專利名稱：存儲(chǔ)穩(wěn)定狀態(tài)的核酸的新的皮膚取樣試劑盒、通過(guò)使用該試劑盒的基因測(cè)試方法及其實(shí) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基因測(cè)試的新的皮膚基因卡、使用該基因卡獲得DNA和RNA及進(jìn) 行各種基因測(cè)試的方法及其實(shí)踐應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明的發(fā)明人已開(kāi)發(fā)能夠簡(jiǎn)單、安全和 迅速地從人皮膚、毛發(fā)或粘膜獲得樣品并能夠在室溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定存儲(chǔ)和運(yùn)送所得樣品中包 括的DNA和RNA的皮膚基因卡。使用所得DNA和RNA進(jìn)行各種基因測(cè)試，該基因測(cè)試包括 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR、實(shí)時(shí)PCR、測(cè)序、雜交、DNA芯片分析、單核苷酸多 態(tài)性(SNP)分析、基因突變分析、啟動(dòng)子甲基化分析、基因表達(dá)分析等。該基因皮膚測(cè)試結(jié) 果可用于疾病預(yù)后、營(yíng)養(yǎng)基因組測(cè)試(nutrigenomic test)、藥物基因組測(cè)試、法醫(yī)檢驗(yàn)，例 如身份鑒定、基因疾病診斷、皮膚病診斷等。另外，通過(guò)客觀評(píng)價(jià)皮膚或毛發(fā)狀態(tài)，可以為美 容護(hù)理、美容學(xué)、皮膚病學(xué)和臨床實(shí)踐中的實(shí)踐應(yīng)用確立個(gè)性化的化妝品和皮膚護(hù)理系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
包括人在內(nèi)的多細(xì)胞有機(jī)體由眾多細(xì)胞組成。細(xì)胞核具有存儲(chǔ)遺傳信息的DNA。 儲(chǔ)藏遺傳信息的基本單位稱為基因?；蚴荄NA的一部分。蛋白質(zhì)介導(dǎo)所有生物現(xiàn)象和細(xì) 胞功能?；蚴且龑?dǎo)和傳遞用于合成蛋白質(zhì)的一系列命令的巨大信息單位。每個(gè)基因均具 有合成一種或多種特異蛋白所需的特異遺傳密碼。DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu)。每條螺旋鏈均由眾多稱為堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)單位組成。有四 種類型的DNA堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。這些堿基的序列 或堿基序列決定遺傳信息。為了將DNA遺傳信息物質(zhì)化為細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，需要中 間介體(intermediate mediator)，該介體稱為RNA。DNA的遺傳信息首先被復(fù)制到mRNA 中。這個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。然后，在細(xì)胞質(zhì)中，在tRNA和rRNA(翻譯)的幫助下，核糖體對(duì) mRNA的遺傳信息解碼成為蛋白質(zhì)。三個(gè)堿基指定單個(gè)氨基酸。三核苷酸單位稱為密碼子。 核糖體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)通過(guò)翻譯后修飾制備成活化蛋白。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，DNA復(fù)制并完全相 同地轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞中。個(gè)體所有細(xì)胞中具有相同的DNA。所有細(xì)胞的類型、結(jié)構(gòu)和功能， 及個(gè)體的身體狀態(tài)和疾病發(fā)展可通過(guò)在細(xì)胞中被表達(dá)的蛋白質(zhì)的類別和量確定，該類別和 量又可根據(jù)哪個(gè)RNA被轉(zhuǎn)錄到何種程度進(jìn)行確定。也就是說(shuō)，在每個(gè)細(xì)胞中被表達(dá)的基 因類別和量的差異起到重要作用。實(shí)際上，在個(gè)體細(xì)胞中被表達(dá)的基因百分比僅為3-5% (Aressns J, Armstrong Μ, Gilissen R, Cohen N. The human genome :an introduction. Oncologist. 2001 ；6 100-109)。有機(jī)體具有的全組基因稱為基因組。相比，在個(gè)體中被表達(dá)的所有基因(即， mRNA)的組稱為轉(zhuǎn)錄組，以及表達(dá)的蛋白質(zhì)的全部補(bǔ)體(complement)稱為蛋白質(zhì)組。人基 因組占據(jù)總數(shù)超過(guò)30億的堿基對(duì)，并據(jù)報(bào)道含有約30，000個(gè)基因。對(duì)于最近完成的人類 基因組計(jì)劃，其主要目標(biāo)是確定全人類基因組的堿基序列，在使用基因診斷和處理疑難病 癥中取得顯著發(fā)展，并打開(kāi)了所謂個(gè)性化藥物和預(yù)測(cè)藥物的新紀(jì)元。生物現(xiàn)象通過(guò)(1)基因組DNA的遺傳信息、(2)基因的轉(zhuǎn)錄和(3)表達(dá)的蛋白質(zhì)確定。最近，研究人員積極進(jìn)行研究，從而自動(dòng)分析所有這些信息。對(duì)于這個(gè)目的，微 陣列或生物芯片是非常有用的。例如，使用如cDNA微陣列技術(shù)，試圖研究生理學(xué)、病理學(xué) 和皮膚功能。而且，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其他技術(shù)可用于診斷皮膚感染和檢測(cè)病原 體。盡管預(yù)期更好地理解皮膚病的診斷可通過(guò)經(jīng)由基因測(cè)試準(zhǔn)確評(píng)價(jià)皮膚狀況實(shí)現(xiàn)，但實(shí) 際應(yīng)用或確切的結(jié)果卻很少?；蚱つw測(cè)試似乎可應(yīng)用到個(gè)性化皮膚處理、美容護(hù)理和化 妝品中，但相關(guān)報(bào)道卻很少(Fuller BR 等人.Gene array technology and the search for cosmeceutical actives.在Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005) 為了將基因皮膚測(cè)試投入實(shí)際應(yīng)用，需要解決許多問(wèn)題。特別地，大量研 究是關(guān)于怎樣以非侵害的方式適當(dāng)?shù)孬@得皮膚樣品，怎樣分析基因，怎樣診斷皮膚病和基 于結(jié)果評(píng)價(jià)皮膚狀況，以及怎樣將其實(shí)際應(yīng)用于個(gè)性化皮膚護(hù)理中。本發(fā)明的目的在于解 決這些問(wèn)題。使用DNA或RNA樣品進(jìn)行基因研究的其中一個(gè)最大問(wèn)題是室溫下核酸被迅速降 解。尤其，RNA可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)被核糖核酸酶(RNase A)降解，核糖核酸酶是在分離過(guò)程由 細(xì)胞分泌的且其在環(huán)境中是豐富的。本發(fā)明的發(fā)明人已開(kāi)發(fā)使用殼聚糖在室溫下長(zhǎng)時(shí)間 以卡或液體形式穩(wěn)定存儲(chǔ)RNA和DNA的方法，并已獲得專利或已申請(qǐng)相關(guān)專利。RNA和DNA 卡、PCR和逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCT試劑盒，和基于此的微陣列芯片用于存儲(chǔ)、運(yùn)送(carry)和分析 多DNA和RNA樣品。在本發(fā)明中，RNA卡用于開(kāi)發(fā)皮膚基因測(cè)試的試劑盒。皮膚是身體最大的器官，平均面積為1. 6m2并占成年人身體體重的約16%。它的 結(jié)構(gòu)、功能和生理機(jī)能都非常復(fù)雜。