一種快速檢測美國白蛾的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，至少包括1次用量以上的特異性引物COI01/02或SpmR01/02試劑；所述的特異性引物COI01/02與SpmR01/02序列如下：COI01序列：5'-CAGGAACTGGATGAACA-3'，COI02序列：5'-CCTACTGCTCATACGAA-3'，SpmR01序列：5'-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3'，SpmR02序列：5'-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3'。本發(fā)明的試劑盒是一種高效、準(zhǔn)確、便捷的美國白蛾分子檢測技術(shù)，可在分子水平將美國白蛾與燈蛾科其他種類進(jìn)行區(qū)分，能滿足使用需求，具有很好的實(shí)用性，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效應(yīng)。
【專利說明】一種快速檢測美國白蛾的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于美國白蛾檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測美國白蛾的試劑盒?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]美國白蛾[Hyphantria cunea (Drury)]又名秋幕毛蟲、秋幕蛾，屬鱗翅目(Lepidortera)JT蛾科(Arctiidae)、燈蛾亞科(Arctiinae),是世界著名的檢疫性有害生物。原產(chǎn)于北美洲，分布于美國、加拿大、墨西哥等地區(qū)，1940年傳入歐洲，1945年傳入日本，1958年傳入韓國，1979年傳入我國遼寧丹東。目前，國內(nèi)公布的疫區(qū)有北京、天津、河北、山東、遼寧、陜西、江蘇等省市。國務(wù)院辦公廳曾多次下發(fā)文件，要求大力加強(qiáng)美國白蛾查防治理工作。2007年美國白蛾被納入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。
[0003]在美國，美國白蛾有2個種，分別是黑頭種和紅頭種，而我國主要分布的是黑頭型。由于該蟲繁殖力強(qiáng)大，傳播途徑廣泛，寄主種類繁多，食性龐雜，食量巨大，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，危害程度嚴(yán)重，是我國農(nóng)、林、果、蔬業(yè)的重要害蟲。據(jù)趙鐵珍等人于2004年研究評估全國美國白蛾疫區(qū)的非經(jīng)濟(jì)損失(環(huán)境功能損失、景觀美學(xué)損失、生產(chǎn)生活損失、心理影響損失、生態(tài)系內(nèi)部失衡損失、區(qū)域聲譽(yù)損失)合計(jì)為140.35億元。所以說，準(zhǔn)確的種類鑒定是防止美國白蛾侵入非疫區(qū)，保護(hù)非疫區(qū)生態(tài)環(huán)境的重要手段。
[0004]美國白蛾成幼蟲與燈蛾科其他種類在形態(tài)上極難區(qū)分，尤其是口岸檢疫時截獲美國白蛾的卵或不完整的蟲體，利用傳統(tǒng)的形態(tài)分類更難做出快速準(zhǔn)確的鑒定。因此需要開發(fā)出精準(zhǔn)的美國白蛾檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，使其具有準(zhǔn)確穩(wěn)定、`操作方便、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，滿足使用需求。
[0006]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，至少包括I次用量以上的特異性引物C0101 /02或SpmRO 1/02試劑；所述的特異性引物C0101 /02與SpmR01/02序列如下:
C0101 序列:5’ -CAGGAACTGGATGAACA-3’，
C0102 序列:5’ -CCTACTGCTCATACGAA-3’，
SpmROl 序列:5’ -ACGCTGTTGTCCGTATTT-3’，
SpmR02 序列:5’ -CTGATTTCTTCGGTGTTG-3’。
[0007]所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒，由I次用量以上的下列試劑組成:
Taq buffer, MgCl2, dNTP mix, Taq DNA 聚合酶，特異性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02，ddH20。
[0008]所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
DDNA的制備:采用GenMagBio動物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒提取待檢測樣品和美國白蛾標(biāo)準(zhǔn)對照樣的DNA ；2)PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
