專利名稱：用生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)制備正二羥基異黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)制備正二羥基異黃酮的方法，且更詳細(xì)地， 為了有效地制備具有優(yōu)異的抗氧化功能和增白效果的正二羥基異黃酮，提供了一種制 備正二羥基異黃酮的方法，其中，該方法包括用放線菌微生物，特別是阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis) > 皮疽諾卡菌(Nocardiafarcinica)或林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnesis)，以生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮和染料木素。
背景技術(shù)：
異黃酮是一種植物化合物，主要存在于黃豆中，以含有異黃酮作為苷元的糖苷 的形式存在，并且在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)微生物代謝而轉(zhuǎn)化為苷元。異黃酮公知具有抗癌、 抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖和預(yù)防骨質(zhì)疏松的效果，而且相關(guān)研究很活躍。異黃 酮中，特別是7，8，4，-三羥基異黃酮、7，6，4，-三羥基異黃酮、7，3，，4，-三 羥基異黃酮和7，5，3’，4’ -四羥基異黃酮，屬于正二羥基異黃酮(ODIs)，由于相比 其它異黃酮具有更高的抗氧化性能，因此具有更高的價(jià)值，但難以化學(xué)合成。大豆黃酮和染料木素是許多植物和豆類中都有的雙酚植物雌激素。據(jù)報(bào)導(dǎo)， 這些化合物具有抗氧化、抗微生物和金屬螯合效應(yīng)(Middleton等.，1992 ； Dixon等.， 2002)。而且，這些化合物用作人類健康的醫(yī)學(xué)的或化學(xué)的治療劑(Foti等，2005)。近 來(lái)，位點(diǎn)特異的羥基化產(chǎn)物的關(guān)注度正在上升。據(jù)報(bào)導(dǎo)，與大豆黃酮和染料木素相比， 正位-特異的羥基化異黃酮具有更高的生物活性(Rufer和Kulling，2006)，且被公知為具 有抗炎和抗過(guò)敏活性(Rufer和Kulling，2006)。此外，它們是酪氨酸激酶的抑制劑，具 有抗癌屬性(Akiyama等.，1987)，并被用作潛在的酪氨酸酶抑制劑和脂肪氧合酶抑制劑 (Chang等，2005; Voss等，1992)。另外，已有報(bào)導(dǎo)其用作減少誘發(fā)腫瘤相關(guān)疾病的化 合物的用途(Klus和Barz，1995 ； Coward等，1993)。這種羥基化產(chǎn)物難以通過(guò)有機(jī)化 學(xué)的方法合成，所以只能通過(guò)從天然材料中提取或生物合成的方法得到。如上所述，羥基化的異黃酮只能通過(guò)從天然材料中提取或通過(guò)微生物生物合成 而分離和純化得到。在從天然材料中提取的情況下，作為異黃酮的主要化合物，大豆 黃酮和染料木素可以容易地得到，但是大豆黃酮和染料木素的羥基化形式卻不能如此得 至IJ。換言之，黃豆和植物中含有的正二羥基異黃酮得到的產(chǎn)率低，而且通過(guò)微生物對(duì)他 們進(jìn)行生物合成的研究較少。在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)分析了從天然材料中低產(chǎn)率地提取羥基化的化合物和用微 生物獲得低活性的羥基化的化合物，但是還未有通過(guò)微生物生產(chǎn)正二羥基異黃酮的報(bào) 導(dǎo)。此外，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了正二羥基異黃酮與動(dòng)物肝臟細(xì)胞的反應(yīng)性，但是由于低反應(yīng)性導(dǎo) 致產(chǎn)量仍然很低(Kulling等，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有抗氧化功能和增白效果的正二羥基異黃酮可以通過(guò)用放線菌微生物(特別是阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)，皮疽諾卡菌(Nocardia farcinica)或林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnesis)生物)轉(zhuǎn)化大豆黃酮和染料木素而有效
地制備，從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的是為了提供一種通過(guò)生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮和染料木素來(lái)制備
正二羥基異黃酮的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種通過(guò)用放線菌微生物(特別是鏈霉菌屬 (Streptomyces sp.)或諾卡菌屬(Nocardia farcinica)的微生物)生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮和染料木 素來(lái)制備正二羥基異黃酮(ortho-dihydroxyisoflavones)的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種特異地生產(chǎn)和積累作為抗氧化物質(zhì)或增白物質(zhì)的 ODIs的制備方法，其中，該方法使用放線菌類微生物，并生物合成出修飾的化合物。本 發(fā)明將會(huì)成為科學(xué)領(lǐng)域和工業(yè)應(yīng)用中具有高附加值的發(fā)明。


圖1表示各種測(cè)試物質(zhì)的HPLC分析結(jié)果。(1)作為代謝物的7，3，，4，-三 羥基異黃酮；峰(2)作為底物的大豆黃酮；峰(3)作為代謝物的7，5，3’，4’ -四 羥基異黃酮；以及峰(4)作為底物的染料木素。HPLC分析在以下條件下進(jìn)行UV: 254nm ；流速lml/min ；且使用的溶劑ACN DW = 3 7(含有1%1卩八)。圖2表示7，3，，4，-三羥基異黃酮的NMR分析結(jié)果。圖3表示7，5，3，，4，-四羥基異黃酮的NMR分析結(jié)果。圖4表示用阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮的反應(yīng)器。 (A)現(xiàn)有的反應(yīng)器；和(B)用于本發(fā)明以使氧氣供應(yīng)平穩(wěn)的間歇式反應(yīng)器。圖5表示通過(guò)GC-MS分析底物大豆黃酮和反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)果，該分析使用BSTFA 衍生化而進(jìn)行。1)大豆黃酮，室溫，18.5分鐘，MS 398; 2)7，3，，4，-三羥基異 黃酮，室溫，24.4分鐘，MS 486; 3)7，8，4，-三羥基異黃酮，室 溫，25.1分鐘，MS 486 ；和4)7，6，4，三羥基異黃酮，室溫，26.8分鐘，MS 486。圖6表示通過(guò)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮產(chǎn)生的多