最近，隨著分子遺傳學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)關(guān)于 皮膚結(jié)構(gòu)、功能、生理機(jī)能、老化和疾病發(fā)展機(jī)制的新事實(shí)。皮膚保護(hù)身體免受外部刺激或危險(xiǎn)的損害，并，例如通過(guò)體溫調(diào)節(jié)使身體習(xí)慣于 環(huán)境變化。它的其他功能是感覺(jué)、分泌、排泄和內(nèi)分泌荷爾蒙如維生素D和細(xì)胞因子等、免 疫和再生。進(jìn)一步地，它在美容護(hù)理中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。皮膚由外至內(nèi)由三個(gè)主要層組成，表皮、真皮和皮下脂肪層(皮下組織)。皮膚附 件包括毛發(fā)、皮脂腺、汗腺(分泌腺)、毛細(xì)血管等。表皮是三個(gè)皮膚層中最薄的，但對(duì)皮膚保濕和皮膚保護(hù)發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步 地，它可以阻止水分流失和組織損傷以及病原體的侵害。組成表皮的細(xì)胞的主要類型是角 質(zhì)形成細(xì)胞，其中也存在黑素細(xì)胞、朗氏細(xì)胞和默克爾(Merkel)細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞在分 化時(shí)從基底層向上移動(dòng)，從而形成最外面的角化層(角質(zhì)層)。死的角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚表 面脫落。角質(zhì)層是防御皮膚的第一屏障。黑素細(xì)胞具有在角質(zhì)形成細(xì)胞中延伸(extend) 的長(zhǎng)樹(shù)突。黑色素被運(yùn)送到角質(zhì)形成細(xì)胞并吸收或分散UV，從而保護(hù)皮膚免受損傷。在功能方面，皮膚可以看作是提供保護(hù)以免受有害物質(zhì)或外部刺激影響的屏障。 它對(duì)理解這種皮膚屏障機(jī)制，及生理和病理學(xué)都非常重要。皮膚屏障功能中最重要的是表 皮的角質(zhì)層。角質(zhì)層由角層細(xì)胞(corneocytes)和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)組成。角質(zhì)層由蛋白質(zhì)(40%)、 水(40% )和脂質(zhì)(10-20% )組成。若將皮膚層比作磚墻，角層細(xì)胞類似于磚，而脂質(zhì)結(jié)構(gòu) 起灰泥的作用。皮膚保濕是健康皮膚的先決條件。它主要通過(guò)角質(zhì)層實(shí)現(xiàn)。角質(zhì)層通過(guò)(1)角層 細(xì)胞產(chǎn)生的天然保濕因子(NMF)、(2)角層細(xì)胞之間的脂質(zhì)層、(3)細(xì)胞橋粒和(4)皮脂腺 分泌的皮脂保持皮膚濕潤(rùn)。表皮的脂質(zhì)層主要由神經(jīng)酰胺、膽固醇和游離脂肪酸組成。
真皮厚度是表皮的約15-40倍，并占據(jù)皮膚的最大體積。它由兩層組成，乳頭狀 真皮層(papillary dermis)和網(wǎng)狀真皮層。真皮的結(jié)構(gòu)性組分(Structural component) 是細(xì)胞、結(jié)締組織和細(xì)胞外基質(zhì)。真皮中存在的細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、組織細(xì)胞、肥大 細(xì)胞、朗氏細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。除此之外，還存在皮膚附件，例如血管、淋巴管、神 經(jīng)、立毛肌(arrector pili)、分泌腺、頂泌汗腺、小汗腺管(eccrine duct)、毛皮脂單位 (pilosebaceous unit)、指甲(nail)等。真皮向表皮提供營(yíng)養(yǎng)物，支撐表皮，保護(hù)身體免 受皮膚損傷，通過(guò)與表皮配合再生皮膚，存儲(chǔ)水分，調(diào)節(jié)體溫，并可用作感覺(jué)受體(receptor of sensation)0真皮的結(jié)締組織富含纖維，例如膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維等。主要組分是膠 原和彈性蛋白。特別地，膠原是豐富的。皮膚中有五種膠原型，型1、3、4、7和8。其中，型 1是最豐富的，占80-85%。膠原和彈性蛋白形成表皮下的纖維結(jié)締組織，從而支撐表皮和 提供彈性和柔性。存在分解膠原的酶，其中最重要的是基質(zhì)金屬蛋白酶1 (MMP1，膠原酶1)。 組織中還存在抑制MMPl的物質(zhì)。它稱為金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)。皮膚中膠原含 量通過(guò)膠原合酶、MMP和TIMP維持恒定。然而，當(dāng)因減少的膠原合成、過(guò)度的MMPl作用、減 少的TIMP或類似情況造成平衡破壞時(shí)，皮膚將失去彈性并因膠原減少而形成皺紋。除了自 然老化過(guò)程之外，諸如UV、炎癥和超氧化物基團(tuán)等不良因素可加速M(fèi)MPl的生成，從而加速 皮膚老化和惡化皺紋。真皮基質(zhì)由糖胺聚糖或粘多糖組成。主要組分是透明質(zhì)酸(也稱為透明質(zhì)多糖 (hyaluronan))和硫酸軟骨素。也包括硫酸乙酰肝素。這些物質(zhì)具有非常強(qiáng)的保濕能力。 皮膚中存在數(shù)種類型的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)。其中，HAS3存在于表皮角層細(xì)胞中，而HAS2 存在于真皮成纖維細(xì)胞中。最近，觀測(cè)到水通道蛋白水通道蛋白3 (water channel protein aquaporin 3) (AQP3)在皮膚中被表達(dá)。該蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)皮膚補(bǔ)水中發(fā)揮著重要作用。皮下組織也稱為皮下脂肪層，其由脂肪組織組成。它向表皮和真皮提供營(yíng)養(yǎng)物，決 定體形，維持體溫，并用作身體的絕熱體。它位于真皮下面，由血管、淋巴管、神經(jīng)和脂肪細(xì) 胞組成，并用作抵抗外壓的墊層(cushion)。根據(jù)皮脂和水分的含量，人的皮膚通常分為4種類型(1)正常型、(2)油型、(3) 干型和(4)混合型。最近，添加了作為第5種皮膚類型的敏感型，且老化程度與皮膚類型一 起被評(píng)價(jià)。然而，皮膚類型可不斷地變化，因?yàn)樗芨鞣N因素影響，這些因素包括年齡、性 別、荷爾蒙狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、生活模式、環(huán)境等。皮膚類型的分類對(duì)適當(dāng)?shù)钠つw護(hù)理和化妝品 的選擇非常重要。皮膚護(hù)理和化妝品是關(guān)于皮膚的最重要的事項(xiàng)。化妝品的定義在不同國(guó)家有所 不同。在韓國(guó)和日本，化妝品被定義為涂、噴灑或其他方式施用到皮膚或毛發(fā)上從而保持 人體潔凈、美麗或健康并對(duì)人體作用小的物質(zhì)。相比之下，在美國(guó)，化妝品被定義為用于 漂洗、美化或增強(qiáng)人體外觀而不改變結(jié)果或功能的物質(zhì)。在歐洲，牙齒或口腔粘膜也被包 括。相對(duì)地，具有藥學(xué)效果或結(jié)構(gòu)上或功能上改變?nèi)梭w的物質(zhì)則歸類為藥物。最近，生產(chǎn)了 許多屬于在二者之間的對(duì)人皮膚的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生效果的化妝品。它們稱為藥用化妝品 (cosmeceutical)(Sung-ku Ahn, Seung-Hun Lee. Skin aesthetics. Korea Medical Book Publisher. 2002 ；Cosmeceuticals. Edited by Draelos ZD.Elsevier Saunders，2005)。基本上，化妝品必須是穩(wěn)定、安全、有效和舒適的。在此，有效指的是在物理化學(xué)、生理學(xué)和心理學(xué)方面的有效。例如，它是指補(bǔ)水、抗皺、抗老、皮膚增白、軟化、染色或清 潔(cleanse)效果。