專利名稱：從α-酮庚二酸制備6-氨基己酸的制作方法
從α -酮庚二酸制備6-氨基己酸本發(fā)明涉及制備6-氨基己酸(下文也稱作“6-ACA”)的方法。本發(fā)明還涉及從6-ACA制備己內(nèi)酰胺(下文稱作“己內(nèi)酰胺”)的方法。本發(fā)明還涉及可用于制備6-ACA或己內(nèi)酰胺的宿主細(xì)胞。己內(nèi)酰胺是一種內(nèi)酰胺，其可以被用于生產(chǎn)聚酰胺，例如尼龍-6或尼龍-6，12(己內(nèi)酰胺和十二內(nèi)酰胺的共聚物)。由大宗化學(xué)品制備己內(nèi)酰胺的多種方式是本領(lǐng)域已知的，并且包括由環(huán)己酮、甲苯、苯酚、環(huán)己醇、苯或環(huán)己烷制備己內(nèi)酰胺。這些中間產(chǎn)物化合物通常得自礦物油?？紤]到使用更加可持續(xù)的技術(shù)來制備材料的日益增長的需要，期望提供一種方法，其中由能夠從生物可再生來源獲得的中間產(chǎn)物化合物或至少由使用生物化學(xué)方法被轉(zhuǎn)化成己內(nèi)酰胺的中間產(chǎn)物來制備己內(nèi)酰胺。另外，想要提供一種方法，所述方法比利用來自石油化學(xué)來源的大宗化學(xué)品的傳統(tǒng)化學(xué)工藝需要更少能源。由6-ACA制備己內(nèi)酰胺是已知的，例如如US-A6，194，572中所述。如W02005/068643中所公開的，可以在存在具有α，β -烯酸酯還原酶活性的酶時，通過轉(zhuǎn)化6-氨基己-2-烯酸(6-ΑΗΕΑ)來生物化學(xué)地制備6-ACA。可以例如通過生物化學(xué)方式或通過純化學(xué)合成，由賴氨酸制備6-ΑΗΕΑ。盡管可以通過W02005/068643中公開的方法，通過6-ΑΗΕΑ的還原制備6-ACA是可行的，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在還原反應(yīng)條件下，6-ΑΗΕΑ可自發(fā)并且基本不可逆地環(huán)化形成不想要的副產(chǎn)物，特別是高脯氨酸。所述環(huán)化可以形成6-ACA生產(chǎn)中的瓶頸，并可導(dǎo)致產(chǎn)率的可觀損失。W02009/113855公開了用于制備6-ACA的新反應(yīng)途徑，即從α-酮庚二酸(AKP)經(jīng)由中間產(chǎn)物5-甲酰戍酸(也稱作5-甲酰纟顏草酸(5-formyl valeric acid), 5-FVA)或經(jīng)由中間產(chǎn)物α-氨基庚二酸(AAP)制備6-ACA。W02009/113855還公開了下述生物催化劑，其能在由AKP制備6-ACA中催化反應(yīng)步驟的至少一個。盡管W02009/113855公開了產(chǎn)生6-ACA的有效的方法，但是期望增加生物催化產(chǎn)生的6-ACA的生產(chǎn)率，特別是在從AKP完全生物催化產(chǎn)生6-ACA的方法中。本發(fā)明的一個目的是提供用于制備6-ACA或己內(nèi)酰胺(尤其可以被用于制備聚酰胺的己內(nèi)酰胺)或用于制備6-ACA或己內(nèi)酰胺的中間產(chǎn)物化合物的新穎方法，所述方法可以作為已知方法的替代方式。本發(fā)明的又一個目的是提供克服上文提到的現(xiàn)有技術(shù)中的一種或多種上述缺點(diǎn)的新穎方法。根據(jù)本發(fā)明可解決的一個或多個其他目的可根據(jù)下文的說明書得到。
目前發(fā)現(xiàn)有可能使用具有α-氨基庚二酸脫羧酶活性的特定生物催化劑，由AAP制備6-ACA。因此，本發(fā)明涉及用于制備6-氨基己酸的方法，其包括使用包含具有α-氨基庚二酸脫羧酶活性的酶的至少一種生物催化劑，使α-氨基庚二酸脫羧，其中所述酶包含由SEQUENCE ID N0’s:2、5、8和11和所述序列的具有α -氨基庚二酸脫羧酶活性的同源物之任一表不的氨基酸序列。在一種實(shí)施方式中，在本發(fā)明方法中制備的6-ACA用于制備己內(nèi)酰胺。這類方法包括任選地在存在生物催化劑時環(huán)化6-氨基-己酸。
根據(jù)本發(fā)明，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于中間產(chǎn)物的不想要的環(huán)化的問題，當(dāng)形成6-ACA并任選地形成己內(nèi)酰胺時，這些問題會導(dǎo)致產(chǎn)率的損失。預(yù)期本發(fā)明的方法允許得到與W02005/68643中所述方法相當(dāng)或甚至更好的產(chǎn)率。預(yù)期在利用活生物時，尤其是在要考慮生物的生長和維持的方法中，本發(fā)明的方法尤其是有利的。還預(yù)期在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中6-ACA的生產(chǎn)力(形成的g/I.h )被提聞ο除非另有說明，在本文中使用的術(shù)語“或者”被定義為“和/或”。除非另有說明，在本文中使用的術(shù)語“一”(“a”或“an”)被定義為“至少一個”。涉及單數(shù)名詞(例如化合物、添加劑等)時，復(fù)數(shù)旨在被包括在內(nèi)。本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、AAP、另一氨基酸、或AKP時，這些術(shù)語旨在包括質(zhì)子化的羧酸基(即中性基團(tuán))、它們相應(yīng)的羧酸酯(其共軛堿)及其鹽。在本文中提到氨基酸例如6-ACA時，所述術(shù)語旨在包括兩性離子形式的氨基酸(其中氨基被質(zhì)子化且羧酸酯基是去質(zhì)子化的形式)，其中氨基被質(zhì)子化且羧基為中性形式的氨基酸，和其中氨基為中性形式且羧酸酯基是去質(zhì)子化形式的氨基酸，以及它們的鹽。涉及存在立體異構(gòu)體的化合物時，所述化合物可以是任何這類立體異構(gòu)體或其組合。因此，涉及例如存在對映異構(gòu)體的氨基酸時，氨基酸可以是L-對映異構(gòu)體、D-對映異構(gòu)體或其組合。存在天然立體異構(gòu)體時，化合物優(yōu)選地是天然立體異構(gòu)體。