注射用多種維生素中溶血磷脂含量測(cè)定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物中溶血磷脂含量測(cè)定的方法，具體的說(shuō)涉及一種多組分樣品中溶 血磷脂含量測(cè)定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 注射用多種維生素（12)為十二種維生素混合物的無(wú)菌凍干品，適用于經(jīng)胃腸道營(yíng) 養(yǎng)攝取不足者，為靜脈補(bǔ)充維生素用藥。在生產(chǎn)工藝中使用大豆磷脂作為增溶劑，大豆磷脂 可能會(huì)發(fā)生部分水解產(chǎn)生溶血磷脂，產(chǎn)生的溶血磷脂是一類(lèi)具有較強(qiáng)表面活性的物質(zhì)，有 溶血或溶解細(xì)胞膜的作用，因此有必要建立測(cè)定溶血磷脂含量的方法，以保證臨床用藥的 安全性。
[0003] 溶血磷脂的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法和高效液相色譜法，其中薄層色譜法適用 于限度檢查，高效液相色譜法適用于定量分析。目前，除大容量脂肪乳注射液外，多數(shù)含有 卵磷脂和大豆磷脂的乳狀注射劑的質(zhì)量控制方法中并無(wú)溶血磷脂檢測(cè)項(xiàng)。脂肪乳注射液中 測(cè)定溶血磷脂采用高效液相色譜法，以蒸發(fā)光散射儀為檢測(cè)器，正己烷-異丙醇-水為流動(dòng) 相，進(jìn)行梯度洗脫，溶血磷脂可與主成分完全分離。
[0004] 脂肪乳注射液測(cè)定溶血磷脂時(shí)，其處理方法為采用正庚烷-異丙醇混合溶液破乳 稀釋后直接進(jìn)樣。其他品種測(cè)定溶血磷脂的處理方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。而注射用多種維生素 (12)成分較復(fù)雜，其中多種脂溶性、水溶性維生素及輔料對(duì)溶血磷脂測(cè)定存在嚴(yán)重干擾，樣 品稀釋后直接進(jìn)樣的方法不適用于注射用多種維生素（12)中溶血磷脂的測(cè)定。因此需要 尋找一種新的樣品處理方法，除需破壞膠束以萃取溶血磷脂，還需將溶血磷脂與其他組分 分離，以避免干擾。
[0005] 注射用多種維生素（12)為凍干粉末，易溶于水且難溶于有機(jī)溶劑；注射用多種維 生素（12)是采用甘氨膽酸/磷脂混合膠束系統(tǒng)溶解脂溶性維生素，需要選擇合適的膠束破 壞方法，使溶血磷脂完全溶出，以保證測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。破壞膠束可采用加熱、稀釋、超 聲、加入無(wú)機(jī)離子或有機(jī)溶劑等方法。本品中大豆磷脂在加熱條件下可降解產(chǎn)生溶血磷脂； 如采用稀釋的方式破壞膠束，會(huì)極大程度地降低供試品濃度，不利于微量雜質(zhì)的檢測(cè)；常用 超聲儀不能有效破壞膠束；溶血磷脂無(wú)顯著紫外吸收，采用蒸發(fā)光檢測(cè)的樣品溶液中不能 加入非揮發(fā)性的無(wú)機(jī)鹽；但本品中多種水溶性維生素難溶于有機(jī)溶劑，如甲醇、異丙醇、乙 腈等有機(jī)試劑亦不適合。
[0006] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)可采用以有機(jī)溶劑的水溶液破壞膠束后，再萃取分離的方法處理供試 品。該方法的主要難點(diǎn)在于：需選擇適宜溶劑，既能溶解樣品，又具有破壞膠束的效果；需 選擇適宜的萃取溶劑、萃取次數(shù)，以保證溶血磷脂的萃取回收率；需選擇適宜的助溶劑及使 用比例，保證再次萃取的萃取率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確測(cè)定多組分供試品中溶血磷脂含量的方法，尤其是 多組分供試品中溶血磷脂的樣品溶液的配制方法。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明采用有機(jī)溶劑的水溶液作為溶劑，以破壞注射用多種維生素（12)中的膠束；以 二氯甲烷或氯仿作為萃取溶劑，從供試品中萃取溶血磷脂，重復(fù)萃取一或兩次，合并萃取 液，用二氯甲烷、無(wú)水乙醇或95%乙醇定容制成供試品溶液；然后采用以蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀 為檢測(cè)器的高效液相色譜儀檢測(cè)溶血磷脂的含量；其中重復(fù)萃取時(shí)，除加入萃取劑二氯甲 燒或氯仿外，還需加入適量的無(wú)水乙醇或95%乙醇。