因?yàn)椴煌娜似つw類型和狀況有所不同，因此選擇合適的化妝品是 重要的。進(jìn)一步地，確定在使用化妝品之前和之后準(zhǔn)確和客觀評(píng)價(jià)效果的標(biāo)準(zhǔn)是重要的 (Sung-ku Ahn,Seung-Hun Lee. Skin aesthetics. Korea Medical Book Publisher· 2002)。用于評(píng)價(jià)人皮膚狀況和化妝品或藥用化妝品效果的方法包括(1)形態(tài)測(cè)試(成 像研究)，⑵皮膚顏色分析，⑶皮膚柔軟度和彈性測(cè)試，⑷皮膚溫度和血流測(cè)試，(5)經(jīng) 皮水分流失(TEWL)測(cè)試，(6)皮膚水化測(cè)試(skin hydration test), (7)脂質(zhì)含量評(píng)價(jià)， (8) UV阻斷效果測(cè)試，(9)毛發(fā)保濕和損傷評(píng)價(jià)和(10)超聲測(cè)試(Sung-ku Ahn, Seung-Hun Lee. Skin aesthetics. Korea Medical Book Publisher. 2002 ；Grove GL等人· Evaluating cosmeceutical efficiency.在Cosmeceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders,2005)。然而，這些測(cè)試中大部分聚焦皮膚結(jié)構(gòu)、形狀、生理學(xué)或病理學(xué)之一，并因缺少客 觀性和再現(xiàn)性而局限于實(shí)際應(yīng)用。因此，需要一種能夠準(zhǔn)確和客觀評(píng)價(jià)人皮膚狀況的新測(cè) 試方法，從而有助于分類皮膚類型，選擇個(gè)性化化妝品或藥用化妝品，并在其應(yīng)用后評(píng)價(jià)效 果。這也是本發(fā)明所致力于的。當(dāng)今，美化和清潔人體和保持皮膚或毛發(fā)健康的化妝品的傳統(tǒng)概念，隨著積極改 變和改進(jìn)皮膚的功能化妝品的到來(lái)而改變。也就是說(shuō)，可用作化妝品和藥物的藥用化妝品 變成主流?；瘖y品工業(yè)是綜合性工業(yè)，包括化學(xué)、生物、藥物學(xué)和皮膚病學(xué)的基礎(chǔ)應(yīng)用技術(shù)。 當(dāng)前，因?yàn)樵谄渲幸肓朔肿舆z傳學(xué)，試圖更準(zhǔn)確地理解皮膚生理活性和分子病理學(xué)，并開(kāi) 發(fā)個(gè)性化皮膚護(hù)理、化妝品和藥用化妝品。皮膚患上的多種疾病具有多種癥狀和征象。皮膚病包括遺傳病、精神皮膚病 (psychocutaneous disorder)、光敏性皮膚病、物理因素誘導(dǎo)的皮膚病、職業(yè)性皮膚病、 蕁麻疹、紅斑、藥疹、濕疹、牛皮癬、免疫病癥、感染病、性傳播疾病、色素病癥(pigmentary disorder)、血管病、結(jié)締組織病癥、皮下組織病癥、皮脂腺和汗腺疾病、毛發(fā)病、指甲病、良 性和惡性腫瘤、癌前病變和粘膜病。由諸如內(nèi)分泌病或新陳代謝紊亂等全身疾病引起的皮 膚病是罕見(jiàn)的。感染可通過(guò)細(xì)菌、肺結(jié)核菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等引起。性傳播感染也可引 起皮膚病。皮膚中發(fā)生的病癥包括癢(搔癢癥)、灼熱(scorching)、灼痛(burning)、疼 痛(pain)、感覺(jué)減退(hypoesthesia)、麻木等。皮膚病相關(guān)的征象包括初始原發(fā)性損害 和由原發(fā)性損害發(fā)展的繼發(fā)性損害。原發(fā)性損害包括斑點(diǎn)(macule)、斑片(patch)、丘疹 (papule)、斑塊(plaque)、節(jié)瘤(nodule)、月中瘤(tumor)、風(fēng)疫塊(wheal)、小泡(vesicle) 等，而繼發(fā)性損害包含鱗屑(scale)、結(jié)皮(crust)、表皮脫落(excoriation)、糜爛 (erosion)、潰蕩(ulcer)、癥痕(scar)、開(kāi)裂(fissure)和苔蘚樣硬化(Iichenification)。皮膚的診斷似乎容易，因?yàn)榭芍苯涌吹健Ｈ欢?，不同皮膚病可展現(xiàn)出相似病癥和 征象，且對(duì)于相同的患者，和對(duì)于相同的疾病，根據(jù)階段可觀測(cè)到不同外觀。因此，僅用經(jīng) 面談病癥的主觀檢查或征象的體格檢查很難診斷。甚至皮膚科醫(yī)生都會(huì)發(fā)現(xiàn)很難診斷一 些疾病。診斷皮膚病的測(cè)試包括用于檢測(cè)細(xì)菌感染的革蘭氏染色和培養(yǎng)(Gram staining and culturing)、用于檢測(cè)真菌感染的KOH染色和培養(yǎng)、用于檢測(cè)單純性皰疹和帶狀皰 疹(herpes zoster)的Tzanck測(cè)試、用于檢測(cè)擠疫的刮傷擠疫(scabies scraping)、用于檢測(cè)梅毒的暗場(chǎng)檢驗(yàn)(dark-field examination)、斑貼測(cè)試(patch test)、通過(guò)注 射刺激皮膚、刺(pricking)或刮傷(scratching)并監(jiān)測(cè)反應(yīng)、皮膚劃痕現(xiàn)象測(cè)試、玻片 壓診(diascopic examination)、伍氏燈檢查(Wood ‘ s lamp examination)等。除非 通過(guò)上面測(cè)試作出診斷，否則皮膚活組織檢查是必要的，在該皮膚活組織檢查中，皮膚組 織在通過(guò)免疫組織化學(xué)染色或免疫熒光測(cè)試染色之后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)，或使用 MitHiiif^lIlJ (Sung-ku Ahn, Seung-Hun Lee. Skin aesthetics. Korea Medical Book Publisher. 2002 ；Korean Dermatological Association Textbook Publishing Committee. Dermatology.第 4 版· Ryo Moon Gak. 2001)。然而，所有前述測(cè)試僅在顯微鏡下監(jiān)測(cè)皮膚損害的結(jié)構(gòu)變化，而未能監(jiān)測(cè)生理、功 能、生物化學(xué)，及其分子和遺傳性改變。因此，它們?cè)跍?zhǔn)確性和效果上都有局限性。因此，迫 切需要能夠鑒定皮膚病的根本原因和發(fā)展及確定最佳的個(gè)性化治療的新測(cè)試方法?？赏ㄟ^(guò)在皮膚中被表達(dá)的基因、從而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等的組合物 的變化，和組成皮膚的細(xì)胞的狀態(tài)，確定皮膚狀況和類型。不僅繼承的遺傳因素，還有后天 的因素，例如環(huán)境因素、飲食和生活模式都可影響它們。因而，調(diào)查繼承的遺傳因素和檢查 皮膚中被表達(dá)的基因?qū)⑻峁?duì)皮膚狀況最準(zhǔn)確和根本的認(rèn)識(shí)。這也是本發(fā)明目的所致力于 的。

發(fā)明內(nèi)容
