專利名稱：一種含腺苷酸環(huán)化酶抑制劑及溶血磷脂酸作為活性成分的調(diào)控細胞衰老的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種 含腺苷酸環(huán)化酶(ACI)及溶血磷脂酸(LPA)作為活性成分的調(diào) 控細胞衰老的組合物，更具體地，本發(fā)明涉及一種含LPA及ACI作為活性成分的調(diào)控細 胞衰老的組合物以及一種調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用有效劑量的所述組合物 處理衰老細胞的步驟。
背景技術：
細胞衰老在復雜的生物學過程(包括發(fā)育、成熟及腫瘤發(fā)生)中發(fā)揮著重要 作用。因此，已進行了大量嘗試以了解細胞衰老中基礎而重要的特性(Peacocke和 Campisi, 1991 ； Smith和Pereira-Smith，1996)。細胞衰老的特性之一就是對生長因子及 促分裂原的低響應性。溶血磷脂酸(LPA)是一種重要的促分裂原激動劑，它可誘導人雙胚成纖維細 胞中與細胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運、肌動蛋白聚合及磷脂酸生成相關的信號轉(zhuǎn)導，并通過鳥苷酸結 合蛋白(G-蛋白)發(fā)揮胞外信使的作用。LPA也被認為是一種對LPA受體介導的細胞 形態(tài)學、趨化性及分化具有多種生物學效應的物質(zhì)(Moolenaar，2000 ； Moolenaar等， 1997)。LPA受體以LPA1、LPA2及LPA3等同種型為例，這些同種型與對百日咳毒素 敏感的Gia結合，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性(An等，1998)，從而導致cAMP的下降 (Taussig 等，1993)。有趣的是，LPA降低年輕細胞中的cAMP，卻增加衰老細胞中的cAMP，表明 它調(diào)控的是下一級的(lower)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(Jang等，2006a; Jang等，2003; Jang等， 2006b)。肌肉、肝臟及脂肪細胞中cAMP信號轉(zhuǎn)導與AMPK信號轉(zhuǎn)導的相互作用廣為人 知(Cohen和Hardie，1991 ； Kahn等，2005; Long和Zierath，2006)。哺乳動物的 AMPK 是一種具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，該蛋白由催化亞基α和兩個調(diào)節(jié)亞基β及 Y組成。當位于α亞基活化環(huán)的Thrl72被磷酸化時，AMPK被活化。當調(diào)控AMPK活 性最重要的因子AMP與Y亞基結合時，便誘導AMPK的上游激酶(即AMPKK)介導的 磷酸化。AMPKK以在黑斑息肉綜合癥(Peutz-Jeghers syndrome)中鑒定為突變的LKBl/ STKllCHawley 等，2003; Shaw 等，2004; Woods 等，2003a)、鈣 / 鈣調(diào)蛋白依賴性蛋 白激酶激酶(CaMKK)-α 和 β (Hawley 等，2005 ； Hong 等，2005 ； Hurley 等，2005 ； Woods 等，2005)及 TAKl (Woods 等，2003a)為例。除Thrl72以外，AMPK的α和β亞基上還有其它經(jīng)鑒定的磷酸化位點。然 而，這些位點是否與AMPK活性的調(diào)控相關還未經(jīng)確認(Mitchelhill等，1997 ； Stein 等，2000 ； Warden 等，2001 ； Woods 等，2003b)。具體地，AMPK α 1 的 Ser485 (相 當于 AMPK α 2 的 Ser491)是一個由 PKA (Hurley 等，2006)或蛋白激酶 B(PKB)/ AKTCHahn-Windgassen 等，2OO5; Horman 等，2OO6; Soltys 等，2006)磷酸化的自磷酸 化位點(Horman 等，2006)。PKA 或 PKB/AKT 對 Ser485/491 的磷酸化抑制了 α-Thr-172通路，導致Thr-172磷酸化的下降。由此，AMPK的活化被抑制。腫瘤抑制基因產(chǎn)物p53由AMPK介導的Serl5的磷酸化活化。該過程對于蛋白 遷移入核并具有轉(zhuǎn)錄活性而言十分重要。p53的轉(zhuǎn)錄活性與p21蛋白水平的調(diào)控相關，其 中，p21蛋白是依賴于p53的細胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)抑制劑。Cdk是一種重要的 控制真核細胞細胞周期的酶。當正常真核細胞通過信號轉(zhuǎn)導通路接收到生長信號時，便 依照一系列細胞周期誘導細胞增殖。這時，cdk便與細胞周期各階段特異性表達的細胞 周期蛋白結合，形成功能單元，由此便形成了活化細胞周期各階段的特異性細胞周期蛋 白-cdk復合物。細胞周期蛋白-cdk復合物的活化由多種機制調(diào)控。舉例來說，cdk可 以被磷酸化或去磷酸化，或與特異的抑制劑蛋白結合，或者，細胞周期蛋白可能被蛋白 水解。細胞周期被調(diào)控至在正確的地點及正確的時間發(fā)生。細胞周期的精確調(diào)控由包括 細胞周期蛋白-cdk復合物在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)因子控制。p21蛋白即是這些調(diào)控因子的一個 例子。一旦DNA受到損傷，腫瘤抑制基因p53即被活化，由此，活化的p53誘導p21表 達。p21與誘導S期的細胞周期蛋白-cdk復合物結合，導致抑制CDK 4AV2激酶活性。 由此，Rb的磷酸化被抑制。然后，細胞便停滯于Gl期，以爭取DNA修復的時間。已知AMPK可誘導p53磷酸化，從而提高p21的表達，導致細胞增殖的抑制。 然而，目前提出多種關于胞內(nèi)分子種類的細胞增殖理論，所以，對于此類現(xiàn)象還需要更 清楚的解釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等嘗試公開更多與細胞增殖相關的關于胞內(nèi)分子種類及信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng) 的細節(jié)。結果是，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，LPA在年輕細胞和衰老細胞中都誘導細胞增殖，而 ACI降低年輕細胞中的細胞增殖，卻誘導衰老細胞中的細胞增殖。本發(fā)明人等進一步證 實AMPK與上述過程緊密相關?？偠灾景l(fā)明人等證明了 LPA及ACI不同地調(diào)控 AMPK磷酸化以降低AMPK的活化，從而使得衰老細胞增殖。本發(fā)明人等進一步證實， 相比LPA或ACI的單一處理，LPA和ACI的共同處理能更有效地誘導細胞增殖。本發(fā)明的一個目的是提供一種含LPA和ACI作為活性成分的調(diào)控細胞衰老的組 合物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用有效劑 量的LPA和ACI處理衰老細胞的步驟。本發(fā)明的再一個目的是提供一種調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用含LPA 及ACI的所述組合物對需要調(diào)控細胞衰老的受試者進行給藥。本發(fā)明的其它目的及優(yōu)勢公開于所附權利要求及以下包括附圖的實施方式中。本發(fā)明涉及一種含LPA及ACI作為活性成分的調(diào)控細胞衰老的組合物以及一種 調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用有效劑量的所述組合物處理衰老細胞的步驟。本 發(fā)明所述調(diào)控細胞衰老的組合物及采用該組合物調(diào)控細胞衰老的方法在控制衰老細胞的 細胞衰老中有效。