[0009] 供試品注射用多種維生素（12)系凍干粉末，易溶于水，難溶于純有機(jī)溶劑，須選擇 與水互溶的有機(jī)溶劑，并達(dá)到合適的比例。其中所述有機(jī)溶劑選自甲醇或乙醇，優(yōu)選乙醇。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，30%~75% (v/v)乙醇水溶液均能破壞膠束，優(yōu)選30%~50% (v/v)乙醇水溶液。
[0010] 其中重復(fù)萃取時(shí)，加入適量的無(wú)水乙醇或95%乙醇，可增加溶血磷脂在萃取溶劑 中的分配比，減少萃取次數(shù)。
[0011] 具體的技術(shù)方案如下： 一種注射用多種維生素（12)中溶血磷脂的含量測(cè)定方法，具體方法如下： 供試品溶液配制方法：取注射用多種維生素（12)粉末0. 75g，精密稱定，置分液漏斗 中，加入30%~50% (v/v)乙醇水溶液配制成I. 5% (g/ml)的供試品原液，振搖使細(xì)粉溶解，加 入供試品原液〇. 2~0. 6倍體積的萃取溶劑，振搖萃取，放置至下層澄清后，分取下層溶液； 再于上層溶液中加入供試品原液0. 1~〇. 3倍體積的無(wú)水乙醇或95%乙醇，搖勻，加入供試品 原液0. 2~0. 6倍體積的萃取溶劑，振搖萃取，放置至下層澄清后，分取下層溶液，或者如有 必要，再重復(fù)萃取一次；合并萃取的下層溶液，置于50ml或100mL容量瓶中，用二氯甲烷、無(wú) 水乙醇或95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；其中所述萃取溶劑選自二氯甲烷或 氯仿； 精密量取供試品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，由回歸方程計(jì)算供試品中溶 血磷脂的含量。
[0012] 用乙醇水溶液溶解樣品后直接進(jìn)樣，其中多種主成分均可被檢出，且響應(yīng)較大，對(duì) 溶血磷脂峰有干擾，難以通過(guò)改變色譜條件到達(dá)基線分離，因此需選擇適宜的溶劑系統(tǒng)分 離萃取溶血磷脂，以減少干擾。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，可選擇二氯甲烷、氯仿作樣品中溶血磷脂的萃 取溶劑，優(yōu)選二氯甲烷，可避免樣品中其他組分的干擾；重復(fù)萃取時(shí)，加入適量的無(wú)水乙醇 或95%乙醇，可增加溶血磷脂在萃取溶劑中的分配比，提高其萃取回收率，萃取兩次回收率 即可達(dá)98. 2%，可保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，萃取三次及以上，回收率無(wú)顯著增加，為簡(jiǎn)化樣品 配制步驟，優(yōu)選萃取兩次。
[0013] 注射用多種維生素（12)中溶血磷脂測(cè)定的色譜方法參照中國(guó)藥典委員會(huì)發(fā)布的 《丙泊酚注射用脂肪乳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿》中溶血磷脂的測(cè)定方法，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè) 器，以硅膠為填充劑，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85:15:0. 45:0. 05)為流動(dòng)相A，正己 烷-異丙醇-流動(dòng)相A (20:48:32)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫。
[0014] 采用本發(fā)明所述的供試品配制方法，實(shí)現(xiàn)了注射用多種維生素（12)中溶血磷脂的 液相檢測(cè)，可避免樣品中其他組分的干擾，可真實(shí)反映供試品中溶血磷脂的含量，以有效控 制產(chǎn)品質(zhì)量。
[0015] 采用本發(fā)明所述的高效液相色譜法測(cè)定注射用多種維生素（12)中溶血磷脂的含 量，分析時(shí)間短，溶血磷脂的保留時(shí)間約為11分鐘，；回收率高，平均回收率為98. 2% ;靈敏 度高，定量限達(dá)135ng。因此，采用本發(fā)明的方法能快速準(zhǔn)確地測(cè)定注射用多種維生素（12) 中溶血磷脂的含量。
[0016]
