微小rna或其抑制劑在脂代謝調(diào)控中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及microRNA或其抑制劑的用途，具體涉及microRNA或其抑制劑在制備調(diào)節(jié)脂代謝的藥物或制備預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述microRNA包括miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種或數(shù)種。本發(fā)明還涉及所述microRNA或其抑制劑用于調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的用途。本發(fā)明還涉及包含所述microRNA或其抑制劑的組合物。本發(fā)明所述的microRNA或其抑制劑可作為藥物組成成分，應(yīng)用于預(yù)防或治療脂代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等相關(guān)疾病。
【專利說明】微小RNA或其抑制劑在脂代謝調(diào)控中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及microRNA或其抑制劑的用途，具體涉及microRNA或其抑制劑在制備調(diào)節(jié)脂代謝的藥物或制備預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病的藥物中的用途。另外，microRNA或其抑制劑可用于上述相關(guān)疾病或相關(guān)蛋白功能機(jī)理研究的工具藥物。本發(fā)明還涉及所述microRNA或其抑制劑用于調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的用途。本發(fā)明還涉及包含所述microRNA或其反義寡核苷酸抑制劑的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病是世界范圍內(nèi)最主要的致殘和致死的疾病，血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化最重要的危險(xiǎn)因素之一。尋找療效顯著安全可靠的血脂調(diào)節(jié)藥物一直是醫(yī)藥工作者長期研究的課題。
[0003]大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的發(fā)病率和病死率與血衆(zhòng)高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平呈負(fù)相關(guān)，與血衆(zhòng)低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipopro-tein cholesterol, LDL-C)水平呈正相關(guān)。HDL-C濃度增加0.026mM,心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)將減少2_3% ;而LDL-C濃度減少2-3mM，心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)將減少約40-50%。血漿高密度脂蛋白抗動(dòng)脈粥樣硬化功能主要通過其介導(dǎo)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport, RCT)來實(shí)現(xiàn)的，HDL-C清除速度越快，膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)效率越高，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率和死亡率越低。此外，HDL的心血管保護(hù)作用還與其抗炎及抗氧化活性有關(guān)。
[0004]人B族I 型清 道夫受體(scavenger receptor class B, memberl, SR-BI)又稱 CD36和溶酶體整合膜蛋白 II 相關(guān)蛋白 I (CD36and Lysosomal integral membrane protein-1IAnalogouS-l，CLA-l)，是清道夫受體家族中的一個(gè)重要的膜整合糖蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，SR-BI是參與小鼠肝細(xì)胞HDL相關(guān)膽固醇酯選擇性吸收的關(guān)鍵分子。作為一個(gè)在肝臟中高表達(dá)的功能性高密度脂蛋白受體，SR-BI以高親和力和高飽和度與HDL相結(jié)合介導(dǎo)HDL-C選擇性攝取，這一過程是RCT的最后一個(gè)限速環(huán)節(jié)。肝細(xì)胞SR-BI過表達(dá)能夠促進(jìn)HDL-C逆轉(zhuǎn)運(yùn)，提高血漿HDL清除率，降低臨床動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)心血管疾病危險(xiǎn)事件的發(fā)病率和致死率。
[0005]ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Al (ATP-binding cassette, sub-family A, memberl, ABCAl)是一個(gè)以ATP為能源轉(zhuǎn)運(yùn)各種底物的膜相關(guān)蛋白。巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中ABCAl的功能最為突出:其以膽固醇為底物在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)清除過程中起外排泵的作用。ABCAl基因突變與Tangier病和家族性高密度脂蛋白缺乏癥有密切關(guān)系。巨噬細(xì)胞攝取的氧化型脂蛋白膽固醇以游離膽固醇的形式通過ABCAl介導(dǎo)外排與脂質(zhì)缺乏的apoA-Ι結(jié)合形成前β-HDL(pre-β -HDL)，這一過程是RCT的第一個(gè)限速環(huán)節(jié)，對(duì)脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。
[0006]低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)主要功能是通過攝取膽固醇進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，用于細(xì)胞增殖和固醇類激素及膽汁酸鹽的合成等。LDL或其他含ApoBlOO, E的脂蛋白如VLDL、β -VLDL均可與LDL受體結(jié)合，內(nèi)吞入細(xì)胞使其獲得脂類，主要是膽固醇，這種代謝過程稱為LDL受體途徑(LDL receptor pathway),該途徑依賴于LDL受體介導(dǎo)的細(xì)胞膜吞飲作用完成。LDLR基因的突變導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性疾病及家族性高膽固醇血癥。
[0007]過氧化物酶體增殖物激活受體Y (peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma, PPAR- y or PPARG)可與維甲酸 X 受體(retinoid X receptors, RXRs)形成異源二聚體調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。PPAR-Y對(duì)脂肪細(xì)胞分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，PPAR- Y還與許多病理過程密切相關(guān)，如肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥。近來的研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-y可調(diào)控干預(yù)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇和脂質(zhì)的平衡，進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，這一調(diào)控過程與多個(gè)脂蛋白受體有關(guān)。研究表明，PPAR-Y可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1 (activation protein-1, ΑΡ-l)的活性，抑制清道夫受體 SR-A (scavenger receptorA)的表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞攝取脂蛋白能力下降。在已分化的巨噬細(xì)胞，PPAR-Y配體還誘導(dǎo)SR-BI的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇從泡沫細(xì)胞外流。另有研究提示，PPAR- Y還可通過誘導(dǎo)ABCAl和SR-BI，刺激膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵步驟，從而促進(jìn)膽固醇外流。
[0008]微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類高度保守的單鏈非編碼小RNA，由約20-22個(gè)單核苷酸組成，廣泛存在于真核生物中，參與轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平的調(diào)控。microRNA在真核生物基因調(diào)控中起著重要作用，廣泛參與了細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡等多種基本生命活動(dòng)。microRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性等特征，通過與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，每個(gè)microRNA都具有調(diào)節(jié)多個(gè)mRNAs的潛能。microRNA表達(dá)水平的穩(wěn)定對(duì)于生命體正常生理機(jī)能的發(fā)揮以及維持新陳代謝的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。