當(dāng)涉及一個酶的在括號中的酶種類(EC)時，所述酶種類是以NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and MolecularBiology(NC-1UBMB)提供的Enzyme Nomenclature為基礎(chǔ)，將酶歸類或可以歸類在其中的種類，所述命名法可見http: //www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。(尚)未歸類但是可以同樣被歸類在特定種類中的其他合適的酶旨在包括在內(nèi)。術(shù)語“同源物”在本文中尤其用于具有至少40%、更優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少65%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%、尤其是至少85%、更尤其是至少90%、至少91%、92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一'I"生的多核苷酸或多肽。另外，同源物通常具有顯著的序列相似性，通常多于30%的、尤其至少35%、優(yōu)選地至少40%、更優(yōu)選地至少60%、更優(yōu) 選地至少65%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%、尤其至少85%、更尤其至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列相似性。多肽或多核苷酸的同源物通常與其自身具有相同的期望的功能，例如編碼各自能催化相同反應(yīng)(典型地相同底物向相同化合物轉(zhuǎn)化)或類似反應(yīng)的相同肽?！邦愃品磻?yīng)”典型地是相同類型的反應(yīng)，例如脫羧、轉(zhuǎn)氨化、Cl-延伸。因此，按照經(jīng)驗(yàn)法則，同源物酶可歸類在共有EC種類(x.y.Z)的頭三個數(shù)字的EC種類中，例如針對羧化酶的EC4.1.1。典型地，在類似反應(yīng)中，作為用于與類似反應(yīng)類似的反應(yīng)的底物的相同種類(例如胺、羧酸、氨基酸)的底物被轉(zhuǎn)化為作為與類似反應(yīng)類似的反應(yīng)的產(chǎn)物的相同種類的產(chǎn)物。類似反應(yīng)尤其包括通過相同化學(xué)轉(zhuǎn)化定義的反應(yīng)，如通過相同KEGG RDM模式定義的，其中R-原子和D-原子描述化學(xué)轉(zhuǎn)化(KEGG RDM patterns: Oh, M.et al.(2007) Systematic analysis ofenzyme-catalyzed reaction patterns and prediction of microbial biodegradationpathways.J.Chem.1nf.Model.，47，1702 - 1712))。術(shù)語同源物也旨在包括由于遺傳密碼子的簡并性或?qū)嶒?yàn)偏性而與另一核酸序列不同并且編碼相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。本文中術(shù)語“功能類似物”用于下述核酸序列，所述核酸序列不同于所述類似物為類似物的給定序列，但編碼具有相同氨基酸序列的肽(蛋白、酶)或編碼此類肽的同源物。尤其，優(yōu)選的功能類似物是在感興趣的宿主細(xì)胞中與稱其為功能類似物的核苷酸序列相比具有類似的、相同的或更好的表達(dá)水平的核苷酸序列。在這方面，注意到，如技術(shù)人員所理解的，若期望肽(蛋白、酶)表達(dá)，更好的表達(dá)水平通常是更高的表達(dá)水平。但是，在特定實(shí)施方式中，更好表達(dá)水平可以是更低的表達(dá)水平，因?yàn)檫@在所述宿主細(xì)胞的代謝途徑背景中可能是期望的。功能類似物可以是天然存在的序列，即野生型功能類似物，或遺傳修飾的序列，即非野生型功能類似物。編碼具體肽的密碼子優(yōu)化的序列通常是野生型序列的非野生型功能類似物，其被設(shè)計來實(shí)現(xiàn)期望的表達(dá)水平。尤其，優(yōu)選的功能類似物是在感興趣的宿主細(xì)胞中與稱其為功能類似物的核苷酸序列相比具有類似的、相同的或更好的表達(dá)水平的核苷酸序列。序列同一性或類似性在本文中被定義為如通過比較序列測定的，兩條或更多條多肽序列或兩條或更多條核酸序列之間的關(guān)系。通常，序列同一性或相似性在序列全長上比較，但是也可以僅針對彼此比對的序列的一部分進(jìn)行比較。在本領(lǐng)域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之間的序列相關(guān)性程度，根據(jù)情況由這類序列之間的匹配來確定。測定同一性或相似性的優(yōu)選方法被設(shè)計為在測試的序列之間給出最大匹配。在本發(fā)明的上下文中，測定兩條序列之間同一性和相似性的一種優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括BLASTP 和 BLASTN (Altschul, S.F.et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410)，公眾可以從NCBI 和其他來源(BLAST Manual, Altschul, S., et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894)獲得。使用BLASTP進(jìn)行多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放10.0，缺口延伸0.5，Blosum62矩陣。使用BLASTN進(jìn)行核酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩陣(DNA同一性矩陣)。根據(jù)本發(fā)明，使用生物催化劑，即所述方法中至少一個反應(yīng)步驟由生物材料或來自生物來源的部分(例如來自生物來源的生物或生物分子)催化。生物催化劑可尤其包含一種或多種酶。生物催化劑可以以任何形式使用。在一種實(shí)施方式中，使用從天然環(huán)境中分離(從生產(chǎn)它們的生物中分離)的一種或多種酶，例如作為溶液、乳液、分散液、凍干細(xì)胞(懸浮液)、作為裂解物、或固定在支持物上。在一種實(shí)施方式中，一種或多種酶形成了活細(xì)胞的部分(如活的全細(xì)胞)。 