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為溶血磷脂對(duì)照品溶液色譜圖。
[0018] 圖2為實(shí)施例1中注射用多種維生素（12)乙醇水溶液直接進(jìn)樣色譜圖。
[0019] 圖3為實(shí)施例5中注射用多種維生素（12)中溶血磷脂測(cè)定色譜圖。
[0020] 圖4為二氯甲烷乙醇空白溶液色譜圖。
[0021] 圖5為實(shí)施例6中注射用多種維生素（12)中溶血磷脂回收率試驗(yàn)樣品溶液色譜 圖。
[0022]
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0024] 主要儀器及色譜條件： 安捷倫1100系列高效液相色譜儀；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，安捷倫色譜工作 站。
[0025] 色譜柱：以硅膠為填充劑的色譜柱。
[0026] 試劑與藥品： 正庚烷（HPLC級(jí))，異丙醇（HPLC級(jí))，無(wú)水乙醇，95%乙醇，二氯甲烷，溶血磷脂對(duì)照品。
[0027] 實(shí)驗(yàn)中用水均為自制的純化水。
[0028] 實(shí)施例1溶劑的選擇 供試品溶液：取注射用多種維生素（12)粉末0. 75g，精密稱定，置250ml分液漏斗中，分 別加入不同比例乙醇水溶液各50ml，振搖使完全溶解，加入二氯甲烷25ml，振搖萃取，放置 至完全分層后，分離有機(jī)層，置50ml量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻即得。
[0029] 取上述供試品溶液，照下列色譜條件進(jìn)行測(cè)定： 色譜柱：石圭膠為填充劑（250mmX4. 6mm，5 μ m); 流動(dòng)相A :甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85:15:0. 45:0. 05)，流動(dòng)相B :正己烷-異丙 醇-流動(dòng)相A (20:48:32 )，照表1進(jìn)行梯度洗脫： 表1流動(dòng)相梯度
流速為每分鐘I. 〇ml，柱溫35°C，進(jìn)樣量為20 μ 1，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(霧化氣流速為每 分鐘2. 0L，霧化器溫度：70°C )檢測(cè)。
[0030] 具體溶劑比例及結(jié)果見(jiàn)表2。
[0031] 表2乙醇水溶液濃度篩選結(jié)果
結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇水溶液中乙醇比例大于20%時(shí)，溶血磷脂可被檢出，即其具有破壞膠 束的效果；當(dāng)其比例大于60%時(shí)，其他成分被萃出，于溶血磷脂出峰處有嚴(yán)重干擾；當(dāng)其比 例為30%~50%時(shí)，萃取效果較好，溶血磷脂萃出量較大。以純水作溶劑時(shí)，因樣品中存在大 量甘氨膽酸/磷脂等助溶劑，難以形成明顯的萃取分界面，當(dāng)乙醇比例達(dá)到35%及以上時(shí)， 萃取分層效果較好，優(yōu)選35%~50%，最優(yōu)選40%乙醇水溶液。
[0032] 實(shí)施例2萃取溶劑及體積的選擇 供試品溶液：取注射用多種維生素（12)粉末0. 75g，精密稱定，置250ml分液漏斗中，加 入40%乙醇水溶液50ml，振搖使完全溶解，分別照表3加入萃取溶劑適量，振搖萃取，放置至 完全分層后，分離有機(jī)層，置50ml量瓶中，用萃取溶劑稀釋至刻度，搖勻即得。
[0033] 取上述供試品溶液，照實(shí)施例1中所選定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果參見(jiàn)表3。 [0034] 表3萃取溶劑考察結(jié)果
結(jié)果表明，用正庚烷及正己烷難以萃取出溶血磷脂，用二氯甲烷及氯仿效果相當(dāng)，體積 15~25ml結(jié)果無(wú)顯著差異，優(yōu)選二氯甲烷作萃取溶劑。
[0035] 實(shí)施例3再次萃取條件的考察 供試品溶液：取注射用多種維生素（12)粉末0. 75g，精密稱定，置250ml分液漏斗中，加 入40%乙醇水溶液50ml，振搖使完全溶解，加入二氯甲烷適量，振搖萃取，放置至完全分層 后，分取下層溶液；分別照表4加入適量無(wú)水乙醇或95%乙醇及二氯甲烷后，振搖萃取，放置 至完全分層后，分取下層溶液，與第一次萃得溶液合并，置量瓶中，