[技術(shù)問(wèn)題]目前，在皮膚病診所、化妝品和整容整形診所、美容護(hù)理店，和全世界化妝品公司 中，都進(jìn)行經(jīng)面談的醫(yī)學(xué)檢查、體格檢查、理化檢查，和使用各種儀器的形態(tài)檢查，以評(píng)價(jià)皮 膚狀況和診斷皮膚病。然而，已有的測(cè)試方法在從根本上和客觀上評(píng)價(jià)所有個(gè)體皮膚方面 是有限的。進(jìn)一步地，迄今為止，還沒(méi)有科學(xué)上標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試方法?，F(xiàn)在可獲得的最客觀的測(cè) 試方法是在活組織檢查之后監(jiān)測(cè)皮膚微結(jié)構(gòu)的變化。然而，該方法是非侵害的，不能監(jiān)測(cè)生 理、功能或生物化學(xué)變化。因此，需要能夠準(zhǔn)確和客觀評(píng)價(jià)人皮膚狀況，從而有助于皮膚類 型分類，選擇個(gè)性化化妝品或藥用化妝品，和評(píng)價(jià)應(yīng)用后的效果的新方法。本發(fā)明目的在于 提供此種方法。在這個(gè)方面，最有前途的方法是基因測(cè)試。通過(guò)皮膚中表達(dá)的基因，從而產(chǎn)生的蛋 白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等的組合物的變化，和組成皮膚的細(xì)胞的狀態(tài)可確定皮膚狀況及類 型和皮膚病的發(fā)病。不僅繼承的遺傳因素，還有后天的因素，例如環(huán)境因素、飲食和生活模 式都可影響它們。因而，調(diào)查繼承的遺傳因素和檢查皮膚中表達(dá)的基因?qū)⑻峁?duì)皮膚狀況 最準(zhǔn)確和根本的認(rèn)識(shí)。然而，為了實(shí)際應(yīng)用皮膚基因，許多問(wèn)題仍待解決。首先，安全獲得 適于測(cè)試和運(yùn)送的皮膚樣品的方法未確立。其次，從所得皮膚樣品中獲得特異基因和進(jìn)行 包括形態(tài)、突變和表達(dá)的各種基因測(cè)試的方法未確立。第三，將測(cè)試結(jié)果應(yīng)用于實(shí)際臨床診 斷或化妝品目的的方法和標(biāo)準(zhǔn)未確立。如果可以安全和簡(jiǎn)單地獲得，皮膚可能是用于各種 基因測(cè)試的最佳樣品。[技術(shù)方案]如上所述，人皮膚由數(shù)層組成。在真皮和表皮中，甚至在相同表皮中，不同的細(xì)胞， 即，角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、朗氏細(xì)胞等表達(dá)不同基因。因此，確保穩(wěn)定并具有統(tǒng)一厚度的皮膚取樣的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化是先決條件。除此之外，對(duì)于不僅適用于臨床目的，而且適用于 化妝品或其他目的的皮膚取樣方法，該方法必須安全、非侵害且簡(jiǎn)單。如果可以，優(yōu)選公眾可 以使用的“(自制(DIY)) ”方法。為了克服現(xiàn)有基因皮膚測(cè)試方法的不足，需要能夠進(jìn)行安全 和穩(wěn)定的皮膚取樣的方法。除此之外，要保證從皮膚樣品中獲得優(yōu)質(zhì)和適量的DNA和RNA。進(jìn)一步地，利用皮膚基因卡獲得包括在樣品中的DNA和RNA，進(jìn)行復(fù)雜和各種基因 測(cè)試應(yīng)當(dāng)是可能的。此種測(cè)試的實(shí)施例如下用于擴(kuò)增特異基因的一些或所有DNA的聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用于擴(kuò)增特異表達(dá)的基因的一些或所有DNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR，用于量 化基因表達(dá)水平的實(shí)時(shí)RT-PCR，使用質(zhì)粒載體和E. coli克隆通過(guò)PCR和RT-PCR獲得的基 因，PCR之后的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，經(jīng)由自動(dòng)測(cè)序分析或寡聚核苷酸微陣 列(寡DNA芯片)和隨后單核苷酸多態(tài)性和突變的分析的特異基因的堿基測(cè)序，經(jīng)由cDNA 微陣列的基因表達(dá)差異的同步分析，和經(jīng)由甲基化特異性PCR(MSP)和亞硫酸氫鹽基因組 測(cè)序的啟動(dòng)子甲基化作用的分析。第三，所確立的基因測(cè)試方法應(yīng)當(dāng)適用于現(xiàn)行的臨床實(shí)踐、美容護(hù)理和其他領(lǐng)域。 例如，需要通過(guò)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)皮膚保護(hù)身體、保濕、再生等功能更準(zhǔn)確地和客觀地分類皮膚類 型，以便該結(jié)果可用于選擇個(gè)性化皮膚護(hù)理、化妝品和藥用化妝品。特別地，該測(cè)試方法應(yīng) 當(dāng)對(duì)確定干燥、老化、光老化或敏感皮膚和治療它們有幫助。除此之外，它應(yīng)當(dāng)可以準(zhǔn)確診 斷包括炎癥、濕疹、免疫相關(guān)疾病、感染、牛皮癬等的疑難皮膚病，和應(yīng)當(dāng)可以選擇適當(dāng)?shù)闹?療。進(jìn)一步地，該測(cè)試方法應(yīng)當(dāng)可應(yīng)用于各種基因測(cè)試中，這些基因測(cè)試包括診斷遺傳性基 因疾病、身份鑒定和親子認(rèn)定、在器官移植之前的基因分型等等。本發(fā)明旨在提供這些問(wèn)題的解決方法。[有益效果]根據(jù)本發(fā)明的皮膚基因卡試劑盒能夠從來(lái)自人體皮膚、毛發(fā)、粘膜等的各種樣品 中非侵害地和簡(jiǎn)單地取樣，并能夠在使得樣品中包括的DNA和RNA甚至在室溫下長(zhǎng)時(shí)期安 全的情況下存儲(chǔ)和運(yùn)送該樣品。DNA和RNA可容易地和穩(wěn)定地從樣品中獲得，且它們可應(yīng) 用于各種基因測(cè)試，這些基因測(cè)試包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄(肌)寸0 、實(shí)時(shí)？0 、 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP) ,Northern雜交、克隆、堿基測(cè)序、寡聚核苷酸微陣列分 析、甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序等。因而，它可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性 (SNP)分析、突變分析、基因表達(dá)分析等。可利用通過(guò)本發(fā)明確立的皮膚基因卡試劑盒和基 因測(cè)試方法，通過(guò)檢查在皮膚功能、生理和病理方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的30個(gè)基因的表達(dá)更準(zhǔn) 確地評(píng)價(jià)皮膚狀況，和更準(zhǔn)確地和客觀地分類皮膚類型。進(jìn)一步地，該結(jié)果在選擇個(gè)性化皮 膚護(hù)理、化妝品和藥用化妝品中有幫助。特別地，在美容護(hù)理和化妝品領(lǐng)域中，它將有助于 診斷干燥、老化或敏感皮膚及護(hù)理和治療它們。使用通過(guò)本發(fā)明確立的皮膚基因卡試劑盒 和基因測(cè)試方法，可更準(zhǔn)確地診斷包括腫瘤、炎癥、濕疹、免疫相關(guān)性疾病、感染等多種皮膚 病，和可為個(gè)體皮膚病選擇個(gè)性化治療。另外，本發(fā)明皮膚基因卡和基因測(cè)試方法可用于各 種基因測(cè)試，這些基因測(cè)試包括簡(jiǎn)單和安全地診斷遺傳性基因疾病、身份鑒定和親子認(rèn)定、 在器官移植之前的基因分型等。
以下結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，所披露示例性實(shí)施方式的上述和其他方面、特征和優(yōu)勢(shì)將由此更加明顯，其中

圖1示出本發(fā)明的流程圖；圖2示出通過(guò)將紙質(zhì)繃帶(3M)附著在RNA卡(Goodgene公司)上制備的皮膚基 因卡，其作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式。圖3示出關(guān)于是否可從皮膚基因卡中獲得DNA的測(cè)試結(jié)果(泳道1 陰性對(duì)照，泳 道2 存儲(chǔ)一天后從皮膚基因卡中獲得的樣品，泳道3 存儲(chǔ)3天后從皮膚基因卡中獲得的 樣品，泳道4 存儲(chǔ)7天后從皮膚基因卡中獲得的樣品)；圖4示出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析結(jié)果，該分析結(jié)果是關(guān)于在室溫下長(zhǎng)期存儲(chǔ) 后DNA是否沒(méi)有降解地保持在利用皮膚基因卡獲得的皮膚細(xì)胞中，并且是關(guān)于它是否可以 被擴(kuò)增和分析(泳道1 存儲(chǔ)5天后從皮膚基因卡中獲得的樣品，泳道2 存儲(chǔ)15天后從皮 膚基因卡中獲得的樣品，泳道3 存儲(chǔ)30天后從皮膚基因卡中獲得的樣品)；圖5示出利用EasySpin試劑盒(Intron)，從利用皮膚基因卡獲得的皮膚樣品中分 離RNA的結(jié)果(泳道1 :lKbp大小的標(biāo)記物，泳道2 :1 μ g樣品，泳道3 :0. 5 μ g樣品)。