酶可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮催化功能。酶還可能被分泌進(jìn)所述細(xì)胞存在的培養(yǎng)基中?；罴?xì)胞可以是生長中的細(xì)胞、靜止或休眠細(xì)胞(例如孢子)或穩(wěn)定期細(xì)胞。還可能使用酶形成通透化(即使其對酶的底物或一種或多種酶的底物前體通透)的細(xì)胞的部分。本發(fā)明方法中使用的生物催化劑原則上可以是任何生物，獲得自或來自任何生物。生物可以是真核生物或原核生物。具體地，所述生物可選自動物(包括人)、植物、細(xì)菌、古細(xì)菌、酵母和真菌。在一種實(shí)施方式中，生物催化劑源自動物，尤其源自其部分，例如肝、胰、腦、腎、心或其他器官。動物可尤其選自哺乳動物的組，更尤其選自Leporidae、Muridae、Suidae和Bovidae 的組。合適的植物尤其包括選自下組的植物:Asplenium ；Cucurbitaceae,尤其是Curcurbita,例如Curcurbita moschata(南瓜)或Cucumis ;Mercurialis,例如Mercurialisperennis ；Hydnocarpus ;和 Ceratonia0合適的細(xì)菌可尤其選自下組:Vibrio、Pseudomonas > Bacillus、Corynebacterium、 Brevibacterium、 Enterococcus、 Streptococcus、 Klebsiella、Lactococcus、Lactobacillus、Clostridium、Escherichia、Thermus> Mycobacterium、Zymomonas、Proteus、Agrobacterium、Geobacillus、Acinetobacter、Ralstonia、Rhodobacter> Paracoccus、Novosphingobium> Nitrosomonas、Legionella、Neisseria、Rhodopseudomonas、Staphylococcus、Thermotoga、Deinococcus 和 Salmonella。合適的古細(xì)菌可尤其選自下組:Archaeoglobus、Aeropyrum、Halobacterium、Methanosarcina> Methanococcus、Thermoplasma、Pyrobaculum、Methanocaldococcus、Methanobacterium、Methanosphaera、Methanopyrus和 Methanobrevibacter。合適的真菌可尤其選自Rhizopus、Neurospora、Penicillium 和 Aspergillus 的組。合適的酵母可尤其選自Candida、Hansenula、Kluyveromyces 和 Saccharomyces 的組。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以利用具有合適活性的天然存在的生物催化劑(野生型)或天然存在的生物催化劑的突變體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生物學(xué)技術(shù)，例如分子進(jìn)化或合理設(shè)計改進(jìn)天然存在的生物催化劑的特性?？衫缤ㄟ^使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的誘變技術(shù)(隨機(jī)誘變、定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化、基因重組等)修飾下述生物的編碼DNA來制造野生型生物催化劑的突變體，所述生物能夠發(fā)揮生物催化劑的作用或者能夠生產(chǎn)生物催化劑部分(如酶)。具體地，可以修飾DNA，使其編碼與野生型酶差異至少一個氨基酸的酶，使其編碼與野生型相比包含一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突變體組合兩個或更多親本酶的序列，或者影響合適的(宿主)細(xì)胞中藉此被修飾的DNA的表達(dá)。后者可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法如密碼子優(yōu)化或密碼子對優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)，例如基于W02008/000632中所述方法。突變體生物催化劑可具有經(jīng)改進(jìn)的特性，例如關(guān)于一個或多個以下方面:底物選擇性、活性、穩(wěn)定性、溶劑耐受性、PH譜、溫度譜、底物譜、對抑制的敏感性、輔因子利用和底物親和力。可以通過應(yīng)用例如合適的高通量篩選或選擇方法，基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這類選擇方法，來鑒定具有改進(jìn)的特性的突變體。提到來自具體來源的生物催化劑(尤其是酶)時，來自第一生物但是實(shí)際上在(經(jīng)遺傳修飾的)第二生物中生產(chǎn)的重組生物催化劑(尤其是酶)也旨在包括在來自所述第一生物的生物催化劑(尤其是酶)內(nèi)。AAP可以以任 何方式獲得。在特定實(shí)施方式中，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化AKP獲得AAP。另外，如針對類似化合物所描述的，可通過催化的Leuckart-Wal Iach反應(yīng)由2_氧庚二酸制備MP0該反應(yīng)用在甲醇中的甲酸銨和[RhCp*Cl2]2作為均相催化劑來進(jìn)行(M.Kitamura, D.Lee, S.Hayashi, S.Tanaka, M.Yoshimura J.0rg.Chem.2002, 67, 8685-8687)?；蛘?，如S.0go, K.Uehara and S.Fukuzumi in J.Am.Chem.Soc.2004, 126, 3020-3021 所描述的，使用[IrmCp*(bpy)H2O]SO4作為催化劑用水性甲酸銨來進(jìn)行Leuckart-Wallach反應(yīng)。