本發(fā)明的上述及其它目的、特征和優(yōu)勢可從以下給出的優(yōu)選的實施方式及所附附圖的記載明顯得出，其中圖1是表示LPA及ACI對衰老細胞的細胞增殖及進入S期的影響的一組圖示。 (A)和(B)是表示單獨或同時用LPA及ACI處理傳代培養(yǎng)的年輕細胞(PD 20 A)及衰 老細胞(PD 64 B)后，再培養(yǎng)1、2及4天后的細胞計數(shù)結果的圖示。(C)是表示經(jīng)血 清饑餓2天而同步至G0/G1期、然后單獨或同時用LPA及ACI處理、隨后再培養(yǎng)1、2 及4天后的年輕細胞及衰老細胞的細胞計數(shù)結果的圖示。這里，認為相比于對照中的細胞數(shù)具有顯著性的細胞數(shù)如(A)和(B) (ρ <0.001)所示。(C)中的細胞周期經(jīng)流式細胞術分析。進入S期的細胞百分比取三次重 復測定結果的平均值(P < 0.001)。圖2是表示軟瓊脂分析結果的圖示，即LPA和ACI在年輕細胞和衰老細胞中均 不形成菌落。用含10%牛血清和0.3%頂級瓊脂的DMEM分散年輕細胞和衰老細胞，將 其加至60mm培養(yǎng)皿中0.6%的底層瓊脂層上。用30yMLPA(L)、300 μ M ACI (A)或同 時用LPA及ACI處理所述細胞3周后，用70%乙醇固定，同樣固定未經(jīng)任何處理的對照 細胞。用臺盼藍使細胞染色后，在顯微鏡下進行菌落計數(shù)。將HeLa及HepG2腫瘤細胞 系分散于軟瓊脂皿上作為陽性對照，隨后用LPA、ACI或LPA+ACI處理。同樣分析其菌 落形成。軟瓊脂皿中形成的菌落數(shù)繪制為平均數(shù)士標準偏差，每個測定重復至少三次。圖3是表示LPA及ACI對年輕細胞和衰老細胞中p21和細胞周期蛋白Dl表達的 影響的一組照片。具體地，a_f、g_l、m-r分別是表示如下結果的圖示傳代培養(yǎng)的年輕 細胞(PD 20 Y)和衰老細胞(PD 65 S)分別經(jīng)血清饑餓48小時，接著單獨用LPA (a_f) 和ACI (g_l)或同時用LPA及ACI (m-r)處理后，再培養(yǎng)1、2和4天，然后用4%過氧化 氫固定所述細胞，用p21wafl/Cipl(A)及細胞周期蛋白Dl(B)的抗體染色，隨后用免疫 熒光確認。這里，用DAPI染核。圖4是表示對AMPK在年輕細胞和衰老細胞以及年輕男性和衰老男性的背部皮 膚中表達水平的研究結果的一組照片。(A)是表示用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測AMPK α、 p-Thrl72-AMPKa、p-Ser485/49卜AMPK a、p53、p_Serl5_p53、p2lwafl/cipl R
β-肌動蛋白表達水平的結果的一組照片，所述檢測利用從傳代培養(yǎng)的年輕細胞(PD 20 Y)和衰老細胞(PD 64 S)中提取的45 μ g蛋白完成。(B)是表示傳代培養(yǎng)的年輕細胞(a，c, e, g，i)和衰老細胞(b，d，f， h，j)中蛋白表達水平的一組照片，所述細胞經(jīng)固定，并用抗-AMPKa(a，b)、 抗-p-Thrl72-AMPKa (c，d)、抗-抗-p_Ser485/491-AMPK a (e，f)、抗-p53(g，h) 及抗-P-Serl5-P53 (i，j)染色。這里，用DAPI染核。(C)是表示 AMPKa (a, b)、p_Thrl72_AMPKa (c，d)、p53(e, f)及 抗-P-Serl5-P53 (g，h)在一位10歲的男孩(a，c，e，f)及一位58歲的男性(b，d，f，
h)背部皮膚中表達水平的一組照片，該表達水平用如材料和方法中所述的免疫組織化學 進行檢測。每個實驗均重復了三次，得到了相同的結果。圖5是表示AICAR和AMPKI對年輕細胞和衰老細胞中的AMPK活化和細胞增
殖的影響的一組照片和曲線圖。(A)和(B)年輕細胞和衰老細胞經(jīng)血清饑餓2天后，用IOmMAMPK抑制劑AMPKI (A)或IOmMAMPK活化劑AICAR(B)處理4天。從處理過的細胞中提取蛋白， 用免疫印跡法檢測 AMPKa 禾口 p-Thrl72-AMPKa、總 p53、p_Serl5-p53 及 p21wafl/ cipl的水平。(C)和(D)用IOmM AMPKI或IOmM AICAR處理年輕細胞(C)和衰老
細胞(D)并培養(yǎng)4天，隨后用細胞計數(shù)測定細胞增殖。這里，所述實驗重復了三次(ρ < 0.001)。圖6是表示LPA及ACI對年輕細胞和衰老細胞中的AMPK及p53磷酸化的影響 的一組照片。(A)和(B)是表示免疫印跡結果的照片。具體地，用30 μ M LPA、或單獨或同 時用300 μ M LPA及ACI處理傳代培養(yǎng)的年輕細胞(PD 18 Α)和衰老細胞(PD 64 B), 隨后進一步培養(yǎng)1、2和4天。從培養(yǎng)的細胞中提取蛋白，用免疫印跡法對ΑΜΡΚα、 p-Thrl72-AMPKa、p_Ser485/491_AMPK a、p53、p_Serl5_p53、p2lwafl/cipl 及
β-肌動蛋白的水平定量。圖7是表示LPA及ACI對經(jīng)PKA抑制劑Rp_cAMP處理的衰老細胞中的AMPK
磷酸化的影響的一組照片。(A)和(B)是表示免疫印跡結果的照片。具體地，用IOmM的PKA抑制劑 Rp-cAMP預處理衰老細胞(PD 64) 1小時，隨后用LPA(A)或ACI (B)處理。培養(yǎng)所述 細胞1、2和4天后，從培養(yǎng)的細胞中提取蛋白，用45yg上述蛋白，用免疫印跡法對 AMPK a、p-Thrl72-AMPKa、p_Ser485/491_AMPK a、p53、p_Serl5_p53、p2 lwafl/ cipl及β -肌動蛋白的水平定量。圖8是表示LPA及ACI對衰老細胞中的LKBl磷酸化的影響的一組照片。具體 地，用30 μ M LPA、或單獨或同時用300 μ M LPA及ACI處理傳代培養(yǎng)的年輕細胞(PD 18)和衰老細胞(PD 64)。培養(yǎng)所述細胞1、2和4天后，從培養(yǎng)的細胞中提取蛋白，用 45yg上述蛋白，用免疫印跡法對LKB1、p-Ser431_LKBl及β -肌動蛋白的水平定量。圖9是表示LPA及ACI對衰老細胞中AMPK的活性調(diào)控的一組示意圖。(A)是表示LPA及ACI在年輕細胞中的影響的示意圖。用LPA處理年輕細胞 時，cAMP下調(diào)，PKA活性被抑制。因此，p_Ser485/491-AMPK活性誘導的AMPK活 性下降，導致AMP活性的下降。LPA同樣降低了依賴于PKA的LKBl的磷酸化。同 樣，它降低了 p_Thrl72-AMPK，使得AMPK失活，導致AMPK活化的抑制。同時，ACI 使cAMP/PKA減少，從而抑制p_Ser485/491-AMPK α的磷酸化。它使LKBl略微有所 活化。結果，p_Thrl72-AMPKa的磷酸化提高，導致AMPK的活化。在年輕細胞中， 細胞增殖事實上是被ACI降低的。(B)是表示LPA及ACI在衰老細胞中的影響的示意圖。用LPA處理衰老細胞 時，LPA提高了 cAMP的水平，使PKA活化。結果，AMPK α在Ser485/491位的磷 酸化提高，降低了 AMPK的活性，同時也降低了 p-Thrl72-AMPKa的磷酸化，降低了 AMPK的活性。另一方面，ACI并沒有改變p-Ser485/491-AMPKa的磷酸化，只降低 了 LKBl及LKBl的磷酸化。因此，ACI具有降低p_Thrl72_AMPKα的磷酸化從而降 低AMPK活性的作用。最佳實施方式本發(fā)明涉及一種包含LPA及ACI作為活性成分的、調(diào)控細胞衰老的組合物。