[0009]近年研究發(fā)現(xiàn)，HiiCT0RNA除了調(diào)控正常生理過程，對(duì)于腫瘤、糖脂代謝性疾病等眾多病理過程中同樣非常重要，在疾病的診斷與治療中可能發(fā)揮關(guān)鍵性作用。microRNA在調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育中及其病理過程中起重要作用，心肌肥厚、心臟衰竭、心肌梗死后重構(gòu)和血管重塑等多種心血管疾病狀態(tài)下，呈現(xiàn)出高度特異的microRNA表達(dá)模式。不同病理狀態(tài)下，microRNA的表達(dá)譜不盡相同。腫瘤及心血管疾病等各種疾病狀態(tài)下，差異表達(dá)的特異microRNA可作為生物學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于各種疾病的診斷與分型。microRNA相關(guān)的疾病數(shù)據(jù)庫也已經(jīng)陸續(xù)建立起來。miciORNA的細(xì)胞靶點(diǎn)與心血管疾病表型的相關(guān)性研究，闡明了新的生物學(xué)途徑和病理機(jī)制。
[0010]microRNA表達(dá)量的增加或減少均能引發(fā)嚴(yán)重的病理后果，因此穩(wěn)定靶器官中相應(yīng)microRNA表達(dá)水平可能成為疾病治療的一個(gè)新思路。在生物體內(nèi)使用寡核苷酸抑制劑或microRNA，改變內(nèi)源性microRNA豐度，人為控制體內(nèi)單個(gè)或多個(gè)microRNA水平，使得以microRNA為基礎(chǔ)的治療策略應(yīng)用于臨床成為可能。如果這些方法能夠安全有效的運(yùn)用于人體,將大大促進(jìn)心血管疾病等人類重大疾病問題的解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明采用SiRNA基因沉默技術(shù)將microRNA生成過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶Dicer和Drosha表達(dá)抑制以后，膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵分子SR-BI基因mRNA水平顯著上調(diào)。這提示microRNA在SR-BI表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。對(duì)預(yù)測的miRNAs的作用進(jìn)行檢測篩選，最終獲得3個(gè)能夠顯著降低肝細(xì)胞SR-BI基因mRNA水平的miRNAs:microRNA-96(miR-96)、microRNA-185 (miR-185)和 microRNA-223 (miR-223)。進(jìn)一步對(duì)這 3 個(gè) miRNAs的生物學(xué)活性進(jìn)行檢測，證實(shí)了這三種microRNA或其抑制劑對(duì)于脂代謝過程中相關(guān)蛋白的調(diào)控作用，由此完成了本發(fā)明。
[0012]本發(fā)明一個(gè)方面涉及微小RNA (microRNA, miRNA)的抑制劑在制備調(diào)節(jié)脂代謝的藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
[0013]本發(fā)明另一方面涉及微小RNA的抑制劑在制備預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種；其中所述脂代謝相關(guān)疾病例如為脂代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等)、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
[0014]本發(fā)明另一方面涉及組合物，其含有微小RNA的抑制劑，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種，所述組合物用于調(diào)節(jié)脂代謝，或者用于預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病，所述脂代謝相關(guān)疾病例如為脂代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等)、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
[0015]本發(fā)明另一方面涉及微小RNA用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體(SR-BI)表達(dá)水平的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和
miRNA-223中的一種、兩種或三種。
[0016]本發(fā)明另一方面涉及微小RNA的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中人B族I型清道夫受體表達(dá)水平的制劑中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或二種。
[0017]本發(fā)明另一方面涉及miRNA-96和/或miRNA-223用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al (ABCAl)表達(dá)水平的用途。
[0018]本發(fā)明另一方面涉及miRNA-96和/或miRNA-223的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al表達(dá)水平的制劑中的用途。
[0019]本發(fā)明另一方面涉及miRNA-185用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)水平的用途。
[0020]本發(fā)明另一方面涉及miRNA-185的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)水平的制劑中的用途。
[0021]本發(fā)明另一方面涉及miRNA-96用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達(dá)水平的用途。
[0022]本發(fā)明另一方面涉及miRNA-96的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達(dá)水平的制劑中的用途。
[0023]本發(fā)明另一方面涉及微小RNA的抑制劑在制備用于提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)高密度脂蛋白(HDL)水平和/或降低血液中低密度脂蛋白(LDL)、膽固醇、甘油三酯水平的制劑或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
[0024]本發(fā)明另一方面涉及上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al、低密度脂蛋白受體或過氧化物酶體增殖物激活受體Y表達(dá)水平的方法，所述方法包括給細(xì)胞施用微小RNA的抑制劑的步驟，或者包括將細(xì)胞與微小RNA的抑制劑相接觸的步驟，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或二種。
[0025]本發(fā)明另一方面涉及一種篩選用于調(diào)節(jié)脂代謝、或者用于預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病的藥物的方法，所述方法包括篩選miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223的抑制劑的步驟；優(yōu)選地，所述方法包括根據(jù)miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別設(shè)計(jì)其反義RNA，或者將miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別與候選物質(zhì)接觸，分別檢測各微小RNA的表達(dá)，并選擇特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達(dá)的物質(zhì)。
[0026]根據(jù)上述任一方面任一項(xiàng)的用途、方法或組合物，其中所述的微小RNA的抑制劑可以是能夠抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223對(duì)靶基因的調(diào)控作用的任何物質(zhì)，可以是在細(xì)胞中抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達(dá)的物質(zhì)，也可以是與各miRNA具有特異性相互作用，例如與各miRNA特異性結(jié)合的物質(zhì)，或者抑制各miRNA與Dicer或RISC的相互作用的物質(zhì)。
[0027]根據(jù)上述任一方面任一項(xiàng)的用途、方法或組合物，所述的微小RNA或其抑制劑也可用于上述相關(guān)疾病或相關(guān)蛋白功能機(jī)理研究的工具藥物。
[0028]以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述。