通過與(手性)芐胺反應(yīng)并隨后在Pd/C或Pd(0H)2/C上對中間產(chǎn)物亞胺進(jìn)行氫化，α -酮酸轉(zhuǎn)化為(對映異構(gòu)富集的)氨基酸也是可能的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，6-ACA的制備包括在存在能夠在存在氨基供體時催化轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)的酶時的酶促反應(yīng)，所述酶選自氨基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.6.1)的組。在一種特定的實(shí)施方式中，通過將AKP生物催化轉(zhuǎn)化為AAP，來獲得AAP，所述轉(zhuǎn)化由氨基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.6.1)、氨基酸脫氫酶、或能催化AKP向AAP轉(zhuǎn)化的另一生物催化劑催化。通常，此類生物催化劑具有α-氨基庚二酸酯2-氨基轉(zhuǎn)移酶活性或α-氨基庚二酸酯2-氨基脫氫酶活性。氨基轉(zhuǎn)移酶可尤其選自以下組:β -氨基異丁酸酯:α -酮戊二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶、β -丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、4-氨基-丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.19)、L-賴氨酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.36),2-氨基己二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.39),5-氨基戊酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.48)、2_氨基己酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.67)和賴氨酸:丙酮酸酯6-氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.71 )。在一種實(shí)施方式中，氨基轉(zhuǎn)移酶可選自下組:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.2)、亮氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.6)、丙氨酸-氧代-酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.12)、β-丙氨酸-丙酮酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.18)、(S)_3_氨基-2-甲基丙酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.22)、L, L- 二氨基庚二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.83)。氨基轉(zhuǎn)移酶可尤其選自來自以下的的氨基轉(zhuǎn)移酶:哺乳動物Wercurialis，尤其是 Mercurialis perennis,更尤其是 Mercurialis perennis 的嫩芽(shoots);Asplenium,更尤其是 Asplenium、unilaterale 或 Asplenium septentrionale ；Ceratonia,更尤其是Ceratonia siliqua ;Rhodobacter,尤其是 Rhodobacter sphaeroides, Staphylococcus,尤其是 Staphylococcus aureus ；Vibrio,尤其是 Vibrio fluvialis ；Pseudomonas,尤其是 Pseudomonas aeruginosa ；Rhodopseusomonas ；Bacillus,尤其是 Bacillusweihenstephanensis 和 Bacillus subtilis ；Legionella ；Nitrosomas ；Neisseria ；或酵母，尤其是 Saccharomyces cerevisiae。當(dāng)酶是哺乳動物的酶時，其尤其可源自哺乳動物腎，來自哺乳動物肝，來自哺乳動物心或來自哺乳動物腦。例如，合適的酶可選自下組:來自哺乳動物腎的氨基異丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶，尤其是來自豬腎的氨基異丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶；來自哺乳動物肝的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，尤其是來自兔肝的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；來自哺乳動物心的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；尤其是來自豬心的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；來自哺乳動物肝的4-氨基-丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶，尤其是來自豬肝的4-氨基-丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶；來自哺乳動物腦的4-氨基-丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶，尤其是來自人、豬或大鼠腦的4-氨基丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶。在一種實(shí)施方式中,來自真菌、尤其來自Neurospora的α-酮己二酸酯-谷氨酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶，更尤其是來自Neurospora crassa的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶。