本發(fā)明還涉及一種調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用有效劑量的LPA和 ACI處理衰老細胞的步驟。本說明書中采用的術語“衰老(senescence)”與“老化(aging) ”的意思相 同。對于細胞，術語“年輕細胞”指的是衰老前的年輕細胞。除非另外說明，本發(fā)明 中使用的所有科技術語都應被理解為本領域技術人員所認可的常規(guī)含義。例如，本說 明書中所用術語均可在BenjaminLewin，Genes VII (牛津大學出版社(2000))及Kendrew 等，EncyclopediaofMolecular Biology (布萊克威爾科學出版公司(Blackwell Science Ltd.) (1994)中找到。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，適于本發(fā)明的細胞優(yōu)選來自于哺乳動物，包 括人、豬和牛，尤其更優(yōu)選為人細胞，特定地最優(yōu)選為人成纖維細胞。本發(fā)明的方法可應用于任何衰老細胞。但是，考慮到處理的效果，重要的靶 細胞為(a)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具備復制能力的那些細胞，如在阿爾茨海默氏癥、帕金森 氏癥、亨廷頓氏病及中風等與衰老相關的疾病中發(fā)揮重要作用的星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細 胞及成纖維細胞；(b)在外皮(integument)中具備有限復制能力的那些細胞，如在皮膚 萎縮、彈性組織離解、皺紋、皮脂腺增生、老年斑、頭發(fā)變白、脫發(fā)、慢性皮膚潰瘍及 與衰老相關的傷口愈合能力下降等與外皮衰老相關的疾病中發(fā)揮重要作用的成纖維細 胞、皮脂細胞、黑素細胞、角質(zhì)形成細胞、朗格漢斯細胞及濾泡細胞；(c)在關節(jié)軟骨 中具備有限復制能力的那些細胞，如在退行性關節(jié)病中發(fā)揮重要作用的軟骨細胞、間隙 (Iacunal)成纖維細胞及滑膜成纖維細胞；(d)在骨骼中具備有限復制能力的那些細胞， 如在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用的成骨細胞、間質(zhì)成纖維細胞及骨祖細胞；(e)在免疫系 統(tǒng)中具備有限復制能力的那些細胞，如在與衰老相關的免疫失常中發(fā)揮重要作用的B淋 巴細胞和T淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、NK細胞 及它們的前體細胞；(f)在血管系統(tǒng)中具備有限復制能力的那些細胞，如在動脈硬化、鈣 化、血栓及動脈瘤等與衰老相關的血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用的表皮細胞、平滑肌細 胞及外膜成纖維細胞；(g)在眼睛中具備有限復制能力的那些細胞，如在黃斑變性中發(fā) 揮重要作用的色素上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，單獨使用LPA處理衰老細胞時，胞內(nèi)的 cAMP水平增加。同時，單獨使用腺苷酸環(huán)化酶(ACI)處理時，年輕細胞和衰老細胞中 的下游信號轉(zhuǎn)導被PKA完全阻斷。ACI處理導致年輕細胞的細胞數(shù)減少，而衰老細胞的 細胞數(shù)增加。另外，ACI抑制衰老細胞中p21和細胞周期蛋白Dl的表達，促使細胞進入 S期，由此將衰老細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟贻p細胞樣的細胞。同時，相比LPA或ACI的單一處理， LPA和ACI的共同處理對于細胞增殖有更大的促進作用。該現(xiàn)象與年輕細胞中的現(xiàn)象并 不一 致。用LPA和ACI處理衰老細胞時，胞內(nèi)的AMPK活性下降，表明LPA和ACI分 別且不同地調(diào)控AMPK的活性，它們也不同地參與Thrl72-AMPKa的磷酸化。因此， LPA和ACI對衰老的調(diào)控與AMPK的活性相關。本發(fā)明調(diào)控細胞衰老的組合物及調(diào)控細胞衰老的方法中，可同時或不考慮順序 地逐步用LPA和ACI進行處理。用于調(diào)控細胞衰老的LPA和ACI的有效劑量分別為 1-50 μ M 和 1-500 μ Μ,更優(yōu)選為 30-50 μ M 和 200-300 μ Μ。所述腺苷酸環(huán)化酶抑制劑優(yōu)選選自于由2'，5' _雙脫氧腺苷、順式-Ν_(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三-1-烯-2-胺(MDL12，330A鹽酸鹽)和9-(四氫-2'-呋喃基) 腺嘌呤(SQ22536)組成的組，更優(yōu)選為9-(四氫-2'-呋喃基)腺嘌呤，但并不總是局 限于此。本發(fā)明的組合物可以包括適量的鹽及含pH調(diào)節(jié)劑的緩沖液，從而保持活性成分最高的生理活性。為了保持有效，本發(fā)明的活性成分可與分散劑或穩(wěn)定劑混合以進行給 藥。當本發(fā)明的組合物含有蛋白時，所述組合物可以包括藥學可接受的載體，所述 載體以下述物質(zhì)為例碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、 甘露糖醇、淀粉及纖維素等)、金合歡膠(acaciarubber)、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸 鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、鹽溶液、醇、阿拉伯膠、植物 油(如玉米油、棉籽油、大豆油、橄欖油及椰子油等)、聚乙二醇、甲基纖維素、羥基 苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油，但并不總是局限于此。本發(fā) 明的組合物可另外包括潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、芳香劑、乳化劑、懸浮劑及防腐劑， 但并不總是局限于此。本發(fā)明的組合物可采用任何藥學可接受的組合物可用的任何常規(guī)途徑進行給 藥，特別是經(jīng)皮給藥、經(jīng)口給藥或腸胃外給藥。腸胃外給藥以靜脈注射、皮下注射和肌 內(nèi)注射為例，優(yōu)選為肌內(nèi)注射。有效劑量的本發(fā)明的組合物可采用用于普遍認可的藥物組合物的任何方式進行 給藥，所述劑量依制劑方式、給藥途徑、年齡、體重、性別、健康狀況、飲食、給藥頻 率、給藥方式、排泄物及敏感度而改變，經(jīng)驗豐富的醫(yī)生可通過考慮預防或治療中的功 效來確定該有效劑量。本發(fā)明的組合物可以由本領域技術人員使用單位劑量形式或置于多劑量容器中 的藥學可接受的載體和/或賦形劑以容易實施的方法進行制劑。所述制劑可以是下述形 式溶液劑、懸浮劑、油或水溶性介質(zhì)中的乳劑、提取物、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊 齊U。這時，可以另外包含分散劑或穩(wěn)定劑。為了保持活性成分最高的生理活性，可以加 入包括適當含量的鹽及pH調(diào)節(jié)劑的緩沖液。本發(fā)明還涉及一種調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用本發(fā)明中含LPA及 ACI作為活性成分的組合物對需要調(diào)控細胞衰老的受試者進行給藥的步驟。通過將含LPA及ACI作為活性成分的組合物對目標受試者進行給藥，本發(fā)明用 于調(diào)控細胞衰老的方法在改善和治療與衰老相關的疾病中非常有效。另外，所述含LPA 和ACI的組合物及利用所述組合物處理靶細胞的調(diào)控細胞衰老的方法如上所述。此處的“與衰老相關的疾病”以下述疾病為例中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨 海默氏癥、帕金森氏癥、亨廷頓氏病及中風；外皮疾病，如皮膚萎縮、彈性組織離解、 皺紋、皮脂腺增生、老年斑、頭發(fā)變白、脫發(fā)、慢性皮膚潰瘍及與衰老相關的傷口愈合 能力下降；關節(jié)軟骨疾病，如退行性關節(jié)病及骨質(zhì)疏松癥；免疫系統(tǒng)疾?。