圖6示出對(duì)β-肌動(dòng)蛋白基因進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR的結(jié)果，該逆轉(zhuǎn)錄是通過(guò)使 用利用試劑盒取樣1天、1周和1月之后獲得的RNA進(jìn)行的，以便調(diào)查在室溫下長(zhǎng)期存儲(chǔ)之 后RNA是否沒(méi)有降解地保持在利用皮膚基因卡獲得的皮膚細(xì)胞中(泳道1 100bp DNA標(biāo)記 物，泳道2 陰性對(duì)照，泳道3 存儲(chǔ)1天的樣品，泳道4 存儲(chǔ)1周的樣品，泳道5 存儲(chǔ)1月 的樣品)；圖7示出關(guān)于在采集帶有根部的毛發(fā)樣品之后，是否可從皮膚基因卡中分離出 DNA的測(cè)試結(jié)果(泳道1 :40Kbp T7DNA,泳道2 存儲(chǔ)1天的樣品，泳道3 存儲(chǔ)1月的樣品， 泳道4:存儲(chǔ)1年的樣品)；圖8示出關(guān)于在采集帶有根部的毛發(fā)樣品之后，是否可從皮膚基因卡中分離出 RNA的測(cè)試結(jié)果(泳道1 :RNA標(biāo)記物，泳道2 存儲(chǔ)1天的樣品，泳道3 存儲(chǔ)1月的樣品，泳 道4:存儲(chǔ)1年的樣品)；圖9示出關(guān)于特異基因的PCR是否可以在沒(méi)有從皮膚基因卡分離DNA的情況下進(jìn) 行的測(cè)試結(jié)果(泳道M:100bp標(biāo)記物，泳道1 陰性對(duì)照，泳道2 陽(yáng)性對(duì)照(HaCaT細(xì)胞系)， 泳道3:來(lái)自正常成年人的皮膚樣品)；圖10示出關(guān)于特異基因的RT-PCR是否可以在沒(méi)有從皮膚基因卡分離RNA的情況 下進(jìn)行的測(cè)試結(jié)果(泳道M:100bp標(biāo)記物，泳道1 陽(yáng)性對(duì)照(HaCaT細(xì)胞系)，泳道2:來(lái)自 正常成年人的皮膚樣品)；圖11示出關(guān)于是否可以使用從皮膚基因卡分離的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的測(cè)試結(jié)果 (泳道2 在300ng的β -肌動(dòng)蛋白，泳道3 在2000ng的β -肌動(dòng)蛋白，泳道4 在30，000ng 的β -肌動(dòng)蛋白，泳道M 100bp DNA標(biāo)記物，泳道5 =MMPl基因的樣品，泳道6 =COLlAl基因 的樣品，泳道7 彈性蛋白基因的樣品，泳道8 彈性蛋白酶基因的樣品，泳道9 :ΤΙΜΡ基因的 樣品，泳道10 抑彈性酶蛋白(elafin)基因的樣品)；圖12示出用于克隆從皮膚基因卡獲得的基因的基因擴(kuò)增結(jié)果(泳道1 :100bp DNA 標(biāo)記物，泳道2 =MMPl基因產(chǎn)物)；圖13示出用于克隆通過(guò)PCR擴(kuò)增的基因的載體圖譜；圖14示出在將MMPl基因克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體的測(cè)序結(jié)果；
圖15示出利用皮膚基因卡提取皮膚基因組DNA，和進(jìn)行PCR以對(duì)心血管病相關(guān)基 因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行分析，及隨后將產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果(泳 道1和13 IOObpDNA大小標(biāo)記物，泳道2和3 :eN0S基因，泳道4和5 :MTHFR基因，泳道6和 7 :AGT基因，泳道8 :ACE基因，泳道9和10 :AT1R基因，泳道11和12 ApoE基因)；圖16示出利用皮膚基因卡提取皮膚基因組DNA，和進(jìn)行PCR以對(duì)心血管病相關(guān)基 因進(jìn)行SNP分析，及隨后在用表3中給出的限制酶處理之后將產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上 電泳的結(jié)果(泳道1、12和13 IOObp DNA大小標(biāo)記物，泳道2和3 :eN0S基因，泳道4和5 AGT基因，泳道6和7 :ACE基因，泳道8 :AT1R基因，泳道9和10 :ApoE基因，泳道11和14 MTHFR 基因)；圖17示出利用皮膚基因卡提取皮膚基因組DNA，和對(duì)在癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用 的P53腫瘤抑制基因進(jìn)行PCR，及隨后將產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果(泳道1 IOObp DNA大小標(biāo)記物，泳道2 陰性對(duì)照，泳道3 陽(yáng)性對(duì)照，泳道4和6 測(cè)試樣品)；圖18示出將圖17的PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳、分離和純化該產(chǎn)物和使 用ABI 3130測(cè)序儀分析堿基序列以鑒定p53腫瘤抑制基因的突變(175C — A)的結(jié)果；圖19示出在利用皮膚基因卡獲得鱗狀細(xì)胞癌皮膚樣品和存儲(chǔ)之后，經(jīng)由寡聚核 苷酸微陣列對(duì)RNA樣品的基因分型結(jié)果(使用CanScan DNA芯片(Goodgene)鑒定鱗狀細(xì) 胞癌患者的P53基因(外顯子7、密碼子282CGG —TGG)的突變)；圖20示出用于使用從皮膚基因卡獲得的RNA鑒定特異基因表達(dá)的northern印跡 測(cè)試結(jié)果(泳道M:RNA標(biāo)記物，泳道1 來(lái)自正常成年人的樣品1，泳道2 來(lái)自正常成年人 的樣品2，泳道3 來(lái)自正常成年人的樣品3，泳道4 來(lái)自正常成年人的樣品4)；圖21示意性示出僅位于DNA的CpG 二核苷酸的5’ -位上的胞嘧啶殘基上的甲基 化；圖22示出特異基因上的甲基化發(fā)生的測(cè)試結(jié)果，其中該特異基因來(lái)自從皮膚基 因卡獲得的DNA (泳道1 :100bp DNA標(biāo)記物，泳道2 陰性對(duì)照，泳道3 從皮膚基因卡獲得 的樣品)；圖23示出化學(xué)修飾步驟，該步驟是用于使用從皮膚基因卡獲得的DNA樣品證實(shí)C 堿基在基因的特定部分甲基化(當(dāng)用亞硫酸氫鈉處理DNA樣品時(shí)，堿基序列中CpG島的未 甲基化的胞嘧啶堿基被尿嘧啶(胸腺嘧啶)取代)；圖24示出使用圖23中的亞硫酸氫鈉處理的DNA樣品對(duì)MYOD基因進(jìn)行PCR，和隨 后將產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果(泳道1 :100bp DNA大小標(biāo)記物，泳道2 =MYOD 基因PCR產(chǎn)物)；圖25示出圖24中的MYOD PCR產(chǎn)物的堿基測(cè)序結(jié)果，該測(cè)序通過(guò)使用ABI 3130 測(cè)序儀進(jìn)行，用以鑒定DNA是否被圖23中的亞硫酸氫鈉處理準(zhǔn)確甲基化(如箭頭所示，CpG 島的未甲基化的胞嘧啶堿基被尿嘧啶(胸腺嘧啶)取代)；圖 26 示出使用 AmpFl STR Profiler Plus PCR擴(kuò)增試劑盒(Applied Biosystem) 進(jìn)行 9 個(gè)短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座(D3S1358、D5S818、D7S820、D8S 1179、D13S317、D18S51、 D21S11、FGA和vWA)的多重PCR，并隨后通過(guò)在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果，用以利用 皮膚基因卡提取的皮膚基因組DNA進(jìn)行身份鑒定(親子鑒定)(泳道1 :500bp DNA大小標(biāo) 記物，泳道2和4 卡樣品，泳道5 陰性對(duì)照，泳道6 IOObp DNA大小標(biāo)記物)
圖27示出進(jìn)行兩個(gè)VNTR基因座(D1S80、D17S30)的PCR和隨后在1. 5%瓊脂糖 凝膠上電泳的結(jié)果，用以利用皮膚基因卡提取的皮膚基因組DNA進(jìn)行身份鑒定(親子鑒定) (泳道1-5 :D1S80,泳道1 =IOObp DNA大小標(biāo)記物，泳道2和4 卡樣品，泳道5 陰性對(duì)照， 泳道6-10 :D17S30,泳道6 IOObp DNA大小標(biāo)記物，泳道7、8和9 卡樣品，泳道10 陰性對(duì)