[0029]在本發(fā)明中，所述調(diào)節(jié)脂代謝是指降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)膽固醇水平、甘油三酯水平和/或低密度脂蛋白水平，和/或提高高密度脂蛋白水平。
[0030]在本發(fā)明中，所述脂代謝相關(guān)疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是心肌梗塞、中風(fēng))、阿爾茨海默癥、高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥)、肥胖、糖尿病和代謝綜合征。
[0031]在本發(fā)明中，所述微小RNA的抑制劑具有本領(lǐng)域公知的含義，其可以是能夠特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223對(duì)靶基因的調(diào)控作用的任何物質(zhì)，可以是在細(xì)胞中特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達(dá)的物質(zhì)，也可以是與各miRNA具有特異性相互作用，例如與各miRNA特異性結(jié)合的物質(zhì)，或者特異性抑制各miRNA與DICER或RISC的相互作用的物質(zhì)。
[0032]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述微小RNA的抑制劑(反義寡核苷酸抑制劑，ant1-miR)是指化學(xué)合成及修飾的、與特異miRNA序列(特別是核心序列,例如第2_8個(gè)核苷酸)互補(bǔ)、特異性抑制內(nèi)生miRNAs功能的單鏈核酸分子,通過特異的祀向單個(gè)miRNA分子，從而削弱內(nèi)源miR NA對(duì)其祀基因的調(diào)控作用，影響祀基因的表達(dá)(Stenvang J, PetriA, Lindow Mj Obad S，Kauppinen S.，Inhibition of microRNA function by antimiRoligonucleotides，Silence.2012Jan9;3(I): 1.do1:10.1186/1758-907X-3-1.)。 反義寡核苷酸抑制劑可以有不同的長度和化學(xué)修飾，如磷酸骨架的硫代修飾，核糖的2’ -O-烷基化修飾，包括2’ -O-甲基、2’ -O-甲氧乙基、2’ -F等，以及肽核酸(peptide nucleicacid, PNA)、鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)等修飾。[0033]當(dāng)用于上述用途時(shí)，所述微小RNA或其抑制劑可以單獨(dú)使用，也可以與其它分子連接后使用，例如與膽固醇、靶細(xì)胞受體等連接，或者連接入載體后使用。
[0034]在本發(fā)明中，所述細(xì)胞是指含有miR-96、miR-185或miR-223作用位點(diǎn)、受miR-96、miR-185、miR-223或其抑制劑調(diào)控的細(xì)胞，特別是通過miR-96、miR-185、miR-223或其抑制劑能夠調(diào)控其SR-BI蛋白或其它膽固醇或脂代謝相關(guān)蛋白的細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括肝細(xì)胞(例如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞)、單核巨噬細(xì)胞以及肝臟、腎臟、心臟、腸道、肺和脾臟組織內(nèi)的細(xì)胞。
[0035]在本發(fā)明中，所述上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某蛋白的表達(dá)水平是指上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某蛋白的mRNA水平或蛋白質(zhì)水平；其中所述的上調(diào)或下調(diào)是與未進(jìn)行干預(yù)的細(xì)胞進(jìn)行比較。
[0036]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，結(jié)合實(shí)時(shí)定量RT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)，證實(shí)在肝細(xì)胞中miR-96、miR-185和miR-223均能顯著下調(diào)SR-BI基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，而它們的反義寡核苷酸抑制劑則具有相反的作用。進(jìn)而利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞對(duì)Di1-HDL的攝取發(fā)現(xiàn):miR-96、miR-185和miR-223均能顯著抑制肝細(xì)胞對(duì)Di1-HDL的攝取作用，而相應(yīng)的反義寡核苷酸抑制劑則具有相反的作用。其中，當(dāng)SR-BI基因沉默后，miR-185抑制肝細(xì)胞對(duì)Di1-HDL攝取的作用消失。證明miR-96、miR-185和miR-223能夠有效調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵分子SR-BI。
[0037]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，為確定這些miRNAs的作用位點(diǎn)，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得不同長度的SR-BI基因3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)片段以及相應(yīng)miRNAs作用位點(diǎn)缺失的SR-BI基因3’ UTR片段，并將這些片段構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因下游，通過轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，miR-96、miR-185和miR-223均能夠顯著抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，并利用核苷酸缺失的方法確定了其結(jié)合位點(diǎn)，miR-96、miR-185和miR-223位于SR-BI基因3’ UTR片段的不同區(qū) 域。聯(lián)合作用結(jié)果證明，miR-96、miR-185和miR-223之間存在協(xié)同作用，共同調(diào)控SR-BI基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。
[0038]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，檢測了小鼠不同組織中miR-96和miR-185的分布情況。miRNAs定量分析結(jié)果顯示，miR-96和miR-185在小鼠肝臟中均有一定水平的分布。進(jìn)一步檢測了高脂飲食飼養(yǎng)的ApoE基因敲除小鼠肝臟中miR-96和miR-185的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常飲食飼養(yǎng)小鼠相比，高脂飲食飼養(yǎng)鼠的血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平顯著升高，呈現(xiàn)高脂血癥特征，同時(shí)肝臟SR-BI表達(dá)顯著增加，而miR-96和miR-185的表達(dá)水平顯著降低。這種負(fù)相關(guān)性也進(jìn)一步佐證了這些miRNAs與SR-BI之間的調(diào)控關(guān)系。
[0039]鑒于巨噬細(xì)胞在SR-BI參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵作用，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，檢測了 miR-96、miR-185和miR-223在佛波酯(PMA)誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞中的分布和作用。結(jié)果顯示，在巨噬細(xì)胞(PMA誘導(dǎo)的THP-1)中，miR-185和miR-96均可顯著降低SR-BI的mRNA水平，而miR-223沒有明顯變化。
[0040]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，檢測了 miR-96、miR-185和miR-223，尤其是miR-185和miR-96對(duì)其他相關(guān)預(yù)測靶基因的調(diào)控作用。對(duì)RCT第一個(gè)限速環(huán)節(jié)的關(guān)鍵分子ABCAl研究表明，ABCAl基因3’UTR上存在miR-96和miR-223作用位點(diǎn)各一個(gè)。多物種序列比對(duì)結(jié)果證實(shí)它們具有高保守性。利用小分子RNA轉(zhuǎn)染和Real-time RT-PCR技術(shù)分析表明，在肝細(xì)胞中miR-96和miR-223能顯著下調(diào)ABCAlmRNA水平，它們的反義寡核苷酸抑制劑能顯著上調(diào)ABCAlmRNA水平。這證實(shí)miR-96和miR-223能夠有效調(diào)節(jié)ABCAl。[0041] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，對(duì)LDLR的研究表明，LDLR3’UTR上存在兩個(gè)miR-185作用位點(diǎn)，多物種序列比對(duì)結(jié)果證實(shí)此位點(diǎn)非常保守。利用小分子RNA轉(zhuǎn)染和Real-timeRT-PCR技術(shù)分析表明，在肝細(xì)胞中miR-185能顯著下調(diào)LDLR mRNA水平，它們的反義寡核苷酸抑制劑能顯著上調(diào)LDLRmRNA水平。這證實(shí)miR-185能夠有效調(diào)節(jié)LDLR。
