhǔn)確地對(duì)番茄褪綠病毒進(jìn)行檢測(cè)是亟需解決的問(wèn)題。
[0004]PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在病原體檢測(cè)、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用，并且是分子生物學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法和手段。PCR技術(shù)為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)番茄褪綠病毒提供技術(shù)支持，對(duì)快速檢測(cè)番茄褪綠病毒具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā) 明提供了一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物，以及試劑盒、檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物的喊基序列如SEQ ID N0.5所不，下游引物的喊基序列如SEQ ID N0.6所不。
[0008]一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常規(guī)PCR檢測(cè)的常規(guī)試劑，比如=IOXPCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、反轉(zhuǎn)錄常規(guī)試劑和電泳常規(guī)試劑。
[0009]上述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物、快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒可以用于鑒定番茄褪綠病毒，具體應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)方法如下:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物(SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳并檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有1074bp的條帶，則待測(cè)病毒為候選的番茄褪綠病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有得到1074bp的條帶，則待測(cè)病毒為候選的非番茄褪綠病毒。
[0010]上述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物、快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒可以用于檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有番茄褪綠病毒，具體應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)方法如下:以待測(cè)樣品中的待測(cè)病毒的CDNA為模板，用所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物(SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳并檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有1074bp的條帶，則待測(cè)樣品中含有番茄褪綠病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有得到1074bp的條帶，則待測(cè)樣品中不含有番茄褪綠病毒。
[0011]所述待測(cè)病毒為番茄褪綠病毒。所述待測(cè)樣品可為植物樣本。所述植物具體可為被番茄褪綠病毒感染的植物(如番茄)。
[0012]所述PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系由 18 μ LddH20,2.5 μ L 10XPCR buffer、1.0yL10mmol/L dNTP.0.5μ L lOmmol/L SEQ ID N0.5 所示的 DNA、0.5 μ L lOmmol/L SEQ ID N0.6所示的DNA、2.0yL模板和0.5 μ L 5U/μ L Taq DNA polymerase組成；所述PCR的反應(yīng)條件為:94°C 3min ；94°C 30, 58°C 30s, 72°C 70s，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 10XPCR buffer 具體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0013]本發(fā)明提供的檢測(cè)引物、試劑盒，具有快速高效、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于早期檢測(cè)診斷、田間疫情調(diào)查及進(jìn)出口岸檢測(cè)具有很強(qiáng)適用和應(yīng)用性。
[0014]采用本發(fā)明的特異引物或試劑盒檢測(cè)ToCV，操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高，非常適合應(yīng)用在口岸現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本發(fā)明的特異引物或試劑盒可用于ToCV 口岸檢測(cè)和田間疫情調(diào)查，特別適合農(nóng)業(yè)部門的各檢疫檢查站、各口岸檢驗(yàn)檢疫局、植物病毒研究機(jī)構(gòu)等應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為特異性篩選結(jié)果，M為Trans 2K Plus DNA Maker, 1-5分別為設(shè)計(jì)的ToCV的5對(duì)特異引物對(duì)，6-10依次為5對(duì)引物的陰性對(duì)照。
[0016]圖2為反應(yīng)體系中引物對(duì)加入量的優(yōu)化結(jié)果，M為Trans 2K PlusDNA Maker, 1-4分別為引物的不同加入量:0.5 μ L、0.8 μ L、l.0 μ L、l.5 μ L，5-8依次為不同引物加入量的陰性對(duì)照。
[0017]圖3為退火溫度的優(yōu)化結(jié)果，M為Trans 2K Plus DNA Maker, 1-4分別為不同的退火溫度:48°C，53.6°C，56°C，58°C，5-8依次為不同退火溫度的陰性對(duì)照。
[0018]圖4為特異性檢測(cè)結(jié)果，M為Trans 2K Plus DNA Maker, 1-5為田間ToCV感病樣品，6為黃瓜花葉病毒(CMV)，7為煙草花葉病毒(TMV)，8為馬鈴薯Y病毒(PVY)，9為番茄花葉病毒(ToMV)，10為陰性對(duì)照。
[0019]圖5 為靈敏性檢測(cè)結(jié)果，M為 Trans 2K Plus DNA Maker，1-7 依次為 KT1，10-2，10-3，1θΛ I O—5，I O—6，10_7倍濃度的RNA，8為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0021]以下的實(shí)施例便于更好的理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下屬實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022]PCR 儀為 TaKaRa PCR 擴(kuò)增儀。ReverseTranscription 購(gòu)自寶生物。EasyTaq 酶、10 X PCRbuffer、dNTPs和DNA Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0023]番爺裡綠病毒(TomatoChlorosis Virus, ToCV):RNA 病毒；參考文獻(xiàn):CompIetesequence of the RNAl of a European isolate of tomato chlorosis virus.Archivesof Virology(2007)152:839-841.[0024]實(shí)施例1特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)
[0025]根據(jù)NCBI上的番茄褪綠病毒的核酸序列設(shè)計(jì)了五對(duì)引物，引物序列如下:
[0026]第一對(duì)引物:
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物，其特征在于:該引物包括上游引物和下游引物，上游引物的堿基序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID N0.6所示。
2.一種快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括SEQ ID N0.5所示的上游引物和SEQ ID N0.6所示的下游引物，以及PCR檢測(cè)的常規(guī)試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒，其特征在于:所述PCR檢測(cè)的常規(guī)試劑包括:10XPCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、反轉(zhuǎn)錄常規(guī)試劑和電泳常規(guī)試劑。
4.權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物、權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒在鑒定番茄褪綠病毒中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)方法如下:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳并檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有1074bp的條帶，則待測(cè)病毒為候選的番茄褪綠病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有得到1074bp的條帶，則待測(cè)病毒為候選的非番茄褪綠病毒。
6.權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的引物、權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)番茄褪綠病毒的試劑盒在檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有番茄褪綠病毒中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)方法如下:以待測(cè)樣品中的待測(cè)病毒的cDNA為模板，用SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳并檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有1074bp的條帶，則待測(cè)樣品中含有番茄褪綠病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有得到1074bp的條帶，則待測(cè)樣品中不含有番爺褪綠病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由18μ LddH20、2.5μ L 10XPCR bufferU.0μ L IOmmoI/L dNTP,0.5μ L IOmmoI/L SEQ IDN0.5 所示的 DNA、0.5 μ L I Ommo I/LSEQ ID N0.6 所示的 DNA、2.0yL 模板和 0.5 μ L 5U/μ LTaq DNA polymerase 組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:940C 3min ；94°C 30, 58°C 30s, 72°C 70s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103498010SQ201310474211
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】竺曉平, 趙黎明, 李剛 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)