種修飾的異黃酮的結(jié)構(gòu)。圖7表示阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)與大豆黃酮的反應(yīng)的結(jié)果和GC分
析的結(jié)果(反應(yīng)條件使用螺旋管(coils)，220轉(zhuǎn)，反應(yīng)時(shí)間1個(gè)月，使用R2YE培養(yǎng)基)。圖8表示通過(guò)BSTFA衍生的方法進(jìn)行分析的示意圖。圖9和圖10表示測(cè)試物質(zhì)的MS譜圖分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式在下文中，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種使用放線菌微生物制備所需化合物即正_特異性的羥基化異黃 酮的方法。本發(fā)明中，首次展現(xiàn)了能夠使用大豆黃酮和染料木素作為底物來(lái)制備正二羥 基異黃酮的微生物菌株。本發(fā)明展現(xiàn)的微生物菌株包括阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、皮疽諾卡菌(Nocardiafarcinica)和林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnesis)。 在這些菌株中，阿維鏈 霉菌(Streptomyces avermitilis)表現(xiàn)出最高的正二羥基異黃酮的產(chǎn)率，并且表現(xiàn)出在染料 木素3’位上的位點(diǎn)特異的羥基化作用。盡管本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域通用的，其含義也是本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員 可以共知的，仍然將所述術(shù)語(yǔ)簡(jiǎn)要定義如下DODI 正二羥基異黃酮。
2)ISP2培養(yǎng)基(每1升)5克麥芽提取物，2克酵母提取物和2克葡萄糖。3) YEME培養(yǎng)基(每1升)3克麥芽提取物，3克酵母提取物，5克蛋白胨， 300 克蔗糖，2ml MgCl2 · 6H20(2.5M)和 25ml 甘氨酸(20% ) 4)R2YE培養(yǎng)基103克蔗糖，10克葡萄糖，0.25克K2SO4, 5克酵母提取物， 0.1 酪蛋白水解物(Difco casamino acid)，IOOml TES 緩沖液(5.73 %，pH 7.2)，IOmL KH2PO4(0.5% )，80ml CaCl2 · 2H20(3.68% )，15mL L-脯氨酸(20% ), 2ml 微量元素 溶液和 5ml NaOH (IN)。5) HPLC 高效液相色譜。6) GC-MS 氣相色譜_質(zhì)譜。7) NMR:核磁共振波譜儀。8)BSTFA 用于GC分析的衍生物。N，O-雙(三甲硅烷基)三氟乙酰胺。9)rpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)或圓盤的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述方法包括使用所展現(xiàn)的菌株生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮和染料 木素的步驟。即，本發(fā)明包括如下的反應(yīng)式1的使用所展現(xiàn)的菌株從大豆黃酮和染料木 素制備3’特異的羥基化的化合物的生物轉(zhuǎn)化方法。反應(yīng)式權(quán)利要求
1.一種制備正二羥基異黃酮的方法，其中，該方法包括通過(guò)放線菌微生物來(lái)生物轉(zhuǎn) 化大豆黃酮或染料木素的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物轉(zhuǎn)化是通過(guò)大豆黃酮和染料木素的 3’位置上的位點(diǎn)特異性羥基化作用而進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述放線菌微生物選自由阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis) > 皮疽諾卡菌(Nocardiafarcinica)禾口林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnesis)組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物轉(zhuǎn)化在能夠通入氧氣的間歇式反應(yīng)器 中進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述正二羥基異黃酮選自由7， 8，4，-三羥基異黃酮、7，6，4，-三羥基異黃酮、7，3，，4，-三羥基異黃酮和7， 5，3’，4’ -四羥基異黃酮組成的組。
全文摘要
在此公開(kāi)了一種用生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)制備正二羥基異黃酮的方法。更詳細(xì)地，為了有效地制備具有優(yōu)異的抗氧化功能和增白效果的正二羥基異黃酮，所公開(kāi)的制備正二羥基異黃酮的方法包括用放線菌微生物(特別是阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、皮疽諾卡菌(Nocardia farcinica)或林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnesis))來(lái)生物轉(zhuǎn)化大豆黃酮和染料木素。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102016054SQ200880128827
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者P·P·比什努, 盧唱賢, 盧浩植, 崔權(quán)永, 張利燮, 徐修賢, 樸惠胤, 樸葰星, 車玟鎬, 金俊亨, 金德熙, 金秉祺 申請(qǐng)人:株式會(huì)社太平洋