[0042]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，對(duì)于調(diào)節(jié)膽固醇和脂質(zhì)代謝平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子PPAR- Y的研究表明，其3’UTR上存在一個(gè)miR-96作用位點(diǎn)，多物種序列比對(duì)結(jié)果證實(shí)此位點(diǎn)非常保守。利用小分子RNA轉(zhuǎn)染和Real-time RT-PCR技術(shù)分析表明，在肝細(xì)胞中miR-96能顯著下調(diào)PPAR- Y mRNA水平，它們的反義寡核苷酸抑制劑能顯著上調(diào)PPAR- y mRNA水平。證實(shí)miR-96能夠有效調(diào)節(jié)PPAR- Y。
[0043]發(fā)明的有益效果
[0044]本發(fā)明證實(shí)了 miR-96、miR-185、miR-223作用于脂代謝過程中的一系列重要靶點(diǎn)，在脂代謝調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用?？梢詫iR-96、miR-185、miR-223作為藥物組成成分或生物標(biāo)志物，或?qū)⑵渥鳛樾滦退幬镒饔冒悬c(diǎn)應(yīng)用其抑制劑作為藥物組成成分，應(yīng)用于預(yù)防或治療脂代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥、動(dòng)脈粥粥樣硬化、冠心病等相關(guān)疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1 Dicer或Drosha基因沉默對(duì)SR-BI mRNA水平的影響；
[0046]其中左圖為Dicer或Drosha基因沉默后SR-BI mRNA的水平；
[0047]中圖為Drosha基因沉默后Drosha mRNA的水平；
[0048]右圖Dicer基因沉默后Dicer mRNA的水平；
[0049]Scr-si 表示 siRNA 對(duì)照序列(invitrogen，12935-200，12935-300，12935-400)，Drosha-si (invitrogen, HSS120887)表不 Drosha 基因沉默組，Dicer-si (invitrogen,HSS118719)表示Dicer基因沉默組。
[0050]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 scr-si 相比。
[0051]圖 2 SR-BI3’ UTR 上的 mirR-96、miR-185、miR223 的預(yù)測靶位點(diǎn)。
[0052]圖3 SR-BI3’ UTR上存在的miR-96、miR-185和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Mml稱猴；Ssc豬；Bta牛；Eca馬；Cfa犬；Fca貓；Mmu小鼠；Cpo豚鼠；Rno褐家鼠；0cu兔；Ete猬)
[0053]圖4 miR-96、miR-185和miR-223及其拮抗劑對(duì)SR-BI mRNA和蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用；其中，
[0054]A表示Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-185及其反義寡核苷酸抑制劑至人肝癌細(xì)胞IfepG2或Bel-7402和人正常肝細(xì)胞HL-7702，作用不同時(shí)間后測定的SR-BI mRNA和蛋白水平；
[0055]B表不Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-96、miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞HepG2后，SR-BI mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。
[0056]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，與 ctl-miR(miR)相比;#P<0.05,與ctl-miR(ant1-miR)相比。(其中圖A中的con miR與圖B中的ctl_miR相同)
[0057]圖5 miR-96、miR-185 和 miR-223 與 SR-BI3’ UTR 直接作用位點(diǎn)確證；其中，
[0058]A表明當(dāng)SR-BI3’ UTR片段中存在miR-185的相應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)時(shí)，miR-185能夠顯著降低熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性；當(dāng)SR-BI3’ UTR片段中不存在miR-185的相應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)時(shí)，miR-185不呈現(xiàn)降低熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性的效應(yīng)；
[0059]B表明當(dāng)SR-BI3’ UTR片段中存在miR-96和miR-223的相應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)時(shí)，miR-96和miR-223能夠顯著降低熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性；
[0060]C表明miR-96、miR-185和miR-223單獨(dú)或聯(lián)合作用時(shí)對(duì)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性的效應(yīng)，證實(shí)這些miRNAs之間存在協(xié)同作用；
[0061]其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑(反義寡核苷酸抑制劑)，ctl-miR表示對(duì)照miRNA (5，-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’，SEQ ID NO:7), pc-luc 表示不含有 SR-BI3’ UTR的對(duì)照質(zhì)粒；U1對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段(959bp)的全長，U2對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第120-959bp，U3對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第312-959bp ；U4對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第498_959bp ；U5對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第664-959bp ；U6對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第870-959bp ；WT代表野生SR-BI3，UTR片段，DELl代表缺失了 miR-185結(jié)合位點(diǎn)I的SR-BI3’ UTR片段，DEL2代表缺失了 miR-185結(jié)合位點(diǎn)2的SR-BI3’ UTR片段。
[0062]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 ctl-miR 相比;#P〈0.05，##Ρ〈0.01，與野生載體相比。
[0063]圖6 miR-96、miR-185 和 miR-223 對(duì)肝細(xì)胞 Dil-HDL 攝取的影響；
[0064]A:Lipofectamine RNAiMAX reagent瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-185或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2、Bel-7402和正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞HL-7702，作用72小時(shí)后，在2 μ g/mLDil-HDL中孵育4小時(shí)后，流式細(xì)胞檢測肝細(xì)胞對(duì)Dil-HDL的攝?。?br> [0065]B:Lipofectamine RNAiMAX reagent 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-96、miR-223 或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2，作用72小時(shí)后，在2μ g/mLDil-HDL中孵育4小時(shí)后，流式細(xì)胞檢測肝細(xì)胞對(duì)Dil-HDL的攝??；
[0066]ctl-miR 表不對(duì)照 miRNA, ant1-miR 表不 miRNA 的拮抗劑；
[0067]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，與 ctl-miR(miR)相比；#Ρ〈0.05，與 ctl-miR(ant1-miR)相比。
[0068]圖7 SR-BI基因在miR-185介導(dǎo)的抑制肝細(xì)胞攝取Dil-HDL過程中的作用；其中ctl-miR表示對(duì)照miRNA，scr-si表示siRNA對(duì)照，SR-B1-si表示SR-BI基因沉默組。