照)；圖 28 示出使用 ABI 3130 基因分析儀(Applied Biosystem)和 GeneMapper ID 程 序(Human Identification Detection,Applied Biosystems) (A :STR標(biāo)記物D3S1358 內(nèi)部 控制大小標(biāo)記物(internal control size marker)，B和C 測(cè)量來(lái)自卡樣品的STR標(biāo)記物 D3S1358PCR產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn))分析圖26和27的PCR產(chǎn)物的結(jié)果；圖29示出進(jìn)行代表性藥物代謝基因，CYP2D6基因的PCR，和通過(guò)PCR-限制性片段 長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)調(diào)查CYP2D6多態(tài)性，和對(duì)利用皮膚基因卡提取的皮膚基因組DNA測(cè)序 的結(jié)果；圖30示出基于圖29的結(jié)果計(jì)算CYP2D6等位基因頻率的結(jié)果；圖31示出進(jìn)行代表基因的單個(gè)和多重PCR，隨后將利用皮膚基因卡提取的皮膚基 因組DNA在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果(使用TNF-α基因進(jìn)行單個(gè)PCR ；泳道M =IOObp DNA大小標(biāo)記物，泳道9和10 卡樣品，常規(guī)泳道(lane conventional)從血液提取的DNA。 使用 5 個(gè)基因(C0MT、CYPlAl-I、CYPlBl、IL-6 和 VDR)進(jìn)行多重 PCR ；泳道 M IOObp DNA 大 小標(biāo)記物，泳道9和10 卡樣品，常規(guī)泳道從血液提取的DNA)；圖32示出將圖31的PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳并分離和純化產(chǎn)物之后 使用ABI 3130測(cè)序儀進(jìn)行堿基測(cè)序的結(jié)果，從而證實(shí)TNF-α基因的PCR結(jié)果不是假陽(yáng)性；圖33示出在如圖31中所述的多重-PCR之后使用ABI 3130基因分析儀 (GeneMapper 程序)分析，并用 SNaPshot Multiplex 試劑盒(Applied Biosystem)處理的 結(jié)果，用以鑒定利用皮膚基因卡提取的皮膚基因組DNA的SNP，；圖34示出對(duì)18個(gè)營(yíng)養(yǎng)基因組基因(涉及肥胖、抗氧化應(yīng)激、解毒、心血管病、激素 代謝、過(guò)敏癥和骨代謝的基因)進(jìn)行多重-PCR，并接著使用用于利用皮膚基因卡提取的皮 膚基因組DNA的AW(抗老化和保持良好狀態(tài)(Well-being))芯片(Goodgene)進(jìn)行成像分 析的結(jié)果(該結(jié)果表明激素代謝相關(guān)的CYPlAl基因的-3826A被G取代。)；圖35示出針對(duì)利用皮膚基因卡提取的皮膚基因組DNA，對(duì)引起基因疾病的其中一 個(gè)基因APC基因進(jìn)行PCR，接著將產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果(泳道1 :100bp DNA標(biāo)記物，泳道2 來(lái)自卡樣品的APC PCR產(chǎn)物)；圖36示出在將圖35的APC PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳和隨后分離和純 化該產(chǎn)物之后，使用ABI 3130測(cè)序儀，對(duì)APC基因的突變(1493G — A)的堿基測(cè)序的結(jié)果；圖37示出使用如實(shí)施例5中的皮膚基因卡獲得皮膚樣品、從其中合成cDNA、使用 對(duì)皮膚癌相關(guān)的基因MAGE特異的引物進(jìn)行PCR，和將產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié) 果(泳道1和9 IOObp DNA標(biāo)記物，泳道2和3 陰性對(duì)照，泳道4 陽(yáng)性對(duì)照，泳道5和8 卡樣品)；圖38示出從皮膚基因卡分離DNA和使用金黃色葡萄球菌(Staphylacoccus aureus) PCR試劑盒(Goodgene)分析葡萄球菌感染的結(jié)果(使用自動(dòng)堿基測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn) 物的分析結(jié)果表明受金黃色葡萄球菌的感染)；
圖39示出從使用皮膚基因卡獲得的樣品(肛門周圍)中分離DNA和使用12STD 多重PCR試劑盒(Goodgne)檢測(cè)性傳播疾病的結(jié)果(該結(jié)果表明受HPV的感染。泳道1 IOObp大小的標(biāo)記物，泳道2 來(lái)自樣品的PCR產(chǎn)物，泳道3 =STD B組(set)陽(yáng)性對(duì)照)；圖40示出使用GG HPV基因分型芯片(Goodgene)對(duì)HPV陽(yáng)性PCR產(chǎn)物成像分析 的結(jié)果，其中該P(yáng)CR產(chǎn)物來(lái)自實(shí)施例26中使用皮膚基因卡獲得的樣品(肛門周圍)(該結(jié) 果表明受HPV型11的感染)；圖41示出對(duì)DNA進(jìn)行的巢式PCR的結(jié)果，該DNA是通過(guò)傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) ^, ^ffli^^Sia^ZA^W^^SE (wart-like patch) 的皮膚樣品中獲得的(泳道1 :100bp DNA大小標(biāo)記物，泳道2 陰性對(duì)照，泳道3 陽(yáng)性對(duì)照， 泳道4:來(lái)自從患者中獲得的樣品的PCR產(chǎn)物)；圖42示出使用利用皮膚基因卡獲得的樣品對(duì)MMPl基因(涉及皮膚狀況和健康的 一個(gè)基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果；圖43示出使用利用皮膚基因卡獲得的樣品對(duì)AQP3基因(涉及皮膚狀況和健康的 一個(gè)基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果；圖44示出使用利用皮膚基因卡獲得的樣品對(duì)Has3基因(涉及皮膚狀況和健康的 一個(gè)基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果；圖45示出使用利用皮膚基因卡獲得的樣品對(duì)酪氨酸酶(涉及皮膚狀況和健康的 一個(gè)基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果；圖46示出使用利用皮膚基因卡獲得的樣品對(duì)TRPl基因(涉及皮膚狀況和健康的 一個(gè)基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果；和圖47示出創(chuàng)建為年齡數(shù)據(jù)庫(kù)(database for ages)的MMPl基因的表達(dá)譜。