谎芟到y(tǒng)疾 病，如動脈硬化、鈣化、血栓及動脈瘤；及眼病，如黃斑變性，但并不總是局限于此。本發(fā)明的目標受試者可以是任何包括人在內(nèi)的哺乳動物，優(yōu)選為人。用以下實施例對本發(fā)明實用的及目前優(yōu)選的實施方式進行說明。然而，應當明白，本領域的技術人員在考慮此公開時，能在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行變動和改進。實施例 1.材料用達爾伯克氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM: JBI)作為此處細胞培養(yǎng)的培 養(yǎng)基，從Sigma(圣路易斯，密蘇里，美國)購買LPA、碘化丙啶(PI)及臺盼藍。從 Gibco/BRL(卡爾斯巴德，加利福尼亞，美國)購買10%的胎牛血清(FBS)、青霉素及鏈 霉素(用于細胞培養(yǎng)的抗生素)。從Cell Signaling公司(貝弗利，馬薩諸塞，美國)購 買針對 AMPK a、p-Thrl72-AMPKa、p_Ser485/491_AMPK a、p53、p_Serl5_p53 及 p21WAFl/CIPl的多克隆抗體。從圣克魯斯(Santa Cruz)(加利福尼亞，美國)購買針對 β-肌動蛋白的多克隆抗體。從CalBiochem(圣地亞哥，加利福尼亞，美國)購買PKA抑 制劑Rp-cAMP和AC抑制劑ACI(SQ22536)。從Zymed(南舊金山，加利福尼亞，美國) 購買作為二抗的辣根過氧化物酶結合的抗兔IgG和抗鼠IgG。從Schleicher & Schuell (達 瑟爾，德國)購買用于免疫印跡的NC膜(硝化纖維素膜)。從皮爾斯_生物技術公司 (Pierce-Biotechnology)(羅克福德，伊利諾斯，美國)購買用于蛋白定量的BCA( 二喹啉 甲酸)和ECL (增強化學發(fā)光)套裝。從載體實驗室(Vector laboratories)(柏靈格姆，力口 利福尼亞，美國)購買用于免疫組化染色的Vectastain 精華抗生物素_生物素復合物試 劑盒。從DakoCytomation(卡平特里亞，加利福尼亞，美國)購買EnVision檢測系統(tǒng)。 從Biomeda(福斯特城，加利福尼亞，美國)購買自動化緩沖液。2.細胞培養(yǎng)通過對新生兒的包皮進行原代培養(yǎng)制備人成纖維細胞(Boyce和Ham，1983)。 在補充有10% FBS及抗生素的DMEM中完成所述原代培養(yǎng)。將傳代培養(yǎng)早期的群 體倍增(PD)值小于25的年輕細胞中的蛋白含量與PD值至少為65-70的衰老細胞中的 蛋白含量進行比較。衰老細胞比年輕細胞尺寸大，并且顯示出了形態(tài)學上的變化，它們 變得平坦且多核。在衰老細胞中，半乳糖苷酶的活性提高，細胞增殖減少(Yeo等， 2000)。用LPA和ACI處理之前，讓細胞在含DMEM的培養(yǎng)基中生長1_2天，使細胞達 至IJ60-70%的半?yún)R合(sub-confluence)狀態(tài)，然后通過在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的無 血清的培養(yǎng)基(SFM)中培育2天，使細胞血清饑餓至靜止期(也就是G0/G1停滯)。分 別用LPA、ACK LPA+ACI、AMPKI及AICAR處理年輕細胞和衰老細胞。在第1天、 第2天及第4天，用臺盼藍使細胞染色，對活細胞計數(shù)以確定細胞增殖。3.蛋白提取及免疫印跡為了分析蛋白的表達，用冷的裂解緩沖液(25mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸 (Hepes), pH8.0、150mMNaCl、ImM EDTA> ImMNa3VO4^ ImMNaF> 曲通 X-100 及蛋白酶抑制劑)裂解人成纖維細胞，隨后在4°C下以9000rpm的速度離心10分鐘以獲 取上清液。用BCL法對提取物中的蛋白定量。用等量(45 μ g)的蛋白進行SDS-PAGE 電泳以使蛋白分離。將分離的蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)印至NC膜上。通過用含5%脫脂奶粉 的 TTBS (含吐溫-20 的 Tris 緩沖鹽溶液，Tris Buffered Saline with Tween-20)對印跡(轉(zhuǎn) 印的NC膜)封閉1小時來阻斷非特異性蛋白的結合。然后，在4°C下用稀釋的一抗誘導 抗原-抗體反應過夜。用TTBS沖洗印跡，隨后在室溫下與用含5%脫脂奶粉的TTBS稀釋(1 5000)的辣根過氧化物酶結合的抗-IgG反應1小時。再次用TTBS沖洗印跡以 排除抗原_抗體的非特異性結合。用含過氧化物酶底物的ECL試劑盒(Pierce)將照片顯 影/定影于X光膠片(柯達)上以鑒定各個蛋白。4.免疫熒光染色 將蓋玻片置于24孔板上，該24孔板上分布著所需量的年輕細胞和衰老細胞。 去除培養(yǎng)基，用PBS沖洗經(jīng)處理的細胞兩次。然后，用4%的過氧化氫固定細胞。用 含2% BSA(封閉血清)的PBS阻斷非特異性蛋白的染色。用一抗例如抗-ΑΜΡΚα、 抗-p-Thrl72-AMPKa、抗-p-Ser485/491_AMPK a、抗-p53、抗-p_Serl5-p53、 抗-p21wafl/cipl及抗-細胞周期蛋白Dl使細胞染色。還加入DAPId 1000)以染核， 隨后在Zeiss LSM 510激光掃描顯微鏡下進行觀察。5.免疫組化染色對人皮膚進行活組織切片，用溶解于PBS (pH 7.4)的4% (wt/vol)福爾馬林固定 所得組織。將該組織浸于冷的10%的過氧化氫中過夜。然后，將所述組織包埋于石蠟 中，將其制成5-mm的切片。用二甲苯及乙醇完成脫蠟和水化。用700W的微波使載玻 片在IOmM檸檬酸鹽緩沖液中煮沸10分鐘。將所述載玻片浸于3%過氧化氫中15分鐘 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的作用，隨后沖洗載玻片。所述載玻片在5%封閉血清中反應 過夜以阻斷非特異性蛋白的染色。用一抗，例如抗-AMPKa、抗-p-Thrl72_AMPKa、 抗_p53及抗-p-Serl5-p53與所述載玻片以1 100的比例在室溫下反應1小時。將與 一抗反應后的載玻片沖洗三次，然后在室溫下與二抗反應30分鐘。這里，采用抗兔的抗 體(DakoCytomationEnVision檢測系統(tǒng))作為二抗。沖洗之后，使載玻片與HRP反應。 與HRP反應后，用DAB使載玻片染色。用乙醇使載玻片脫水，然后用二甲苯?jīng)_洗，接 著封片。用LeicaDEF 280顯微鏡(X200)給所述載玻片拍照。6.細胞周期分析用30 μ M LPA、300 μ M ACI> LPA+ACI、IOmM AMPKI 或 IOmMAICAR 處理
年輕細胞和衰老細胞，然后培養(yǎng)1、2和4天。為了分析細胞周期，用緩沖液沖洗細胞兩 次，用0.25%的胰蛋白酶離心所述細胞，隨后用冷的70%乙醇固定。用50mg/ml含RNA 酶(RNase)的PI，采用流式細胞術(BectonDickinsonFACSorter)進行分析。7.統(tǒng)計分析借助Graph-Pad Prism (GraphPad，圣地亞哥，加利福尼亞)完成統(tǒng)計分析。用T