50μ? 反應(yīng)體系組成:5μ? IOXTaq buffer,2 mmol/L MgCl2,200 Mmol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3μ? DNA 模板、特異性引物 COIOl /02 和 / 或 SpmRO 1/02 各 I Mmol/L，ddH20補(bǔ)齊；
反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2 min;94°C變性I min、52°C復(fù)性30 s，72°C延伸30 S，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸5 min ;4°C保存；
3)PCR結(jié)果判定
混合 8 PLPCR 產(chǎn)物與 2 μ? 6XGlycerol DNA loading Buffer 上樣，以 DNA MarkerDLlOO為分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3 %瓊脂糖凝膠電泳45 min, 0.5% Mmol/L的EB染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測樣品，拍照；照片顯示美國白蛾標(biāo)準(zhǔn)對照樣有清晰的擴(kuò)增條帶，待檢測樣品也具有相同條帶即為美國白蛾，否則不是美國白蛾。
[0009]步驟I)中，DNA提取的具體過程如下:
直接剪取供試標(biāo)本足和胸部30mg放入2mL試管，無水乙醇浸泡保存標(biāo)本用無菌蒸餾水沖洗浸泡4飛次，棄水；干標(biāo)本無菌蒸餾水浸泡3h后吸干水分。置于2mL離心管，MM400球磨儀中震蕩碾磨(30 次/s) 30s,加入 180 μ L Lysis Buffer>20 μ L Proteinase K,震蕩混勻，常溫過夜，55°C震蕩溫浴3-5h，12000rpm離心IOmin,取上清，加入200 μ L BindingBuffer和200 μ L無水乙醇，充分混勻，加入20 μ L磁珠，輕柔顛倒混勻lOmin。離心管置于磁力架，吸棄管內(nèi)液體，保留磁珠，Wash Buffer 500uL顛倒混勻2min置于磁力架,棄去管內(nèi)液體，Wash Buffer II同樣洗漆兩次,離心管仍置于磁力架上,緩慢加入Wash BufferIII, Imin后移走管內(nèi)液體。加入20yL Elution Buffer, 55°C水浴IOmin洗脫磁珠上吸附的DNA，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0010]本發(fā)明的快速檢測 美國白蛾的方法，普通PCR檢測方法以昆蟲線粒DNA基因和其它已公布的基因片段為模板，設(shè)計(jì)并篩選出靈敏度高，特異性強(qiáng)的美國白蛾特異PCR擴(kuò)增引物。開發(fā)出高效、準(zhǔn)確、便捷的美國白蛾分子檢測技術(shù)。該技術(shù)可在分子水平將美國白蛾與燈蛾科其他種類進(jìn)行區(qū)分。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的快速檢測美國白蛾的試劑盒，具有準(zhǔn)確穩(wěn)定、操作方便、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能滿足使用需求，具有很好的實(shí)用性，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效應(yīng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是特異引物C0101 /02對樣本1-16的擴(kuò)增效果；
圖2是特異引物SpmRO 1/02對樣本1_16的擴(kuò)增效果。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0014]實(shí)施例1
快速檢測美國白蛾的方法的試劑盒，至少包括I次用量以上的特異性引物C0101 /02或SpmR01/02試劑。在使用時，可以另外補(bǔ)充購買:Taq buffer, MgCl2, dNTP mix, Taq DNA聚合酶，ddH20,—起配合使用即可。其中，ddH20可以自己制備。[0015]同時，該快速檢測美國白蛾的方法的試劑盒，可以直接配齊所有溶液，具體由I次用量以上的下列試劑組成:10XTaq buffer, 2 mmol/L MgCl2, 200 Mmol/L dNTP mix, TaqDNA 聚合酶，特異性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02, ddH20。
[0016]其中，特異性引物C0101 /02與SpmR01/02序列如下:
C0101 序列:5’ -CAGGAACTGGATGAACA-3’，
C0102 序列:5’ -CCTACTGCTCATACGAA-3’，
SpmROl 序列:5’ -ACGCTGTTGTCCGTATTT-3’，
SpmR02 序列:5’ -CTGATTTCTTCGGTGTTG-3’。
[0017]在選取溶液濃度時，根據(jù)需要進(jìn)行配備即可，在用量配備上，優(yōu)選10次以上用量。