[0069]**P<0.01,***P<0.001, NS,沒有顯著差異。
[0070]圖8 ABCA13’ UTR 上存在的 miR-96 和 miR-223 預(yù)測靶點(diǎn)。
[0071]圖9 ABCA13’UTR上存在的miR-96和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ame大熊貓；Mmu小鼠)。
[0072]圖10 miR-96,miR-223及其拮抗劑對(duì)ABCAlmRNA水平的調(diào)節(jié)作用；其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑，ctl-miR表示miRNA對(duì)照。
[0073]**Ρ〈0.01,與 ctl-miR(miR)相比;##Ρ〈0.01,與 ctl-miR(ant1-miR)相比。
[0074]圖11 LDLR3’ UTR上存在的兩個(gè)miR-185預(yù)測靶點(diǎn)。
[0075]圖12 LDLR3’ UTR上存在的miR-185預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Bta牛)。
[0076]圖13 miR-185及其拮抗劑對(duì)LDLR mRNA水平的調(diào)節(jié)；其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑，ctl-miR表示miRNA對(duì)照。[0077]**Ρ〈0.01，與 ctl-miR (miR)相比;#P<0.05，與 ctl-miR (ant1-miR)相比。
[0078]圖14 PPAR- Y 3’ UTR上存在的一個(gè)miR-96預(yù)測靶點(diǎn)。
[0079]圖15 PPAR- Y 3’ UTR上存在的miR-96預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ssc豬；Bta牛；Fca貓；Mmu小鼠；Rno褐家鼠；Gga 雞)。
[0080]圖16 miR-96及其拮抗劑對(duì)PPAR- y mRNA水平的調(diào)節(jié)；其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑，ctl-miR表示miRNA對(duì)照。
[0081]**Ρ〈0.01,與 ctl-miR(miR)相比;##Ρ〈0.01,與 ctl-miR(ant1-miR)相比。
[0082]圖17高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟中miR-96和miR-185的表達(dá)水平，其中第一幅圖表示小鼠體重，第二幅圖表不總膽固醇水平，第二幅圖表不LDL水平,第四幅圖表不miR-96和miR-185的豐度，chow表示正常飲食喂養(yǎng)組，HFD表示高脂飲食喂養(yǎng)組。
[0083]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 ctl-miR 相比。
[0084]圖18 miR-96、miR-185 和 miR-223 對(duì)巨噬細(xì)胞 SR-BI mRNA 水平和 Dil-HDL 攝取的影響，ctl-miR表示miRNA對(duì)照,chow表示正常飲食喂養(yǎng)組,HFD表示高脂飲食喂養(yǎng)組。
[0085]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，n=6 (chow) and n=5 (HFD)。 [0086]圖19 HDL對(duì)miR-185和SR-BI mRNA水平的調(diào)節(jié)，其中veh表示溶劑對(duì)照。
[0087]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 veh(miR_185)相比；#Ρ〈0.05，與 veh (SR-BI)相比。
[0088]圖20 miR-96、miR-185或miR-223在ApoE基因敲除小鼠不同組織或細(xì)胞中的分布；其中
[0089]A表示miR-96、miR-185在不同組織(肝、腎、心臟、腸道、肺和脾)中的豐度，
[0090]B表示miR-96、miR-185或miR-223在不同細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞H印G2、Bel-7402、正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞HL-7702和PMA誘導(dǎo)24小時(shí)后的巨噬細(xì)胞THP-1)中的豐度。
【具體實(shí)施方式】
[0091]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0092]材料和方法
[0093]I 材料 [0094]L I質(zhì)粒、細(xì)胞株和動(dòng)物真核細(xì)胞表達(dá)載體pGL3_Basic和pcDNA3.1均為美國Promega公司產(chǎn)品；人肝癌細(xì)胞株H印G2、Bel_7402和HL-7702為本實(shí)驗(yàn)室保存(其中H印G2購自ATCC，HB-8065，后兩者購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所);ApoE敲除小鼠購自北京大學(xué)
醫(yī)學(xué)部。
[0095]1.2主要試劑DNA細(xì)胞裂解液及突光素酶檢測系統(tǒng)(Luciferase Assay System)、RNA提取試劑盒(SV Total RNA Isolation System)均購自美國Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑 (Lipofectamine?2000)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScript III First-Strand)均購自美國Invitrogen 公司；實(shí)時(shí)突光定量 RT-PCR 試劑盒(FastStart Universal SYBR Green PCRMaster)購自Roche公司；小RNA提取試劑盒(miRNeasy Mini Kit)、小RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript II RT Kit)、熒光定量檢測試劑盒(miScript SYBR Green PCR Kit)均購自美國Qiagen公司；MEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Thermo公司；胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和G418抗生素購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。
[0096]1.3 儀器 MiniCycle PTC-200 型 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產(chǎn)品；EnVision多功能微孔板檢測儀為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀iQ5MultiColorReal-Time PCR 為 Bio-Rad 公司產(chǎn)品。
[0097]2 方法
[0098]2.lpc-luc-3’ UTR重組質(zhì)粒的構(gòu)建將通過PCR獲得的CLA-13’ UTR序列(NM_005505)克隆至pc-luc質(zhì)粒(將熒光素酶報(bào)告基因插入pcDNA3.1質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建質(zhì)粒pc-luc)突光素酶報(bào)告基因下游,獲得重組質(zhì)粒pc-luc-3’UTR。測序鑒定。
[0099]2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染IfepG2等細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、lmmol/L丙酮酸鈉和I %非必需氨基酸的MEM培養(yǎng)基中，于3 7 °C、5%C02條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的提取方法按 PureYi el d?P lasmid Midiprep System 試劑盒說明書進(jìn)行。將 IXlO5 個(gè) HepG2細(xì)胞接種于30mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長匯聚程度達(dá)到80%左右時(shí)，利用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000 或 Lipofectamine RNAiMAX 將 pc_luc_3’ UTR 或 miRNAs 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相應(yīng)時(shí)間后后進(jìn)行檢測。
[0100]2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR提取細(xì)胞的總RNA，采用試劑盒SuperScript IIIFirst-Strand (Invitrogen)或miScript II RT Kit 合成 cDNA,米用 2><TaqMan? GeneExpression Master Mix 或miScript SYBR Green PCR Kit 進(jìn)行突光定量PCR反應(yīng),利用數(shù)據(jù)分析軟件分析并計(jì)算Ct值。以GAPDH或U6為內(nèi)參，采用相對(duì)Ct的方法對(duì)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量。