檢驗驗證LPA處理組及LPA未處理組(1天/2天/4天)間的比較。這里，顯著性水平 設定為0.001。因此，當ρ <0.001時，認為具有統(tǒng)計學上的顯著性。結果1.LPA及ACI提高衰老細胞的增殖，并促使其進入S期LPA引起衰老細胞中細胞增殖和cAMP水平的提高(Yeo等，2002)。加入AC 抑制劑(ACI)以減少已被LPA增加的cAMP。然后研究細胞的增殖。用無血清的培養(yǎng) 基培養(yǎng)細胞2天以使細胞停滯在G0/G1期。接著，用LPA、ACI或LPA+ACI處理所述 細胞。在第1天、第2天及第4天測定總細胞數(shù)，或者對進入S期的細胞進行計數(shù)，以 評估細胞的增殖。與對照相比，用300 μ M的ACI處理年輕細胞時，細胞增殖降低(圖 1Α)。同時，與對照相比，用300μ M的ACI處理衰老細胞時，細胞增殖提高(圖1Β)。用LPA處理年輕細胞時，細胞增殖提高，而同時用LPA和ACI處理年輕細胞時，細胞增 殖被完全抑制。然而，相比單獨用LPA或ACI處理細胞，同時用LPA和ACI處理衰老 細胞時，細胞增殖顯著性提高(圖1B，ACI+LPA)。測定了進入S期的細胞數(shù)，結果顯示出對LPA和ACI類似的響應。衰老細胞 中，不僅是LPA和ACI的共同處理，就連ACI的單一處理都可以增加進入S期的細胞數(shù) (圖1C)。上述結果表明，ACI在年輕細胞和衰老細胞中的作用不同。也就是說，年輕 細胞中，只有LPA使細胞增殖提高，而在衰老細胞中，LPA和ACI都可以使細胞增殖提高。用LPA及ACI處理成纖維細胞和腫瘤細胞組后，進行軟瓊脂分析。結果表明， 與腫瘤細胞系中不同，LPA或ACI的處理在成纖維細胞中不會形成任何菌落(圖2)。上 述結果證實了 LPA和ACI誘導正常細胞增殖，但不會導致細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤的任何轉(zhuǎn)化。2.LPA及ACI引起的衰老細胞中p21及細胞周期蛋白Dl的下調(diào)p21和細胞周期蛋白Dl是維持pRb低磷酸化形式的重要蛋白(Noda等，1994)， 而已知pRb的低磷酸化形式抑制細胞增殖，并阻止細胞進入S期(Atadja等，1995 ； Stein等，1999)，p21和細胞周期蛋白Dl在衰老細胞中顯著性地上調(diào)。用30 μ M LPA、 300 μ M ACI或LPA+ACI處理細胞4天后，用免疫熒光檢測p21和細胞周期蛋白Dl的表 達(圖3A)。結果表明，單獨用ACI或用LPA+ACI處理年輕細胞時，在第2天和第4 天，p21的表達提高(圖3A)。同時，用ACI處理衰老細胞時，在第2天和第4天，p21的表達下降。用ACI 處理衰老細胞時，在第4天，大部分細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟贻p細胞樣的細胞。顯微鏡觀察同樣證 實了，與對照相比，所述年輕細胞樣的細胞增加了(未經(jīng)處理的衰老細胞尺寸較大，所 以相比經(jīng)過處理的衰老細胞，顯微鏡下只能觀察到較少的細胞)。與僅用ACI處理相比， 同時用LPA及ACI處理衰老細胞時，p21的表達顯著下降。細胞周期蛋白D 1也是如此 (圖3B)。這些結果表明，p21及細胞周期蛋白Dl水平與進入S期相關。因此，用ACI 處理衰老細胞時，p21及細胞周期蛋白Dl的表達下降，由此增加了衰老細胞中的DNA合 成，從而誘導細胞增殖。3.衰老細胞及老年人背部皮膚細胞中AMPK的活性在細胞衰老中，眾所周知AMP:ATP比值的上升誘導AMPK的活化(Wang等， 2003)。p53是活化的AMPK的底物。AMPK誘導Serl5的磷酸化，這對p21的表達 十分關鍵(Jones等，2005)。在本實施例中，通過免疫印跡來確認體現(xiàn)AMPKa活性 的Thrl72-AMPKa的磷酸化，以此來比較年輕細胞和衰老細胞中AMPK的活性(圖 4A)。還用免疫印跡測定降低AMPK活性的Ser485/491-AMPK的磷酸化以及p53、 p-Serl5-p53、p21 和 β-肌動蛋白。結果表明，p_Thrl72_AMPK a、p53、p-Serl5-p53 及p21在年輕細胞中的表達低。但是，在衰老細胞中，Thrl72-AMPKa的磷酸化，即 AMPK的活化形式有所增加，而Ser485/491-AMPKa的磷酸化，即AMPK的失活形式有 所降低。然而，隨著衰老，AMPK的總量并未改變。衰老細胞中，p53在Serl5位的磷 酸化及p21的表達提高，表明其中的AMPK被活化了。用共聚焦顯微鏡研究年輕細胞和衰老細胞中p-Thrl72_AMPKa、 p-Ser485/491-AMPK α及p-Serl5_p53的表達(圖4B)。 無論是否磷酸化，發(fā)現(xiàn)大部分AMPK都存在于細胞質(zhì)中，不過有時也能在核中觀察到。相比年輕細胞， 衰老細胞中Thrl72-AMPKa的磷酸化提高。然而，相比年輕細胞，衰老細胞中 Ser485/491-AMPKα的磷酸化下降。主要在細胞質(zhì)中觀察到了 p53，但Serl5_p53的磷 酸化是在衰老細胞的核內(nèi)檢測到的。
年輕人及老年人背部皮膚組織的免疫染色證實了 AMPK的磷酸化及活化不僅在 年輕細胞中有所提高，在衰老細胞中也有所提高(圖4C)。年輕人及老年人背部皮膚組織 中AMPKα及p53的表達沒有差異。然而，衰老的背部皮膚組織中，p_Thrl72_AMPKa 增加，而年輕的背部皮膚組織中，p_Serl5-p53增加。上述結果表明，活化的AMPK和 p53的表達在衰老的受試者中提高，且發(fā)現(xiàn)主要存在于核內(nèi)。
4.衰老細胞的增殖通過AMPK的活化調(diào)控為了研究AMPK的活化是否能抑制衰老細胞的增殖，用AMPK活化抑 制劑AMPKI及AMPK活化促進劑AICAR處理細胞(圖5)。 然后，檢測其中 p-Thrl72-AMPK a、p-Serl5-p53 和 p21 的表達。用 AMPK a、p53 禾口 β -肌動蛋白作 為對照。AMPKI并未影響年輕細胞中p-Thrl72-AMPKa、p-Serl5-p53和p21的表達 (圖5A)。但是，年輕細胞中p-Serl5-p53和p21的表達水平低。AMPKI完全消除了衰 老細胞中上述蛋白的增加。與AMPKI不同，AICAR反而使衰老細胞中的上述蛋白有所 增加(圖5B)。這就表明AMPK提高了衰老細胞中p21的活性，由此減少細胞增殖，而 AICAR增加了年輕細胞中的AMPK，從而使得細胞增殖減少，AMPKI抑制了衰老細胞中 的AMPK，使p21的表達下調(diào)，從而使得細胞增殖增加。如圖5C及圖5D所示，AMPKI使得年輕細胞和衰老細胞中的細胞增殖均有所提 高。同時，AICAR抑制了兩種細胞中的細胞增殖。所以，當AMPK被活化時，年輕細 胞和衰老細胞中的細胞增殖均被抑制。因此，這一點便很清楚了，即AMPKI通過降低 AMPK失活所介導的Serl5-p53磷酸化和p21表達來促進衰老細胞增殖(圖5D)。另一 方面，AICAR通過提高AMPK活化所介導的p53磷酸化和p21表達來抑制年輕細胞和衰 老細胞中細胞增殖。5.LPA及ACI引起的年輕細胞和衰老細胞中AMPK的不同磷酸化模式LPA及ACI提高衰老細胞的增殖。同時，本實施例證實了這些物質(zhì)對 AMPK的磷酸化有影響，從而控制其活性。當用LPA處理年輕細胞時，在第4天， Thrl72-AMPKa和Ser485/491-AMPKα的磷酸化都有所下降(圖6A)。LPA處理并 未改變β _肌動蛋白(對照)和AMPK的水平。無法檢測p-Serl5-p53和p21的水平 (主要由于年輕細胞中所述蛋白的表達非常低)。用LPA處理衰老細胞時，在第4天， Thrl72-AMPKa的磷酸化下降，但Ser485/491_AMPKα的磷酸化逐漸提高(圖6B)。 同樣證實了用LPA處理衰老細胞時，p-Serl5-p53和p21的表達下降。如上所述，用LPA處理年輕細胞時，AMPK的活性下降，但直至第4天仍能檢 測到。然而，用LPA處理衰老細胞時，AMPK的活性逐漸下降，到第4天就幾乎被抑制 了。同樣證實了 LPA使年輕細胞和衰老細胞中的細胞增殖提高。同時，用ACI處理年 輕細胞時，1天后Thrl72-AMPKa的磷酸化就開始提高，但Ser485/491_AMPK α的磷 酸化下降。無法證實年輕細胞中Serl5_p53和p21的表達(主要是所述蛋白在年輕細胞中的表達非常低)。在衰老細胞中，ACI并不影響Ser485/491-AMPKa的磷酸化，但它降低 了 Thrl72-AMPKa的磷酸化。此外，用ACI處理衰老細胞時，Serl5_p53的磷酸化和 p21的表達都有所下降。如上所述，在年輕細胞中，ACI提高AMPK的活性，由此抑制細胞增殖。