具體實(shí)施例方式[最佳方式]下文參考其中示出示例性實(shí)施方式的附圖，更全面地描述示例性實(shí)施方式。然而， 本披露內(nèi)容可以以多種不同形式體現(xiàn)，而不應(yīng)當(dāng)理解為限制于在此提出的示例性實(shí)施方 式。相反地，為了使本披露內(nèi)容徹底且完全，提供了這些示例性實(shí)施方式，并向本領(lǐng)域中的 技術(shù)人員全面表達(dá)了本披露內(nèi)容的范圍。在本說(shuō)明書(shū)中，為了避免掩蓋示出的實(shí)施方式，省 略了眾所周知的特征和技術(shù)的詳述。在此使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述特定實(shí)施方式的目的，而不是要限制本披露內(nèi)容。 如在此使用的，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”也傾向于包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另外 明確指出。而且，術(shù)語(yǔ)，一、一個(gè)等的使用不表示對(duì)量的限制，而是表示存在至少一個(gè)所提及 的術(shù)語(yǔ)(item)。術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”等不暗示任何特定順序，而是包括它們以識(shí)別單個(gè)元 件。此外，術(shù)語(yǔ)第一、第二等的使用不表示任何順序或重要性，而是術(shù)語(yǔ)第一、第二等可用于 區(qū)分一個(gè)元件與另一個(gè)。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，當(dāng)本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“包含”或“包括”時(shí)，它 們具體指存在所述特征、區(qū)域、整體、步驟、操作、元件，和/或組件，但不排除存在或添加一 個(gè)或多個(gè)其他特征、區(qū)域、整體、步驟、操作、元件、組件，和/或其組。除非另外限定，在此使用的所有術(shù)語(yǔ)(包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ))與本領(lǐng)域技術(shù)人員 通常理解的意思相同。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，諸如通常使用的字典中定義的那些術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)解釋為具有與它們?cè)谙嚓P(guān)領(lǐng)域和本披露內(nèi)容上下文中的意思一致的意思，而不應(yīng)當(dāng)按理想化或 過(guò)度正式的意義進(jìn)行理解，除非本文中有明確定義。本發(fā)明涉及能夠獲得、運(yùn)送和檢查處于最佳狀況的人皮膚樣品以便可以充分保存 包括在其中的基因的試劑盒(以下稱為皮膚基因卡)、使用該試劑盒進(jìn)行基因測(cè)試的方法、 將該試劑盒應(yīng)用于不同領(lǐng)域，例如醫(yī)學(xué)、美容護(hù)理、整容術(shù)、遺傳學(xué)等中的方法。本發(fā)明的發(fā)明人已注意到通過(guò)充分獲得皮膚樣品和檢查與皮膚功能、生理和病理 相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)或突變，可確切地了解個(gè)體皮膚狀況。因而，他們旨在確立獲得能夠 進(jìn)行此種基因測(cè)試的處于最佳狀況的皮膚樣品的方法。為此，1)基于本發(fā)明的發(fā)明人申請(qǐng)專利權(quán)的RNA卡和DNA卡來(lái)設(shè)計(jì)皮膚基因卡，并確立 其制備方法。2)確定使用該卡的最佳皮膚取樣方法。3)確立存儲(chǔ)和遞送皮膚樣品的條件。4)確立從所得皮膚樣品中充分分離DNA和RNA的方法和cDNA合成條件。5)確立重要的皮膚相關(guān)基因的基因測(cè)試方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn) 錄(RT)-PCR、實(shí)時(shí)PCR、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)、自動(dòng)化堿基測(cè)序、DNA微陣列、 甲基化特異性PCR(MSP)等。6)確立系統(tǒng)，以便通過(guò)利用皮膚基因卡和5)的測(cè)試方法檢查基因可準(zhǔn)確地和客 觀地分類皮膚類型，且個(gè)性化皮膚護(hù)理、化妝品和藥用化妝品可基于該結(jié)果進(jìn)行選擇。特別 地，集中于檢測(cè)和治療干燥、老化、光老化和敏感皮膚。7)確立系統(tǒng)，以便利用皮膚基因卡和5)的測(cè)試方法可診斷多種疑難皮膚病，例如 炎癥、濕疹、免疫相關(guān)性疾病、感染、牛皮癬等，且可選擇最佳療法。8)確立系統(tǒng)，以便皮膚基因卡和5)的測(cè)試方法可用于檢測(cè)遺傳性基因疾病和各 種基因測(cè)試，這些基因測(cè)試包括個(gè)體鑒定、親子認(rèn)定、器官移植之前的基因分型等。這些總結(jié)在圖1中。根據(jù)本發(fā)明的皮膚基因卡的示意圖在圖2中示出。本發(fā)明的皮膚基因卡包含帶部 分和卡(襯底)部分。通過(guò)將帶附于人體和從人體分離帶，該帶被用于獲得人體組織，該卡 部分用于保護(hù)、存儲(chǔ)和運(yùn)送帶。該帶可以是任何類型的膠帶。在一種實(shí)施方式中，可使用 對(duì)人體無(wú)害且允許醫(yī)學(xué)用途的繃帶(bandage tape)，特別是柔軟的、低粘性紙質(zhì)繃帶。尤 其，可使用3M的低粘性紙質(zhì)繃帶1500、1522或9874。襯底(卡)部分是用焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理的合成樹(shù)脂、紙卡或薄膜、載玻片、塑料制品(plastic)、或纖維(fiber)制品， 該襯底部分可與DNA和RNA形成穩(wěn)定化合物，以便阻止DNA和RNA分別被脫氧核糖核酸酶 和核糖核酸酶降解，及以便在室溫下穩(wěn)定地存儲(chǔ)它們。進(jìn)一步地，可將襯底部分浸入在適當(dāng) 形式和濃度的裂解緩沖液或水溶性殼聚糖溶液中。優(yōu)選地，人體樣品可以是人皮膚。該皮膚樣品可取自身體的任何部分。進(jìn)一步地， 人體樣品可以是取自皮膚-粘膜界面(skin-mucosa interface)的毛發(fā)或粘膜，如嘴或肛 門周圍，或嘴里面。雖然用于根據(jù)本發(fā)明的基因測(cè)試的人皮膚樣品可使用本發(fā)明皮膚基因卡獲得時(shí)， 但是用于獲得少量皮膚樣品的任何其他凝膠或帶型裝置或卡可用于根據(jù)本發(fā)明的基因測(cè)試。
樣品中靶物質(zhì)組分可以是包括DNA在內(nèi)的指示基因的任何物質(zhì)。從皮膚樣品中分 離DNA可使用洗脫緩沖液(elution buffer)進(jìn)行。然而，任何方法都可用于此目的。更優(yōu)選地，樣品中靶物質(zhì)組分可以是RNA。從皮膚樣品中分離RNA和mRNA可使用 洗脫緩沖液進(jìn)行。然而，任何洗脫法都可用于此目的。[本發(fā)明的方式]現(xiàn)描述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)。以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)僅用于示例目的，而不是要限制本披露 內(nèi)容的范圍。實(shí)施例的修改和應(yīng)用包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。〈步驟1>獲得皮膚樣品的皮膚基因卡的制備及其性能測(cè)試在這個(gè)步驟中，制備了皮膚基因卡并確立了它的制備方法。進(jìn)一步地，確立了使用 該卡獲得最佳皮膚樣品的方法及存儲(chǔ)和運(yùn)送該樣品的條件。進(jìn)一步地，確立了從皮膚樣品 分離DNA和RNA的條件，和合成CDNA的條件。另外，驗(yàn)證了分離的DNA和RNA的質(zhì)量和數(shù)量。詳細(xì)情況如下。實(shí)施例1.制備皮膚基因卡本發(fā)明的皮膚基因卡包含帶部分和襯底(卡)部分。該帶用于通過(guò)附于人體和從 人體移去來(lái)獲得人體的組織，且卡部分用于保護(hù)、存儲(chǔ)和運(yùn)送帶。該帶可以是任何類型的 膠帶。在一種實(shí)施方式中，可使用對(duì)人體無(wú)害且允許醫(yī)學(xué)用途的繃帶，特別是柔軟的、低粘 性紙質(zhì)繃帶。尤其，可以使用3M的低粘性紙質(zhì)繃帶1500、1522或9874。襯底(卡)部分 可以是用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的合成樹(shù)脂、紙卡或薄膜、載玻片、塑料制品、或纖維制 品，該襯底部分可與DNA和RNA形成穩(wěn)定化合物，以便阻止DNA和RNA分別被脫氧核糖核酸 酶和核糖核酸酶降解，并在室溫下穩(wěn)定存儲(chǔ)它們。進(jìn)一步地，可將襯底部分浸入在適當(dāng)形式 和濃度的裂解緩沖液或水溶性殼聚糖溶液中。使用高壓釜(autoclave)將該卡在120°C和 2大氣壓下浸入在用DEPC處理的水、殼聚糖和裂解緩沖液中30分鐘，并在使用前對(duì)該卡進(jìn) 行滅菌和干燥。這是為了阻止DNA和RNA在分離期間被DNase和RNase污染。并且，殼聚 糖、裂解緩沖液，及DNA和RNA卡可長(zhǎng)時(shí)間保護(hù)核酸(圖2)。下表示出皮膚基因卡的組成和材料。