[0101]2.4細(xì)胞表面蛋白表達(dá)水平檢測將細(xì)胞以I X IO5個(gè)/ml的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，處理后消化收集細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞4h，以Iml含5%FBS的PBS將細(xì)胞重懸并于4。C靜置15min,分別加入一抗(1:500)、FITC標(biāo)記二抗(1:1000)各孵育50min,PBS漂洗后于300目尼龍膜過濾，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。各組細(xì)胞樣品的平均檢測細(xì)胞數(shù)為10，000個(gè)，每組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)積分圖表示。
[0102]2.5細(xì)胞攝取Di1-HDL功能檢測利用流式細(xì)胞儀檢測化合物對(duì)細(xì)胞攝取Di1-HDL的影響。HepG2等細(xì)胞傳代后以I X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，處理后，加入2μg/ml Di1-HDL于37° C孵育4h。消化收集細(xì)胞并重懸于700 μ I PBS中，過300目尼龍網(wǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光值。每個(gè)樣品平均檢測10，000個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度用對(duì)數(shù)積分圖表示。
[0103]miRNA的篩選過程
[0104]預(yù)測miRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測miRNA對(duì)SR-BI表達(dá)的影響。
[0105]篩選到的miRNA為miR-96、miR-185和miR-223，其序列分別為:
[0106]hsa-miR-96
[0107]5，- uuuggcacuagcacauuuuugcu-3，(SEQ ID NO:1)
[0108]hsa-miR-185
[0109]5，-uggagagaaaggcaguuccuga-3’ (SEQ ID NO:2)[0110]hsa-miR-223
[0111]5，-ugucaguuugucaaauacccca-3’ (SEQ ID NO:3)
[0112]本發(fā)明的miRNA 購自 QIAGEN 公司，hsa-miR-96 為 Cat.n0.MSY0000095，hsa-miR-185 為 Cat.n0.MSY0000455, hsa-miR-223 為 Cat.n0.MSY0004570。
[0113]實(shí)施例1, miR-96、miR-185和miR-223調(diào)節(jié)昍固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的重要靶點(diǎn)SR-BI。
[0114]1.1、Dicer和Drosha基因沉默對(duì)SR-BI mRNA水平的影響
[0115]用siRNA基因沉默 技術(shù)敲除microRNA生物合成過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶Dicer和Drosha 后，Real-time RT-PCR 法檢測 SR-BI mRNA 水平。
[0116]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Dicer或Drosha基因沉默后，SR-BI mRNA水平顯著上調(diào)，說明microRNA參與了 SR-BI的調(diào)控(如圖1所示)。
[0117]1.2,miR-96,miR-185和miR-223及其拮抗劑對(duì)SR-BI mRNA和蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用。
[0118]本發(fā)明的miRNA拮抗劑(ant1-miR)購自QIAGEN公司，其序列和貨號(hào)分別為:
[0119]ant1-miR-96 (Cat.n0.MIN0000095)
[0120]5，- agcaaaaaugugcuagugccaaa - 3，(SEQ ID NO:4)
[0121]ant1-miR-185 (Cat.n0.MIN0000455)
[0122]5，- ucaggaacugccuuucucucca - 3，(SEQ ID NO:5)
[0123]ant1-miR-223 (Cat.n0.MIN0004570)
[0124]5，- ugggguauuugacaaacugaca - 3，(SEQ ID NO:6)
[0125]miRNA拮抗劑對(duì)照購自QIAGEN公司，其貨號(hào)為Cat.n0.1027271。
[0126]Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-96、miR-185、miR-223 及其反義寡核苷酸抑制劑至人肝癌細(xì)胞H印G2或Bel-7402和人正常肝細(xì)胞HL-7702，作用48或72小時(shí)后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細(xì)胞總RNA, cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄，Real-time RT-PCR 法測定 SR-BI mRNA 水平。Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-96、miR-185、miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2、Bel-7402和正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞HL-7702，作用48或72小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測SR-BI蛋白表達(dá)水平變化。
[0127]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝細(xì)胞中miR-96、miR-185和miR-223均能顯著下調(diào)SR-BI mRNA和蛋白表達(dá)水平(如圖5所示)。
[0128]1.3、靶向SR-BI基因3’ UTR的miRNA預(yù)測及靶位點(diǎn)同源性分析
[0129]MicroRNA.0rg (http: //www.microrna.0rg)和 TargetScan (http://www.targetscan.0rg)等在線軟件預(yù)測miR-96、miR-185和miR-223等miRNAs直接作用于SR-BI3，UTR (NM_005505)o利用Clustal X2軟件對(duì)多個(gè)物種的SR-BI3，UTR序列進(jìn)行比對(duì)。
[0130]預(yù)測結(jié)果如圖2所示，SR-BI3’UTR上存在miR-96和miR-223預(yù)測靶位點(diǎn)各一個(gè)，存在miR-185預(yù)測靶位點(diǎn)兩個(gè)。序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示，SR-BI3’ UTR上存在的miR-96、miR-185和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Mml獼猴；Ssc豬；Bta牛；Eca馬；Cfa犬；Fca貓；Mmu小鼠；Cpo豚鼠；Rno褐家鼠；0cu兔；Ete猬)。
[0131]1.4、miR-96、miR-185 和 miR-223 與 SR-BI3’ UTR 直接作用位點(diǎn)確證。
[0132]將熒光素酶報(bào)告基因插入pcDNA3.1質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建質(zhì)粒pc-luc。按miR-96、miR-185和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)的位置，PCR法分段擴(kuò)增不同長度的SR-BI3’ UTR片段或者使用overlap PCR法將SR-BI3’UTR上miR-185預(yù)測靶點(diǎn)刪除，得到的一系列不同長度的SR-BI3’UTR片段插入至pc-luc質(zhì)粒載體熒光素酶報(bào)告基因下游。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將所構(gòu)建的含有一系列SR_BI3’UTR片段的pc-luc質(zhì)粒載體與miR-96、miR-185和miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑轉(zhuǎn)染至H印G2細(xì)胞，作用48小時(shí)后，突光素酶報(bào)告基因分析技術(shù)檢測突光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性。
[0133]如圖4所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)SR-BI3’ UTR片段中存在miR-96、miR-185和miR-223的相應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)時(shí)，miR-96、miR-185和miR-223能夠顯著降低熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性；當(dāng)SR-BI3’ UTR片段中不存在miR-96、miR-185和miR-223的相應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)時(shí)，miR-96、miR-185和miR-223不呈現(xiàn)降低熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果確證了 miR-96、miR-185和miR-223在SR-BI基因3’ UTR上的作用靶位點(diǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些miRNAs之間存在協(xié)同作用。