然 而，在衰老細胞中，ACI降低AMPK的活性，由此使細胞增殖提高。用LPA和ACI共同處理年輕細胞時，觀察到了與用ACI單一處理相同的蛋白表 達模式。具體地，用LPA和ACI共同處理年輕細胞時，Thrl72-AMPKa的磷酸化提高， 但用它們共同處理衰老細胞時，Thrl72-AMPKa的磷酸化下降。因此，證實了衰老細胞 增殖的提高是由AMPK活性的下降導致的，而AMPK的活性下降可引起p53的磷酸化及 p21表達的下調(diào)。如上所述，AMPK活性的抑制對于增加衰老細胞的增殖十分重要。這可以通過 調(diào)控AMPK各個區(qū)域的磷酸化來實現(xiàn)。6.PKA與衰老細胞中LPA引起的AMPK抑制相關過去的研究證實了依賴于PKC的AC同種型(AC2/4/6)的表達在衰老細胞中 得到提高，從而使它的活性增加，結果導致cAMP上調(diào)，由此提高了依賴于cAMP的激 酶PKA的活性(Jang等，2006b ； Rhim等，2006)。此外，在抑制AMPK活性中發(fā)揮 一定作用的Ser485/591的磷酸化受到PKA活性的調(diào)控(Hurley等，2006)，PKA介導的 Ser485/591的磷酸化最終抑制了 Thrl72-AMPKa的磷酸化。基于該事實，進一步研究 了 PKA信號轉(zhuǎn)導是否也在衰老細胞中發(fā)揮重要作用。為完成該研究，在實驗前用PKA 抑制劑Rp-cAMP預處理衰老細胞1小時(圖7)。如圖7A所示，抑制PKA后，用LPA處理衰老細胞時，p_Thrl72_AMPKa、 p-Ser485/491-AMPKa、p_Serl5-p53及p21的表達完全沒有改變。該結果表明，PKA 在Ser485/491磷酸化提高介導的上游信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著重要作用，所述Ser485/491磷酸 化的提高與LPA介導的AMPK活性的調(diào)控相關。如圖7B所示，抑制PKA后，用ACI處理衰老細胞時，p_Ser485/491的表達沒 有改變，而 p_Thrl72-AMPKa、p_Thrl72_AMPK a、p_Serl5-p53 及 p21 的表達也沒有改變。上述結果表明，ACI在阻斷PKA介導的下游信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著一定作用。也就 是說，在衰老細胞中，PKA在調(diào)控ACI介導的AMPK的活性中也發(fā)揮著重要的作用。7.腫瘤抑制子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶LKBl的Ser431的磷酸化狀態(tài)受LPA調(diào) 控，且衰老細胞中LKBl的蛋白表達被ACI降低。近期發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制基因LKB1是AMPKK家族的成員(Hawley等，2003 ； Shaw等，2004 ； Woods等，2003a)。Ser431_LKBl的磷酸化以LKBl的活化形式促進細 胞生長(Sapkota等，2001)。所以，本實驗考 察了 LPA及ACI的單一處理或共同處理對 p-Ser431-LKB1、LKBl及β -肌動蛋白的表達有何影響(圖8)。用LPA處理年輕細胞 時，Ser431-LKB1的磷酸化逐漸下降。同時，其中的LKBl的表達沒有變化。另一方 面，用LPA處理衰老細胞時，Ser431-LKB1的磷酸化逐漸提高。ACI提高了年輕細胞中Ser431-LKB1的磷酸化，卻逐漸降低了衰老細胞中LKBl 及Ser431-LKB1的磷酸化。LPA和ACI的共同處理得到了與ACI單一處理相同的結果。
討論 用LPA處理衰老細胞時，cAMP上調(diào)。于是利用AC抑制劑(SQ22536)使cAMP
下調(diào)研究了 cAMP對衰老細胞中細胞增殖的影響。有意思的是，ACI完全抑制了年輕細 胞和衰老細胞中PKA的活性。另外，ACI減少了年輕細胞的數(shù)量，卻增加了衰老細胞的 數(shù)量。ACI降低了衰老細胞中兩種細胞周期抑制劑p21及細胞周期蛋白Dl的表達，依此 推測進入S期的細胞數(shù)增加了(Atadja等，1995; Stein等，1999)。同樣證實了 ACI使 許多衰老細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟贻p細胞樣的細胞。用LPA和ACI共同處理年輕細胞時，我們無法 觀察到用LPA單獨處理時所觀察到的現(xiàn)象，例如細胞增殖的增加、進入S期的促進及p21 和細胞周期蛋白Dl表達的下降。同時，相比單獨用LPA或ACI處理，用LPA和ACI共 同處理衰老細胞更加有效地誘導了細胞增殖。推測衰老細胞中DNA合成及細胞增殖的增 加是由ACI介導的p21及細胞周期蛋白Dl表達的下降所引起。本實驗中，證實了 LPA 在年輕細胞和衰老細胞中均誘導了細胞增殖，而ACI抑制年輕細胞中的細胞增殖，卻提 高衰老細胞中的細胞增殖。AMPK通過調(diào)控正常細胞和腫瘤細胞中的各種細胞活動來抑制細胞增殖 (Motoshima等，2006)。另夕卜，細胞衰老時，AMPK被活化(Wang等，2003)。有報導 指出AMPK的活性可能是通過控制衰老細胞中p21的表達及p53的Serl5位的磷酸化來抑 制細胞周期(Jones等，2005)。因此，對AMPK活化的持續(xù)性誘導加快了依賴于p53的 細胞衰老。本實驗是基于以下假設完成的用LPA或ACI處理成纖維細胞時，它調(diào)控了 AMPK的活性，從而控制了細胞增殖。結果便證實了在衰老細胞及老年人背部皮膚組織 中，由Thrl72-AMPKa的磷酸化評定的AMPK的活化、p53的Serl5位的磷酸化及p21 的表達均有所提高。已經(jīng)證實LPA在年輕細胞和衰老細胞中均使AMPK的活化下降。所述AMPK活 化的下降可能在年輕細胞和衰老細胞中依賴于LPA的細胞增殖的增加中發(fā)揮一定作用。 在衰老細胞中，LPA降低了 p-Serl5-p53及p21的表達，以釋放停滯于G0/G1期的細胞周 期。單獨用ACI或與LPA —起處理年輕細胞時，其中的AMPK的活化提高。相反，所 述處理使衰老細胞中AMPK的活化下降，表明ACI減少年輕細胞的增殖，而提高衰老細 胞的增殖。本實驗證實了 LPA及ACI在年輕細胞和衰老細胞中以不同的方式調(diào)控AMPK 的活化，因此它們不同地影響細胞增殖。AMPK的活性可受到數(shù)種AMPKK介導的多位點磷酸化的調(diào)控(Hurley等， 2006)。為了證實LPA及ACI不同地調(diào)控AMPK的多位點磷酸化的假設，測定了活 化的AMPK形式即磷酸化的Thrl72-AMPKa的水平以及失活的AMPK形式即磷酸化 的Ser485/491-AMPKa的水平。LPA降低了在年輕細胞和衰老細胞中活化AMPK的 Thrl72-AMPKa的磷酸化，而ACI提高了年輕細胞中Thrl72_AMPK α的磷酸化，從而 活化了 AMPK，卻降低了衰老細胞中Thrl72-AMPKa的磷酸化，使AMPK失活。由此 證實了 LPA及ACI以不同的方式調(diào)控AMPK的活性，所以它們對于年輕細胞和衰老細胞 中細胞增殖的影響也不同。Ser485/491的磷酸化抑制Thrl72的磷酸化。因此，這表明 了當LPA使衰老細胞中Ser485/491的磷酸化提高時，AMPK的活性就下降了。單獨用ACI或與LPA —起處理年輕細胞時，Ser485/491-AMPK α的磷酸化下 降，導致AMPK的活性提高，表明年輕細胞中的細胞增殖被抑制。用ACI處理衰老細胞時，Ser485/491-AMPK α的磷酸化沒有改變，但ACI自身抑制了 Thr 172的磷酸化，最終 導致AMPK活性的下降。所述結果表明ACI在衰老細胞中具有不同的抑制AMPK活性 的機制。 與LPA不同，確信ACI調(diào)控AMPKK以控制AMPK的活性，從而控制細胞增 殖。在嚴重能量缺乏或其它艱苦的條件下，ACI活化LKBl以誘導Thrl72-AMPK的磷 酸化(Hawley等，2003; Shaw等，2004; Woods等，2003a)。