在一種實(shí)施方式中，氨基轉(zhuǎn)移酶選自下述組:來自Ε.coli的4-氨基-丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶、來自Thermus的α -氨基己二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶,尤其是來自Thermus thermophilus的α_氨基己二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶，和來自Clostridium、尤其是來自Clostridiumaminovalericum的5-氨基戍酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶。一種合適的2_氨基己二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶可例如由Pyrobaculum islandicum提供。氨基供體尤其可選自氨、銨離子、胺和氨基酸的組。合適的胺是伯胺和仲胺。氨基酸可具有D-構(gòu)型或L-構(gòu)型。氨基供體的例子是丙氨酸、谷氨酸、異丙胺、2-氨基丁烷、2-氨基庚燒、苯甲胺、1-苯基-1-氨基乙燒、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、β _氨基異丁酸酯、丙氨酸、4-氨基丁酸酯和α-氨基己二酸酯。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備6-ACA的方法包含在存在下述酶時的生物催化反應(yīng)，所述酶能夠在存在氨來源時催化還原性氨基化反應(yīng)，所述酶選自作用于供體CH-NH2基團(tuán)上的氧化還原酶(EC1.4)的組，尤其是選自氨基酸脫氫酶(E.C.1.4.1)的組。通常，合適的氨基酸脫氫酶具有催化5-FVA轉(zhuǎn)化成為6-ACA的6-氨基己酸6-脫氫酶活性，或者具有催化AKP轉(zhuǎn)化成為AAP的α-氨基庚二酸酯2-脫氫酶活性。合適的氨基酸脫氫酶尤其選自二氨基庚二酸酯脫氫酶(EC1.4.1.16)、賴氨酸6-脫氫酶(EC1.4.1.18)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.3 ；EC1.4.1.4)和亮氨酸脫氫酶(EC1.4.1.9)的組。在一種實(shí)施方式中，氨基酸脫氫酶選自被歸類為以下的氨基酸脫氫酶:以NAD或NADP作為受體發(fā)揮作用的谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.3)、以NADP作為受體發(fā)揮作用的谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.4)、亮氨酸脫氫酶(EC1.4.1.9)、二氨基庚二酸酯脫氫酶(EC1.4.1.16)和賴氨酸6-脫氫酶(EC1.4.1.18)。

氨基酸脫氫酶可尤其源自選自下組的生物:Corynebacterium,尤其是Corynebacterium glutamicum ;Proteus,尤其是 Proteus vulgaris ;Agrobacterium,尤其是Agrobacterium tumefaciens ;Geobacillus,尤其是Geobacillus stearothermophiIus ；Acinetobacter,尤其是 Acinetobacter sp.ADPl ；Ralstonia,尤其是 Ralstoniasolanacearum ；Salmonella,尤其是 Salmonella typhimurium ；Saccharomyces,尤其是 Saccharomyces cerevisiae ；Brevibacterium,尤其是 Brevibacterium flavum ；和Bacillus,尤其是 Bacillus sphaericus、Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis。例如，合適的氨基酸脫氫酶可選自來自Bacillus,尤其是Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脫氫酶，尤其是來自Corynebacterium glutamicum的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Proteus的二氨基庚二酸酯脫氫酶,尤其是來自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Agrobacterium、尤其是Agrobacterium tumefaciens的賴氛酸 6_ 脫氧酶，來自 Geobacillus、尤其是來自 Geobacillus stearothermophiIus 的賴氨酸6-脫氫酶；來自Acinetobacter的以NADH或NADPH作為輔因子發(fā)揮作用的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.3),尤其是來自Acinetobacter sp.ADPl的谷氨酸酯脫氫酶；來自Ralstonia的谷氛酸酷脫氧酶(EC1.4.1.3),尤其是來自Ralstonia solanacearum的谷氨酸酯脫氫酶；來自Salmonella的以NADPH作為輔因子發(fā)揮作用的谷氨酸酯脫氫酶，尤其是來自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脫氫酶；來自Saccharomyces的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.4),尤其是來自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脫氫酶；來自Brevibacterium 的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.4),尤其是來自 Brevibacterium fIavum的谷氨酸酯脫氫酶；和來自Bacillus的亮氨酸脫氫酶,尤其是來自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脫氫酶。