[0018]該特異性引物C0101 /02與SpmR01/02，以美國白蛾基因片段為模板，綜合考慮引物的長度、GC含量、目標(biāo)基因大小和Tm值進(jìn)行設(shè)計(jì)的，這2對引物不受供試?yán)ハx蟲態(tài)限制，可準(zhǔn)確鑒定美國白蛾的成幼蟲、蛹、卵及殘?bào)w。
[0019]使用該試劑盒對待測樣品直接進(jìn)行檢測，具體如下:
以包括美國白蛾在內(nèi)的16種燈蛾科昆蟲作為供試標(biāo)本，這16種燈蛾科昆蟲成幼蟲在外部形態(tài)上都與美國白蛾難以區(qū)分。供試標(biāo)本詳見表I。
[0020]表I供試標(biāo)本
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，其特征在于，至少包括I次用量以上的特異性引物COIOl /02或SpmRO 1/02試劑；所述的特異性引物C0101 /02與SpmRO 1/02序列如下:
C0101 序列:5’ -CAGGAACTGGATGAACA-3’，
C0102 序列:5’ -CCTACTGCTCATACGAA-3’，
SpmROl 序列:5’ -ACGCTGTTGTCCGTATTT-3’，
SpmR02 序列:5’ -CTGATTTCTTCGGTGTTG-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒，其特征在于，由I次用量以上的下列試劑組成:
Taq buffer, MgCl2, dNTP mix, Taq DNA 聚合酶，特異性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02，ddH20。
3.權(quán)利要求1所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: DDNA的制備:采用GenMagBio動物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒提取待檢測樣品和美國白蛾標(biāo)準(zhǔn)對照樣的DNA ； 2)PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 50μ? 反應(yīng)體系組成:5μ? IOXTaq buffer,2 mmol/L MgCl2,200 MmoI/L dNTP mix、2UTaq DNA 聚合酶、3μ? DNA 模板、特異性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02 各 I Mmol/L, ddH20 補(bǔ)齊； 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2 min;94°C變性I min、52°C復(fù)性30 s，72°C延伸30 S，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸5 min ;4°C保存； 3)PCR結(jié)果判定 混合 8 PLPCR 產(chǎn)物與 2 μ? 6XGlycerol DNA loading Buffer 上樣，以 DNA MarkerDLlOO為分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3 %瓊脂糖凝膠電泳45 min, 0.5% Mmol/L的EB染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測樣品，拍照；照片顯示美國白蛾標(biāo)準(zhǔn)對照樣有清晰的擴(kuò)增條帶，待檢測樣品也具有相同條帶即為美國白蛾，否則不是美國白蛾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟I)中，DNA提取的具體過程如下: 直接剪取供試標(biāo)本足和胸部30mg放入2mL試管，無水乙醇浸泡保存標(biāo)本用無菌蒸餾水沖洗浸泡4飛次，棄水；干標(biāo)本無菌蒸餾水浸泡3h后吸干水分；置于2mL離心管，MM400球磨儀中震蕩碾磨(30 次/s) 30s,加入 180 μ L Lysis Buffer>20 μ L Proteinase K,震蕩混勻，常溫過夜，55°C震蕩溫浴3-5h，12000rpm離心IOmin,取上清，加入200 μ L BindingBuffer和200 μ L無水乙醇，充分混勻，加入20 μ L磁珠，輕柔顛倒混勻IOmin ;離心管置于磁力架，吸棄管內(nèi)液體，保留磁珠，Wash Buffer 500uL顛倒混勻2min置于磁力架,棄去管內(nèi)液體，Wash Buffer II同樣洗漆兩次,離心管仍置于磁力架上,緩慢加入Wash BufferIII, Imin后移走管內(nèi)液體；加入20 μ L Elution Buffer, 55?水浴IOmin洗脫磁珠上吸附的DNA，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12Q1/68GK103451281SQ201310361163
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】詹國輝, 陳景云, 鄭斯竹, 高淵, 陳云芳, 鄧海娟, 趙毓郎, 葛華林 申請人:蘇州市外來有害生物防控技術(shù)中心