當胞內(nèi)鈣水平升高時， Thrl72-AMPK的磷酸化也可通過鈣/鈣調(diào)蛋白酶來提高，這也可導致AMPK的活化 (Hawley 等，2005 ； Hong 等，2005 ； Hurley 等，2005 ； Woods 等，2005)。AMPK 的自 磷酸化位點Ser485/491在通過外加刺激或胞內(nèi)能量缺乏來抑制AMPK的活化上也發(fā)揮著 一定作用(Hurley等，2006)。Ser485/591位點也被由胰島素刺激所活化的Akt/PKB磷 酸化(Beauloye 等，2001 ； Gamble 和 Lopaschuk，1997 ； Kovacic 等，2003 ； Witters 禾口 Kemp, 1992)，該位點也被由那些增加cAMP的藥物所活化的PKA磷酸化(Hurley等， 2006)。在眾多上游信號中，本實驗主要關注兩種蛋白磷酸化激酶PKA和LKB1。LKBl與如STRAD (STE20相關銜接子)α / β及Μ025 (小鼠蛋白25) α / β的 輔助蛋白形成復合物，該復合物提高了 LKBl的活性。已知LKB1/STRAD/M025復合 物是一種存在于AMPK/TSC2/mTOR通路上游的激酶(Hawley等，2003; Milburn等， 2004)。目前已廣為認知LKBl的活性受到Ser431的磷酸化及4個其它不同區(qū)域(Ser31、 Ser325、Thr336 及 Thr366)的磷酸化調(diào)控(Sapkota 等，2002 ； Sapkota 等，2001)。相比衰 老細胞，主要在年輕細胞中Ser431-LKB1的磷酸化提高，導致LKBl的活化。活化的 LKBl可以是阻斷年輕細胞的細胞增殖的一個原因，所述年輕細胞由于AMPK及p53的 活化以及由此引起的p21表達的上調(diào)而停滯于分裂間期(resting phase)。用LPA處理年 輕細胞時，LKBl自身的水平?jīng)]有受到影響，但Ser431-LKB1的磷酸化水平逐漸下降。 LKBl活性的下降引起年輕細胞中Thrl72-AMPKa磷酸化的下降，導致AMPK活性的 下降。對于ACI而言，它提高了 Ser431-LKB1的磷酸化，由此提高了年輕細胞中磷酸 化的Thrl72-AMPKa的水平。ACI使年輕細胞中的PKA失活，從而使得依賴于PKA 的Ser485/491 a的磷酸化下降。有趣地，與年輕細胞中不同，ACI降低了衰老細胞中總 LKBl及磷酸化的LKBl的水平。LKBl磷酸化的抑制也許會導致p_Thrl72_AMPK a、 p-Serl5-p53及p21表達的抑制。ACI使衰老細胞中的PKA失活。于是，依賴于PKA的Ser485/491-AMPK的 磷酸化及Ser431-LKB1的磷酸化也降低了。用LPA和ACI共同處理細胞時，LKBl及 LKBl磷酸化的模式與僅用ACI單一處理的情況類似，但影響比單獨用ACI處理時要小。PKA 是直接誘導 Ser485/491-AMPK 磷酸化(Hurley 等，2006)或通過 LKBl 的磷酸化間接誘導Thrl72-AMPK磷酸化(Collins等，2000; Sapkota等，2001)的上游 激酶。因此，由LKBl磷酸化介導的AMPK的活化可以通過控制LPA和ACI引起的 PKA的活化來調(diào)控。用LPA處理年輕細胞時，cAMP下調(diào)，由此導致PKA活性的下 降(Jang等，2006b)。也就是說，LPA使年輕細胞中Ser485/491_AMPK α的磷酸化下 降。然而，LPA活化了衰老細胞中的PKACTang等，2006a)。 因此，依賴于PKA的 Ser485/491-AMPK α的磷酸化也提高了，導致Thrl72_AMPK α磷酸化的下降。用PKA 抑制劑處理衰老細胞時，LPA所誘導的p-Thrl72-AMPKa、p-Ser485/491_AMPK a、p-Serl5-p53及p21表達的變化全都被完全阻斷。這就表明了 PKA可以是一種通過提高 Ser485/491-AMPK α的磷酸化使APMK失活的主要的上游蛋白?？偠灾?，LPA降低 了年輕細胞中Ser431-LKB1的磷酸化，但卻提高了衰老細胞中Ser431_LKBl的磷酸化。 所以，在年輕細胞中，LPA導致依賴于LKBl的Thrl72-AMPKa的磷酸化下降，但卻 提高了衰老細胞中依賴于LKBl的Thrl72-AMPK α的磷酸化。用PKA抑制劑處理衰老 細胞時，PKA失活，由此導致ACI誘導的p-Thrl72-AMPKa、p-Serl5_p53及p21表達 的下降被阻斷，表明PKA是一種與依賴于ACI的AMPK失活相關的重要的上游蛋白。 PKA使另一種上游激酶CaMKKs磷酸化，引起AMPKK活性的抑制，表明它間接地調(diào)控 Thrl72-AMPKa的磷酸化。因此，AMPK的活性可由PKA、LKBl及CaMKKs作為一 個整體的活性的變化來調(diào)控。不僅可以利用通過腎上腺素受體的激素刺激，還可以 利用如運動和禁食的生理刺激來活化PKA (Cohen和Hardie，1991)和AMPK (Kahn等， 2005 ； Long 和 Zierath, 2006)。AMPK信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)包括很多腫瘤抑制基因，如LKB1、p53、TSCl或TSC2，
這些基因發(fā)揮著代謝調(diào)控開關的作用，抑制各種刺激引起的生長因子的信號轉(zhuǎn)導。過 去的研究指出，AMPK的活化可以作為治療起源于細胞衰老及增殖的與衰老相關的疾病 (如動脈硬化、胰島素耐受和腫瘤)的靶標(Igata等，2005 ； Luo等，2005 ； Motoshima 等，2006; Shaw等，2004)。AICAR介導的AMPK的活化誘導如人血管平滑肌細胞的正 常細胞或腫瘤細胞中的細胞周期停滯。在血管平滑肌細胞中，AICAR提高p53的蛋白水 平及Serl5-p53的磷酸化，從而使得細胞停滯于G0/G1期，表明進入S期或G2/M期的細 胞數(shù)減少(Igata等，2005)。在腫瘤細胞中，AICAR使細胞停滯于S期，于是伴隨p21、 p27及p53表達的提高，AICAR抑制了腫瘤細胞的增殖(Rattan等，2005)。本實驗證實 了 AICAR通過活化AMPK抑制年輕細胞和衰老細胞中的細胞增殖。AICAR同樣提高了 年輕細胞和衰老細胞中p-Thrl72-AMPKa、p53、p_Serl5-p53及p21的表達，導致細胞 增殖的抑制。同時，AMPKI增加了年輕細胞和衰老細胞中的細胞增殖。通過用AMPKI 處理衰老細胞抑制AMPK的活化后，p-Thrl72-AMPK、p53、p_Serl5-p53及p21的表達 下降，于是不僅觀察到細胞增殖，還觀察到形態(tài)學上轉(zhuǎn)變?yōu)槟贻p細胞樣的細胞。因此， 這就證實了 AMPK活化的抑制對于防止由LPA及ACI引起的細胞衰老十分關鍵?？偠灾緦嶒炋峁┝?一種用于解釋LPA及ACI在衰老細胞中不同地調(diào) 控AMPK活性的模型(圖9)。AMPK的活性α亞基含有兩個主要的磷酸化位點， 即 a-Thrl72 和 a _Ser485/491。Thrl72_AMPKa 被磷酸化時，AMPK 的活性提高， 而當Ser485/491-AMPKa被磷酸化時，Thrl72_AMPKa的磷酸化下降，因此導致 AMPK的活性被抑制。用LPA處 理年輕細胞時，胞內(nèi)cAMP下調(diào)，PKA被抑制，引 起Ser485/491-AMPK α的磷酸化下降(圖9A)。然而，在年輕細胞中，LPA使依賴于 PKA的LKBl的磷酸化降低，由此降低Thrl72-AMPK α的磷酸化。于是，AMPK失 活，細胞增殖提高。ACI抑制cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，由此降低Ser485/491_AMPK a 的磷酸化，引起AMPK的活化。同樣，ACI輕微提高了 LKBl的活性，由此誘導了 Thrl72-AMPKa的磷酸化，從而活化AMPK。