在一種特定的實(shí)施方式中，用于AKP向AAP轉(zhuǎn)化的氨基轉(zhuǎn)移酶選自下述組:來自豬心的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；來自Neurospora crassa或酵母的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶；來自Mercurialis perennis的嫩芽的氨基轉(zhuǎn)移酶；來自E.coli的4-氨基丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶；來自Thermus thermophilus的α -氨基己二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶；來自Asplenium septentrionale 或 Asplenium unilaterale 的氨基轉(zhuǎn)移酶；和來自 Ceratoniasiliqua的氨基轉(zhuǎn)移酶。在一種特定的實(shí)施方式中，用于AKP向AAP轉(zhuǎn)化的氨基轉(zhuǎn)移酶選自下述組:來自Vibrio，Pseudomonas、Bacillus、Legionella、Nitrosomonas、Neisseria、RhodobacterΛEscherichia 和 Rhodopseudomonas 的氛基轉(zhuǎn)移酶。已發(fā)現(xiàn)尤其來自從下述組中選擇的生物的氨基轉(zhuǎn)移酶適于催化AKP向AAP轉(zhuǎn)化:Bacillus subtilis、Rhodobacter sphaeroides、Legionella pneumophila、Nitrosomonaseuropaea、 Neisseria gonorrhoeae、 Pseudomonas syringae、 Rhodopseudomonaspalustris、Vibrio fluvialis、Escherichia coli 和 Pseudomonas aeruginosa。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，就AKP向AAP轉(zhuǎn)化而言，使用了下述氨基轉(zhuǎn)移酶，所述氛基轉(zhuǎn)移酶包含根據(jù) Sequence ID N015、Sequence ID N018、Sequence ID N021、Sequence ID N023、Sequence ID N026、Sequence ID N028、Sequence ID N030、SequenceID N032、 Sequence ID N034、 Sequence ID N036、 Sequence ID N038、 Sequence IDN040Sequence ID N042、Sequence ID N044、Sequence ID N046 的氨基酸或這些序列之任一的同源物。

在其他實(shí)施方式中，用于由AKP制備AAP的方法包括在存在下述酶時的生物催化反應(yīng)，所述酶能夠在存在氨來源時催化還原性氨基化反應(yīng)，所述酶選自作用于供體CH-NH2基團(tuán)上的氧化還原酶(EC1.4)的組，尤其是選自氨基酸脫氫酶(E.C.1.4.1)的組。通常，合適的氨基酸脫氫酶具有催化AKP轉(zhuǎn)化為AAP的α -氨基庚二酸酯2_脫氫酶活性。合適的氨基酸脫氫酶尤其選自下述組:二氨基庚二酸酯脫氫酶(EC1.4.1.16)、谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.3; ECl.4.1.4)和亮氨酸脫氫酶(EC1.4.1.9)。在一種實(shí)施方式中，氨基酸脫氫酶選自歸類為下述類別的氨基酸脫氫酶:以NAD或NADP作為受體起作用的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.3)、以NADP作為受體起作用的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.4)、亮氨酸脫氫酶(EC1.4.1.9)和二氨基庚二酸酯脫氫酶(EC1.4.1.16)。氨基酸脫氫酶可尤其源自從下述組中選擇的生物:Corynebacterium,尤其是Corynebacterium glutamicum; Proteus,尤其是 Proteus vulgaris ;Agrobacterium,尤其是Agrobacterium tumefaciens ;Geobacillus,尤其是Geobacillus stearothermophiIus ；Acinetobacter,尤其是 Acinetobacter sp.ADPl ；Ralstonia,尤其是 Ralstoniasolanacearum ；Salmonella,尤其是 Salmonella typhimurium ；Saccharomyces,尤其是 Saccharomyces cerevisiae ；Brevibacterium,尤其是 Brevibacterium flavum ；和Bacillus,尤其是 Bacillus sphaericus、Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis。例如，合適的氨基酸脫氫酶可選自:來自Bacillus,尤其是來自Bacillussphaericus的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脫氫酶，尤其是來自Corynebacteriumglutamicum的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Proteus的二氨基庚二酸酯脫氫酶,尤其是來自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脫氫酶；來自Acinetobacter的以NADH或NADPH作為輔因子起作用的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.3)，尤其是來自Acinetobacter sp.ADPl的谷氨酸酯脫氫酶；來自Ralstonia的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.3),尤其是來自Ralstoniasolanacearum的谷氨酸酯脫氫酶；來自Salmonella的以NADPH作為輔因子(EC1.4.1.4)起作用的谷氨酸酯脫氫酶，尤其是來自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脫氫酶；來自Saccharomyces 的谷氛酸酷脫氧酶(EC1.4.1.4),尤其是來自 Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脫氫酶；來自Brevibacterium的谷氨酸酯脫氫酶(EC1.4.1.4),尤其是來自Brevibacterium flavum的谷氨酸酯脫氫酶；和來自Bacillus的亮氨酸脫氫酶,尤其是來自 Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis 的亮氨酸脫氫酶。另一合適的氨基酸脫氫酶可選自下述組:來自Agrobacterium tumefaciens或Geobacillus stearothermophilus的賴氨酸6_脫氫酶；或選自下述組:來自Bacilluscereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脫氫酶。用于制備6-AAP的AKP原則上可以通過任何方式獲得。例如，AKP可基于H.Jageret al.Chem.Ber.1959，92，2492-2499所述方法獲得?？梢匀缦轮苽銩KP:使用乙醇酸鈉作為堿，用二乙基草酸酯烷基化環(huán)戊酮，將得到的產(chǎn)物在強(qiáng)酸(2M HCl)中回流并例如通過從甲苯中結(jié)晶來回收產(chǎn)物。還可能從天然來源，例如從產(chǎn)甲燒的Archaea,從Asplenium septentrionale,或從Hydnocarpus anthelminthica獲得AKP?？衫鐝倪@種生物或其部分中，例如從Hydnocarpus anthelminthica種子中提取AKP。合適的提取方法可例如基于A.1.Virtanenand A.M.Berg in Acta Chemica Scandinavical954, 6, 1085-1086 中所述方法,其中描述了使用70%乙醇從Asplenium中提取氨基酸和AKP。在一種特定的實(shí)施方式中，在下述方法中制備AKP，所述方法包括將α-酮戊二酸(AKG)轉(zhuǎn)化成α-酮己二酸(ΑΚΑ)，并將α-酮己二酸轉(zhuǎn)化成α-酮庚二酸。該反應(yīng)可以由生物催化劑催化。AKG可例如以本領(lǐng)域本身已知的方式，從碳源例如碳水化合物生物催化地制備。用于從AKG制備AKP的合適的生物催化劑可尤其選自催化下述反應(yīng)的生物催化齊U: α -酮戊二酸成為α -酮己二酸的C1-延長和/或α -酮己二酸成為α -酮庚二酸的C1-延長。在一種特定的實(shí)施方式中，AKP的制備由包含以下的生物催化劑催化:a.AksA酶或其同源物；b.至少一種選自AksD酶、AksE酶、AksD酶同源物和AksE酶同源物的組的酶；和c.AksF酶或其同源物。優(yōu)選地，催化劑包含選自AksD酶和其同源物的組的酶以及選自AksE酶和其同源物的組的酶二者。所述AksD酶或其同源物和所述AksE酶典型地形成異二聚體。一種或多種AksA、A ksD, AksE, AksF酶或其同源物可存在于下述生物中，所述生物選自產(chǎn)甲燒古細(xì)菌的組，優(yōu)選地選自Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosarcina、Methanothermobacter、Methanosphaera、Methanopyrus 和Methanobrevibacter 的組。在一種特定的實(shí)施方式中，催化由α-酮戊二酸(AKG)制備AKP的生物催化劑包含催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成α-酮己二酸的酶體系，其中所述酶體系形成賴氨酸生物合成的α-氨基己二酸酯通路的部分。術(shù)語“酶體系”在本文中尤其用于能夠催化特定轉(zhuǎn)化的單個酶或一組酶。從AKG制備AKP可包括具有已知或未知中間產(chǎn)物的一個或多個化學(xué)反應(yīng)，例如AKG成為AKA的轉(zhuǎn)·化或AKA成為AKP的轉(zhuǎn)化。這類體系可存在于細(xì)胞中，或從細(xì)胞中分離。酶體系可尤其來自下述生物，所述生物選自酵母、真菌、古細(xì)菌和細(xì)菌的組，尤其來自 Penicillium、Cephalosporium、Paelicomyces、Trichophytum、Aspergillus、Phanerochaete、Emericella、Ustilago、Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Candida、Yarrowia、Pichia、Kluyveromyces、Thermus> Deinococcus、Pyrococcus、Sulfolobus、Thermococcus、Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosphaera、Methanopyrus、Methanobrevibacter、Methanosarcina 和 Methanothermobacter 的組。在一種特定的實(shí)施方式中，催化從α-酮戊二酸制備AKP的生物催化劑包含催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成α-酮己二酸的酶體系，其中所述酶體系的至少一種酶源自固氮細(xì)菌，所述固氮細(xì)菌選自藍(lán)細(xì)菌、根瘤菌、Y -變形菌(proteobacteria)和放線菌(actinobacteria)的組，尤其選自 Anabaena、Microcystis、Synechocystis、Rhizobium、Bradyrhizobium> Pseudomonas、Azotobacter、Klebsiella 和 Frankia 的組。這些Aks酶的同源物和編碼這些酶的基因的例子在下文的表IA和IB中給出。表 IA
