一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應用，屬于食品安全【技術領域】。由LAMP（環(huán)介導等溫擴增）擴增反應體系，Bst?DNA聚合酶，探針和膠體金試紙條組成。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的LAMP檢測方法的結果判讀不能實現(xiàn)現(xiàn)場檢測的問題，試紙條的結果判讀方法簡單不需要儀器，肉眼判讀即可。
【專利說明】一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應用，屬于食品安全【技術領域】。
【背景技術】
[0002]阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種革蘭氏陰性、無芽孢的兼性厭氧細菌。它能導致任何年齡層人群的疾病，尤其是對早產(chǎn)兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，能引起新生兒敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結腸炎。因此，阪崎腸桿菌是許多國家食品中微生物的必檢指標之一。然而，傳統(tǒng)的檢測方法操作復雜、耗時長以及需要復雜昂貴的儀器。環(huán)介導等溫擴增技術由Notomi等于2000年建立，該技術針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下(60-65°C )高效(0.5-1.0h)擴增目標DNA，具有很高的特異性和靈敏度。然而，傳統(tǒng)的電泳檢測方法費時費力、染料和濁度檢測方法易受肉眼觀察誤差，均不適宜現(xiàn)場檢測。本方法所采用的試紙條技術快速靈敏且結果判讀容易，適用于現(xiàn)場檢測。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明提供了一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒。
[0004]所述試劑盒組成如下:所述試劑盒由LAMP擴增反應體系，Bst DNA聚合酶，探針和膠體金試紙條組成；所述探針帶有抗原物質用于標記LAMP擴增產(chǎn)物；所述試紙條上設有檢測線和控制線，檢測線上埋有抗體，與抗原物質標記的LAMP擴增產(chǎn)物結合顯色；所述LAMP擴增反應體系由LAMP引物組和擴增反應液組成；所述擴增反應液含有0.4~2.4mmol/LdNTP、甜菜堿和2mmol/L~6mmol/L MgCl2, Bst DNA聚合酶相對于50 μ L的PCR反應體系添加范圍為4U~8U。
[0005]本發(fā)明中采用生物素及其抗體作為顯色反應的成分，根據(jù)本發(fā)明原理，采用其他抗原或抗體均可達到本發(fā)明的技術效果。
[0006]所述LAMP引物組從以下四組中任選其一:1) SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6 ；2) SEQID N0.7-SEQ ID N0.12 ；3)SEQ ID N0.13-SEQ ID N0.18 ；4)SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.24。
[0007]LAMP引物組中外引物、內引物、環(huán)引物比例關系可以經(jīng)過有限次實驗確定，實驗發(fā)現(xiàn)外引物與內引物比例為1:4~1:9，外引物與環(huán)引物比例為1:1~1:5時擴增效果較好。
[0008]所述探針上攜帶抗原，其核苷酸序列如SEQ ID N0.25 一 SEQ ID N0.28所示，根據(jù)LAMP引物組核苷酸序列，根據(jù)擴增得到的LAMP產(chǎn)物，可以設計出多種探針。
[0009]PCR擴增反應液含有dNTP、甜菜堿和MgCl2，其作用為輔助LAMP引物組PCR擴增阪崎腸桿菌DNA特異性序列，所述dNTP濃度優(yōu)選0.4~2.4mmol/L, MgCl2優(yōu)選2mmol/L~Bmmol /I, η
[0010]所述Bst DNA聚合酶相對于50 μ LPCR反應體系添加范圍為4U~8U。
[0011]本發(fā)明還提供了一種應用上述試劑盒快速檢測乳中阪崎腸桿菌的方法。[0012]為解決上述技術問題，提供技術方案如下:提取受檢乳的DNA，以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產(chǎn)物，用試紙條鑒定擴增產(chǎn)物。
[0013]所述試劑盒應用的具體步驟為:
[0014]第一步:受檢乳樣的DNA提??；向受檢乳中加入DNA提取液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶孵育；再向其中加入SDS后加入等體積的氯仿離心后取上清；在取得的上清中加入預冷的異丙醇顛倒混勻；將其轉移到吸附柱AC中離心后加入漂洗液漂洗；加入洗脫緩沖液孵育后離心；將得到的溶液重新加入離心吸附柱中離心后得到的液體即為乳中DNA。
[0015]第二步:以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產(chǎn)物，LAMP擴增條件為:90°C~99°C PCR反應5~lOmin，迅速置于O~4°C加入Bst酶，60~65°C酶促反應40~90min，升溫至80~100°C使酶鈍化2~lOmin。
[0016]第三步:擴增產(chǎn)物的試紙條鑒定；將探針與擴增產(chǎn)物雜交，在60~65 V雜交2-10分鐘然后將雜交產(chǎn)物與緩沖液孵育，最后將試紙條放入，觀察試紙條檢測線是否有條帶進行結果判讀。
[0017]本實施方法對儀器設備要求簡單，只需水浴條件即可完成，耗時較短，約2小時即可完成，檢測靈敏度高。本發(fā)明制備的膠體金試紙條技術能夠簡化電泳方法的復雜儀器且大大縮短了反應時間。相較于濁度法和染料法，則沒有肉眼觀測的誤差。更適宜現(xiàn)場檢測。本發(fā)明為乳中阪崎腸桿菌的現(xiàn)場檢測開辟了新思路。用此方法在阪崎腸桿菌樣品不合格產(chǎn)品中同樣檢出阪崎腸桿菌。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為【具體實施方式】實例4步驟2檢測結果電泳圖；
`[0019](1，對照；2，實施例1 ;3，實施例2 ;4，實施例3 ;5，實施例4)。
[0020]圖2為【具體實施方式】實例4步驟2試紙條檢測結果；(1，對照；2，實施例1 ;3，實施例2 ;4，實施例3 ;5，實施例4)。