用LPA處理衰老細胞時，胞內(nèi)cAMP上 調(diào)，PKA被活化，從而引起Ser485/491-AMPKa的磷酸化提高，但Thrl72_AMPK a 的磷酸化下降，導致AMPK失活，細胞增殖增加(圖9B)。相反，ACI并未改變Ser485/491-AMPKα的磷酸化，而是通過LKBl表達的下降介導了 Thrl72_AMPKa磷 酸化的下降，于是它最終使得AMPK失活，由此誘導細胞增殖。本發(fā)明證實了不僅是年 輕細胞，衰老細胞也具有細胞增殖的能力，LPA及ACI不同地調(diào)控AMPK各個位點的磷 酸化以抑制AMPK的活性，這能誘導衰老細胞增殖。本領域技術人員應當了解，可以很容易地以上述說明書中公開的概念和具體的 實施方式為基礎進行修改或設計其它實施方式以實現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。本領域技術 人員還應當了解，此類等同的實施方式并不背離所附權利要求中提出的本發(fā)明的精神和 范圍。參考文獻 l.An S, BleuT, Hallmark OG, Goetzl EJ (1998) Characterization of anovel subtype of human G protein-coupled receptor for lysophosphatidic acid.JBiol Chem 273, 7906-7910.2.Atadja P, Wong H, Veillete C, Riabowol K(1995) Overexpression ofCyclin Dl Blocks Proliferation of Normal Diploid Fibroblasts.ExperimentalCell Research 217, 205.3.Beauloye C, Marsin AS，Bertrand L, Krause U，Hardie DG.，Vanoverschelde JL, Hue L (2001) Insulin antagonizes AMP—activated proteinkinase activation by ischemia or anoxia in rat hearts, without affecting totaladenine nucleotides.FEBS Letters 505, 348.4.Boyce ST, Ham RG (1983) Calcium-regulated differentiation ofnormal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal cultureand serum—free serial culture.J Invest Dermatol 81, 33s_40s.5.Cohen P, Hardie DG (1991) The actions of cyclic AMP onbiosynthetic processes are mediated indirectly by cyclic AMP-dependentprotein kinase.Biochim Biophys Acta 1094, 292-299.6.Collins S P, Reoma JL, Gamm DM, Uhler MD (2000) LKBl，a novelserine/threonine protein kinase and potential tumour suppressor, isphosphorylated by cAMP-dependent protein kinase (PKA) and prenylated invivo.Biochem J 345 Pt3, 673-680.7.Gamble J，Lopaschuk GD (1997) Insulin inhibition of 5' adenosinemonophosphat e-activated protein kinase in the heart results in activation ofacetyl coenzyme A carboxylase and inhibition of fatty acid oxidation.Metabolism 46, 1270.8.Hahn-Windgassen A, Nogueira V, Chen CC, Skeen JE, Sonenberg N, Hay N (2005) Akt activates the mammalian target of rapamycin by regulatingcellular ATP level and AMPK activity.J Biol Chem 280，32081-32089.9.Hawley SA, Boudeau J, Reid JL，Mustard KJ，Udd L，Makela TP, Alessi DR, Hardie DG (2003) Complexes between the LKBl tumorsuppressor, STRAD alpha/beta and M025 alpha/beta are upstream kinases inthe AMP-activated protein kinase cascade. 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權利要求
1.一種用于調(diào)控衰老細胞中細胞衰老的組合物，所述組合物含腺苷酸環(huán)化酶抑制劑 及溶血磷脂酸作為活性成分。
2.如權利要求1所述的組合物，其中，所述腺苷酸環(huán)化酶抑制劑選自于由2'， 5' _雙脫氧腺苷、順式-N_(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三-1-烯-2-胺和9-(四氫-2'-呋 喃基)腺嘌呤組成的組。
3.如權利要求1所述的組合物，其中，所述溶血磷脂酸的有效劑量為1-50μ M。
4.如權利要求1所述的組合物，其中，所述腺苷酸環(huán)化酶抑制劑的有效劑量為 1-500 μ Μ。
5.如權利要求1所述的組合物，其中，所述衰老細胞來自于人細胞。
6.一種調(diào)控細胞衰老的方法，所述方法包括用有效劑量的腺苷酸環(huán)化酶抑制劑及溶 血磷脂酸處理衰老細胞的步驟。
7.如權利要求6所述的調(diào)控細胞衰老的方法，其中，所述腺苷酸環(huán)化酶抑制劑選自于 由2'，5'-雙脫氧腺苷、順式-N-(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三-1-烯-2-胺和9-(四 氫-2'-呋喃基)腺嘌呤組成的組。
8.如權利要求6所述的調(diào)控細胞衰老的方法，其中，所述溶血磷脂酸的有效劑量為 1-50 μ Μ。
9.如權利要求6所述的調(diào)控細胞衰老的方法，其中，所述腺苷酸環(huán)化酶抑制劑的有效 劑量為1-500 μ M0
10.如權利要求6所述的調(diào)控細胞衰老的方法，其中，所述衰老細胞來自于人細胞。
11.一種對需要調(diào)控細胞衰老的受試者的細胞衰老進行調(diào)控的方法，所述方法包括用 有效劑量的腺苷酸環(huán)化酶抑制劑及溶血磷脂酸對所述受試者進行給藥的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用AC抑制劑和LPA抑制AMPK，從而誘導衰老的人成纖維細胞的細胞增殖的分子機制。具體地，本發(fā)明涉及一種含LPA和ACI作為活性成分的組合物，本發(fā)明利用所述組合物證明了LPA和ACI調(diào)控AMPKα的不同磷酸化，由此導致p53失活，誘導衰老細胞的增殖。該結果支持了AMPK信號轉(zhuǎn)導在衰老細胞的細胞增殖中發(fā)揮著重要作用的事實。
文檔編號C12Q1/00GK102026642SQ200880129179
公開日2011年4月20日 申請日期2008年5月14日 優(yōu)先權日2008年5月14日
發(fā)明者呂義珠, 樸相哲, 林志憲 申請人:財團法人首爾大學校產(chǎn)學協(xié)力財團