權(quán)利要求
1.關(guān)于制備6-氨基己酸的方法，其包括使用包含具有α-氨基庚二酸脫羧酶活性的酶的至少一種生物催化劑，使α-氨基庚二酸脫羧，其中所述酶包含選自由序列編號:2、5、8和11的之任一表示的序列和具有α -氨基庚二酸脫羧酶活性的所述序列的同源物的組的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酶包含與序列編號:2、5、8和11之任一具有至少40%，優(yōu)選地至少60%，尤其至少80%，更尤其至少90%序列同一性的同源物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其包括從α-酮庚二酸制備α -氨基庚二酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，在存在氨基供體時，由生物催化劑催化α-氨基庚二酸的制備，所述生物催化劑具有使α-酮庚二酸轉(zhuǎn)氨化或還原性氨基化的催化活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述生物催化劑包含具有使α-酮庚二酸轉(zhuǎn)氨化或還原性氨基化的催化活性且選自氨基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.6.1)和氨基酸脫氫酶(E.C.1.4.1)的組的酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述氨基轉(zhuǎn)移酶或氨基酸脫氫酶選自下組:β-氨基異丁酸酯:α -酮戊二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶、β -丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、4-氨基-丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.19)、L-賴氨酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.36)、2_氨基己二酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.39)、5_氨基戊酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.48)、2_氨基己酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.67)、賴氨酸:丙酮酸酯-6-氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.71)和賴氨酸_6_脫氫酶(EC1.4.1.18)。
7.求3-6任一項的方法，其中使用了下述氨基轉(zhuǎn)移酶，所述酶包含根據(jù)序列編號15、序列編號18、序列編號21、序列編號23、序列編號26、序列編號28、序列編號30、序列編號32、序列編號34、序列編號36、序列編號38、序列編號40、序列編號42、序列編號44、序列編號46的氨基酸序列、在說明書表8、9或11中提到的氨基轉(zhuǎn)移酶、或這些序列之任一的同源物。
8.關(guān)于制備己內(nèi)酰胺的方法，其包括對通過根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法制備的6-氨基己酸環(huán)化，因此形成己內(nèi)酰胺。
9.組宿主細(xì)胞，其包含編碼具有α-氨基庚二酸脫羧酶活性的異源酶的基因，其中所述酶包含由序列編號:2、5、8和11和所述序列的同源物之任一表示的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組宿主細(xì)胞，其包含編碼具有α-氨基庚二酸脫羧酶活性的酶的核酸序列，所述核酸序列包含根據(jù)序列編號:1、3、4、6、7、9和10和所述序列的功能類似物之任一的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的重組宿主細(xì)胞，其包含編碼能催化轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)或還原性氨基化的生物催化劑的核酸序列，借以由α-酮庚二酸形成α-氨基庚二酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的重組宿主細(xì)胞，其中編碼能催化轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)或還原性氨基化反應(yīng)的生物催化劑的核酸序列選自序列編號15、序列編號18、序列編號21、序列編號23、序列編號26、序列編號28、序列編號30、序列編號32、序列編號34、序列編號36、序列編號38、序列編號40序列編號42、序列編號44、序列編號46或這些序列之任一的同源物的組。
13.核苷酸，其包含根據(jù)序列編號:3、6和9和在Escherichia宿主細(xì)胞中具有類似、相同或更好的表達(dá)水平的其功能類似物之任一的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備6-氨基己酸的方法，其包括使用至少一種包含具有α-氨基庚二酸脫羧酶活性的酶的生物催化劑，使α-氨基庚二酸脫羧。本發(fā)明還涉及用于由通過所述方法制備的6-氨基己酸制備己內(nèi)酰胺的方法、涉及適用于根據(jù)本發(fā)明的方法的宿主細(xì)胞和編碼可在本發(fā)明的方法中使用的脫羧酶的多核苷酸。
文檔編號C12P13/00GK103097541SQ201180043687
公開日2013年5月8日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者斯特凡納斯·克尼里斯·翰德里克斯·蒂爾科, 馬丁·斯庫爾曼, ?？怂估铡た死锼苟喾稹ぬ乩锔? 彼托納拉·凱瑟琳娜·拉伊馬克斯-弗蘭肯, 希爾德加德·漢納·曼克 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司