[0134]1.5,miR-96,miR-185和miR-223對(duì)肝細(xì)胞攝取Dil-HDL (Dil熒光標(biāo)記的高密度脂蛋白)的影響。
[0135]Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-96、miR-185、miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2、Bel-7402和正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞HL-7702,作用72小時(shí)后，在2 μ g/mL Dil-HDL中孵育4小時(shí)后，流式細(xì)胞檢測肝細(xì)胞對(duì)Dil-HDL的攝取。
[0136]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-96、miR-185、miR-223后，肝細(xì)胞Dil-HDL攝取明顯降低；轉(zhuǎn)染miR-96、miR-185、miR-223的反義寡核苷酸抑制劑后，三種肝細(xì)胞的Dil-HDL攝取明顯升高。表明miR-96、miR-185、miR-223能夠抑制肝細(xì)胞對(duì)HDL的攝取，而miR-96、miR_185、miR-223的反義寡核苷酸 抑制劑能夠增加肝細(xì)胞對(duì)HDL的攝取(如圖6所示)。
[0137]1.6、SR-BI基因在miR-185介導(dǎo)的抑制肝細(xì)胞攝取Dil-HDL過程中的作用。
[0138]用siRNA基因沉默技術(shù)敲除SR-BI基因后，HepG2細(xì)胞SR-BI蛋白表達(dá)顯著降低。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-18572小時(shí)后，2 μ g/mL Dil-HDL中孵育4小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝細(xì)胞Dil-HDL 攝取。
[0139]如圖7所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SR-BI基因沉默后，miR-185下調(diào)Dil-HDL攝取的作用消失，證明miR-185通過SR-BI基因發(fā)揮抑制肝細(xì)胞攝取Dil-HDL的作用。
[0140]實(shí)施例2, miR-96和miR-223對(duì)昍固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的重要靶點(diǎn)ABCAl的調(diào)節(jié)。
[0141]2.1、miR-96、miR-223與ABCA13’ UTR作用靶點(diǎn)預(yù)測及同源性分析。
[0142]MicroRNA.0rg 和 TargetScan 預(yù)測 miR-96 和 miR-223 與 ABCA13’UTR 的作用位點(diǎn)。利用Clustal X2軟件對(duì)多個(gè)物種的ABCA13’ UTR的miR-96和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)。
[0143]預(yù)測結(jié)果如圖8所示，ABCA13’ UTR上存在miR-96和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)各一個(gè)。序列比對(duì)結(jié)果如圖9所示，ABCA13’ UTR上存在的miR-96和miR-223預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ame大熊貓；Mmu小鼠)。
[0144]2.2、miR-96、miR-223及其拮抗劑對(duì)ABCAlmRNA水平的調(diào)節(jié)作用
[0145]Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-96和miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2，作用72小時(shí)后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄，Real-time RT-PCR法測定mRNA水平。
[0146]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，miR-96和miR-223能顯著降低!fepG2細(xì)胞ABCAlmRNA水平，而其反義寡核苷酸抑制劑能顯著提高HepG2細(xì)胞ABCAlmRNA水平。
[0147]實(shí)施例3, miR-185及其桔杭劑對(duì)LDLR的調(diào)節(jié)。
[0148]3.1、miR-185與LDLR3’ UTR直接作用靶點(diǎn)預(yù)測及同源性分析。
[0149]MicroRNA.0rg 和 TargetScan 預(yù)測 miR-185 與 LDLR3’ UTR 的作用位點(diǎn)。利用Clustal X2軟件對(duì)多個(gè)物種的LDLR3’ UTR的miR-185預(yù)測靶點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)。
[0150]預(yù)測結(jié)果如圖11所示，LDLR3’UTR上存在miR-185預(yù)測靶點(diǎn)兩個(gè)。序列比對(duì)結(jié)果如圖12所示，LDLR3’ UTR上存在的miR-185預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Bta牛)。
[0151]3.2、miR-185及其拮抗劑對(duì)LDLR mRNA水平的調(diào)節(jié)
[0152]Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-185或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2，作用72小時(shí)后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄，Real-time RT-PCR法測定mRNA水平。
[0153]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示，miR-185能顯著降低HepG2細(xì)胞LDLR mRNA水平，而其反義寡核苷酸抑制劑能顯著提高HepG2細(xì)胞LDLR mRNA水平。
[0154]實(shí)施例4, miR-96及其桔杭劑對(duì)PPAR- Y的調(diào)節(jié)。
[0155]4.1、miR-96與PPAR-Y 3’ UTR直接作用靶點(diǎn)預(yù)測及同源性分析。
[0156]MicroRNA.0rg 和 TargetScan 預(yù)測 miR-96 與 PPAR- Y 3’ UTR 作用位點(diǎn)。ClustalX2軟件對(duì)多個(gè)物種的PPAR- Y 3’ UTR的miR-96預(yù)測靶點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)。
[0157]預(yù)測結(jié)果如圖14所示，PPAR- Y 3’UTR上存在miR-96預(yù)測靶點(diǎn)。序列比對(duì)結(jié)果如圖15所示，PPAR- Y 3’ UTR上存在的miR-96預(yù)測靶點(diǎn)在多個(gè)物種中呈現(xiàn)序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ssc豬；Bta牛；Fca貓；Mmu小鼠；Rno褐家鼠；Gga雞)。
[0158]4.2、miR-96及其拮抗劑對(duì)PPAR- y mRNA水平的調(diào)節(jié)
[0159]Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-96或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細(xì)胞H印G2，作用72小時(shí)后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄，Real-time RT-PCR法測定mRNA水平。
[0160]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示，miR-96能顯著降低HepG2細(xì)胞PPAR-Y mRNA水平，而其反義寡核苷酸抑制劑能顯著提高H印G2細(xì)胞PPAR- Y mRNA水平
[0161]實(shí)施例5, miR-96、miR-185和miR-223在脂代謝調(diào)節(jié)中的作用。
[0162]5.1、HDL 對(duì) miR-185 和 SR-BI mRNA 水平的調(diào)節(jié)。
[0163]HDL孵育肝癌細(xì)胞IfepG2后，Real-time RT-PCR法測定miR-185的豐度和SR-BImRNA水平。
[0164]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-185的豐度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性下調(diào)效應(yīng)，而SR-BI mRNA水平呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性上調(diào)效應(yīng)(如圖19所示)。說明miR-185和SR-BI均參與到HDL介導(dǎo)的脂質(zhì)調(diào)節(jié)過程。