[0021]圖3為【具體實施方式】實例2靈敏度測試實驗中LAMP擴增的電泳圖；(1，marker ；2，去離子水；3，阪崎腸桿菌濃度109cfu/mL ;4，阪崎腸桿菌濃度108cfu/mL ;5，阪崎腸桿菌濃度107cfu/mL ;6，阪崎腸桿菌濃度106cfu/mL ;7，阪崎腸桿菌濃度105cfu/mL ;8，阪崎腸桿菌濃度104cfu/mL ;9，阪崎腸桿菌濃度103cfu/mL ;10，阪崎腸桿菌濃度102cfu/mL ;11，阪崎腸桿菌濃度lOkfu/mL ;12，阪崎腸桿菌濃度10°cfu/mL ;13，阪崎腸桿菌濃度lO'fu/mL ；)。
[0022]圖4為【具體實施方式】實例4靈敏度測試實驗中LAMP擴增的試紙條檢測結果；(1，去離子水；2，阪崎腸桿菌濃度109cfu/mL ;3，阪崎腸桿菌濃度108cfu/mL ;4，阪崎腸桿菌濃度107cfu/mL ；5,阪崎腸桿菌濃度106cfu/mL ；6,阪崎腸桿菌濃度105cfu/mL ；7,阪崎腸桿菌濃度104cfu/mL ;8，阪崎腸桿菌濃度103cfu/mL ;9，阪崎腸桿菌濃度102cfu/mL ;10，阪崎腸桿菌濃度lOkfu/mL ;11，阪崎腸桿菌濃度10°cfu/mL ;12，阪崎腸桿菌濃度lO'fu/mL ；)。
【具體實施方式】
[0023]實施例1
[0024]1.受檢乳樣的DNA提取:向ImL受檢乳中加入ImLDNA提取液(0.lmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸 Tris-HCl，0.lmol/L 乙二胺四乙酸 EDTA，0.lmol/L 磷酸鈉 Na3PO4,1.5mol/L氯化鈉NaCl，P/oCTAB十六烷基三甲基溴化銨，ρΗ8.0)、10 μ L蛋白酶K、10 μ L溶菌酶、10 μ L溶壁酶于37°C中以200r/min的轉速孵育1.5小時；再向其中加入200 μ L的20%SDS后于65°C孵育I小時；加入等體積的氯仿13000r/min離心I分鐘后取上清；在取得的上清中加Λ 0.6倍體積預冷的異丙醇顛倒混勻；將其轉移到吸附柱AC中10000r/min離心30秒后加Λ 700 μ L漂洗液；10000r/min離心2分鐘后倒掉液體，再加入500 μ L漂洗液再離心盡量除去漂洗液；加入50 μ L洗脫緩沖液(65°C -70°C水浴)放置2分鐘，室溫12000r/min離心2分鐘；將得到的溶液重新加入離心吸附柱中12000r/min離心。
[0025]2.以提取物作為模板進行LAMP擴±曾，反應體系為50 μ L反應體系:
[0026]
【權利要求】
1.一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由LAMP擴增反應體系，Bst DNA聚合酶，探針和膠體金試紙條組成；所述探針帶有抗原物質用于標記LAMP擴增產(chǎn)物；所述試紙條上設有檢測線和控制線，檢測線上埋有抗體，與抗原物質標記的LAMP擴增產(chǎn)物結合顯色；所述LAMP擴增反應體系由LAMP引物組和擴增反應液組成；所述擴增反應液含有 0.4 ~2.4mmol/L dNTP、甜菜喊和 2mmo1 /I,~Bmmol /T, MgCl2, Bst DNA 聚合酶相對于50 μ L的PCR反應體系添加范圍為4U~8U。
2.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，LAMP引物組從以下四組中任選其一:1)SEQID N0.1-SEQ ID N0.6 ；2) SEQ ID N0.7-SEQ ID N0.12 ；3) SEQ ID N0.13-SEQ ID N0.18 ；4) SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.24。
3.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQID N0.1-SEQ IDN0.6，所述探針核苷酸序列為SEQ ID N0.25。
4.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQID N0.7-SEQ IDN0.12，所述探針核苷酸序列為SEQ ID N0.26。
5.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQID N0.13-SEQ IDN0.18，所述探針核苷酸序列為SEQ ID N0.27。
6.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQID N0.19-SEQ IDN0.24，所述探針核苷酸序列為SEQ ID N0.28。
7.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，PCR擴增反應體系組成如下:
8.權利要求1所述試劑盒在乳中阪崎腸桿菌檢測中的應用。
9.如權利要求8所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)受檢乳樣的DNA提??；向受檢乳中加入DNA提取液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶孵育；再向其中加入SDS后加入等體積的氯仿離心后取上清；在取得的上清中加入預冷的異丙醇顛倒混勻；將其轉移到吸附柱AC中離心后加入漂洗液漂洗；加入洗脫緩沖液孵育后離心；將得到的溶液重新加入離心吸附柱中離心后得到的液體即為乳中DNA ； 2)以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產(chǎn)物，LAMP擴增條件為:90°C~990C PCR (聚合酶鏈式反應)反應5~lOmin，迅速置于O~4°C加入Bst酶，60~65°C酶促反應40~90min，升溫至80~100°C使酶鈍化2~IOmin ； 3)擴增產(chǎn)物的試紙條鑒定；將探針與擴增產(chǎn)物雜交， 在60~65°C雜交2-10分鐘然后將雜交產(chǎn)物與緩沖液孵育，最后將試紙條放入，觀察試紙條檢測線是否有條帶進行結果判讀。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484536SQ201310287426
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權日:2013年7月10日
【發(fā)明者】姜毓君, 滿朝新, 董鑫悅 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學