[0165]5.2、miR-96、miR-185或miR-223在ApoE基因敲除小鼠不同組織或細(xì)胞中的分布。
[0166]取ApoE基因敲除小鼠的肝臟、腎臟、心臟、腸道、肺和脾等器官以及人肝癌細(xì)胞!fepG2、Bel-7402、正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞HL-7702和PMA誘導(dǎo)24小時(shí)后的巨噬細(xì)胞THP-1等細(xì)胞系，Real-time RT-PCR法測定miR-96、miR-185和miR-223在不同組織或細(xì)胞中的豐度。
[0167] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-185和miR-96在小鼠肝臟、腎臟和心臟等器官及人肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞系中均呈現(xiàn)高表達(dá)，而miR-223在人巨噬細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)(如圖20所示)。
[0168]5.3、高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟中miR-96和miR-185的表達(dá)水平。
[0169]ApoE基因敲除小鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周，眼眶取血測定其血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平。同時(shí)取肝臟，Real-time RT-PCR法(Qiagen)測定miR-96和miR-185的豐度。
[0170]ApoE基因敲除小鼠聞脂詞料喂養(yǎng)8周后，血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平明顯升高，肝臟miR-96和miR-185的表達(dá)明顯下調(diào)，而SR-BI的表達(dá)水平顯著升高(如圖17所示)。
[0171]5.4,miR-96,miR-185 和 miR-223 對(duì)巨噬細(xì)胞 SR-BI mRNA 水平和 Dil-HDL 攝取的影響。
[0172]Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-96、miR-185、miR-223至PMA誘導(dǎo)24小時(shí)的巨噬細(xì)胞THP-1，作用72小時(shí)。Real-time RT-PCR法檢測SR-BI mRNA水平，或在2 μ g/mL Dil-HDL中孵育4小時(shí)后，流式細(xì)胞檢測巨噬細(xì)胞對(duì)Dil-HDL的攝取。
[0173]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-96、miR-185和miR-223后，巨噬細(xì)胞SR-BImRNA水平均下調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-185后，Dil-HDL攝取顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-96后，Dil-HDL攝取顯著升高(如圖18所示)。
[0174]盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【權(quán)利要求】
1.微小RNA(microRNA, miRNA)的抑制劑在制備調(diào)節(jié)脂代謝的產(chǎn)品或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA_223中的一種、兩種或三種。
2.微小RNA的抑制劑在制備預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病的產(chǎn)品或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA_223中的一種、兩種或三種；其中所述脂代謝相關(guān)疾病例如為脂代謝素亂導(dǎo)致的聞脂血癥(特別是聞膽固醇血癥、聞甘油二酷血癥等)、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
3.組合物，其含有微小RNA的抑制劑，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種，所述組合物用于調(diào)節(jié)脂代謝，或者用于預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病，所述脂代謝相關(guān)疾病例如為脂代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等)、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
4.微小RNA用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體(SR-BI)表達(dá)水平的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
5.微小RNA的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中人B族I型清道夫受體表達(dá)水平的制劑中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
6.miRNA-96和/或miRNA-223用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al (ABCAl)表達(dá)水平的用途。
7.miRNA-96和/或miRNA-223的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al表達(dá)水平的制劑中的用途。
8.miRNA-185用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)水平的用途。
9.miRNA-185的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)水平的制劑中的用途。
10.miRNA-96用于下調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體、(PPAR- Y )表達(dá)水平的用途。
11.miRNA-96的抑制劑用于上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達(dá)水平的用途或者在制備用于上調(diào)細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR- Y )表達(dá)水平的制劑中的用途。
12.微小RNA的抑制劑在制備用于提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)高密度脂蛋白(HDL)水平和/或降低血液中低密度脂蛋白(LDL)、膽固醇、甘油三酯水平的制劑或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
13.上調(diào)細(xì)胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al、低密度脂蛋白受體或過氧化物酶體增殖物激活受體Y表達(dá)水平的方法，所述方法包括給細(xì)胞施用微小RNA的抑制劑的步驟，或者包括將細(xì)胞與微小RNA的抑制劑相接觸的步驟，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
14.一種篩選用于調(diào)節(jié)脂代謝、或者用于預(yù)防或治療脂代謝相關(guān)疾病的藥物的方法，所述方法包括篩選miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223的抑制劑的步驟；優(yōu)選地，所述方法包括根據(jù)miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別設(shè)計(jì)其反義RNA，或者將miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別與候選物質(zhì)接觸，分別檢測各微小RNA的表達(dá)，并選擇特異抑制 miRNA-96、miRNA-185 或 miRNA-223 表達(dá)的物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-2、4-12任一項(xiàng)的用途、權(quán)利要求3的組合物、權(quán)利要求13或14的方法，其中所述的 微小RNA的抑制劑可以是能夠特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223對(duì)靶基因的調(diào)控作用的任何物質(zhì)，可以是在細(xì)胞中特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達(dá)的物質(zhì)，也可以是與各miRNA具有特異性相互作用，例如與各miRNA特異性結(jié)合的物質(zhì)，或者特異抑制各miRNA與DICER或RISC的相互作用的物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61P3/06GK103961706SQ201310035358
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】洪斌, 王麗, 賈曉健, 姜華軍, 杜郁, 楊帆, 司書毅 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所