權(quán)利要求
一種皮膚基因卡，包含帶部分，通過(guò)將所述帶部分附著于人體并從人體分離而獲得來(lái)自人體的組織；和卡部分，用于保護(hù)、存儲(chǔ)和運(yùn)送所述獲得的組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡，其中所述帶是對(duì)人體無(wú)害且允許用于醫(yī)學(xué)用途 的低粘性紙質(zhì)繃帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡，其中所述卡部分包括選自由紙質(zhì)卡、載玻片、 OHP薄膜、塑料、聚酯、纖維和金屬組成的組的材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的皮膚基因卡，其中所述卡部分包括紙質(zhì)卡，并且所述紙質(zhì)卡 是通過(guò)使用高壓釜滅菌，隨后浸入分別用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的細(xì)胞裂解緩沖液、尿 酸和/或殼聚糖中并干燥而制得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的皮膚基因卡，其中所述紙質(zhì)卡浸入在濃度為0.02%(w/v)到 0. 25% (w/v)的水溶性殼聚糖溶液中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡，其中所述來(lái)自人體的組織是毛發(fā)或粘膜，所述 毛發(fā)或粘膜取自皮膚_粘膜界面，如嘴或肛門周圍、或嘴里。
7.一種利用皮膚基因卡獲得人體組織的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡的帶部分附著于人體取樣部分的皮膚上；和 從所述皮膚分離所述帶部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用皮膚基因卡獲得人體組織的方法，在所述附著之前，進(jìn) 一步包括，使用脫皮凝膠除去取樣部分的皮膚上或周圍的角質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用皮膚基因卡獲得人體組織的方法，其中，將附著于人體 皮膚的所述帶部分在1分鐘至12小時(shí)之后分離。
10.一種用于從人體組織分離DNA的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡獲得人體組織；和 使用DNA提取方法分離DNA。
11.一種用于從人體組織分離RNA的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡獲得人體組織；和 使用RNA提取方法分離RNA。
12.一種在沒(méi)有對(duì)分離的DNA進(jìn)一步純化的情況下使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基 因卡進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法。
13.一種在沒(méi)有對(duì)分離的DNA進(jìn)一步純化的情況下使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基 因卡進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR的方法。
14.一種利用皮膚基因卡進(jìn)行身份鑒定的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡獲得人體組織并從獲得的組織中分離基因組DNA ；對(duì)使用分離的基因組DNA選擇的展現(xiàn)短串聯(lián)重復(fù)(STR)多態(tài)性的基因進(jìn)行多重PCR;和鑒定通過(guò)PCR擴(kuò)增的基因信息。
15.一種利用皮膚基因卡進(jìn)行藥物基因組測(cè)試的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡獲得人體組織并從獲得的組織中分離基因組DNA ；對(duì)使用分離的基因組DNA選擇的藥物代謝相關(guān)的基因進(jìn)行多重PCR ；和 鑒定通過(guò)PCR擴(kuò)增的基因信息。
16.一種用于營(yíng)養(yǎng)基因組測(cè)試的試劑盒，包含 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡；和用于基因的多重PCR的正向和反向引物，所述基因選自由肥胖、抗氧化應(yīng)激、解毒、心 血管病、激素代謝、過(guò)敏和骨代謝相關(guān)的基因組成的組。
17.一種用于診斷疾病的試劑盒，包含 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡；和 靶向疾病相關(guān)的基因的正向和反向引物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述疾病是皮膚癌且所述基 因是黑素瘤抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述疾病是皮膚傳染病且所 述基因是病原體特異性基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述病原體是金黃色葡萄球 胃(Staphylococcus aureus)0
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述疾病是性傳播疾病且所 述基因是病原體特異性基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述病原體選自由淋病奈瑟 菌(N. gonorrhea)、砂眼披衣菌(C. trachomatis)、生殖支原體(M，genitalum)、人型支原體 (M.hominis，)、解脲脲原體(U. urealyticum)、和陰道毛滴蟲(chóng)(T. vaginalis)組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述病原體選自由杜克雷 嗜血桿菌(H. ducreyi)、陰道加德納菌(G. vaginalis)、梅毒螺旋體(T. pallidum)、單純 皰疫病毒(Herpes simplex virus)、白色念珠菌(Candida albicans)和人乳頭狀瘤病毒 (humanpapi 1 lomavirus) (HPV) 白勺 。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于診斷疾病的試劑盒，其中所述病原體是肺結(jié)核菌 (Tubercle bacillus)特異性基因。
25.一種利用皮膚基因卡的皮膚基因表達(dá)測(cè)試的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚基因卡獲得人體組織并從獲得的組織中分離基因組RNA ；對(duì)使用分離的基因組RNA選擇的皮膚狀況和健康相關(guān)的基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR ；和 鑒定通過(guò)PCR擴(kuò)增的基因的表達(dá)水平。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的皮膚基因表達(dá)測(cè)試的方法，其中所述基因是選自由基質(zhì) 金屬蛋白酶1(MMP1)、原膠原Al、金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)、彈性蛋白、彈性蛋白 酶、抑彈性酶蛋白、超氧化物岐化酶l(MnS0D、S0D1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、p53、端粒酶、透 明質(zhì)酸合成酶3 (HAS3)、水通道蛋白3 (AQP3)、絲聚合蛋白原、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白 1 (TRP-I)、內(nèi)皮素-1、腫瘤壞死因子_ α (TNF- α )、I-CAM、主要組織相容性復(fù)合體2 (MHC2)、 3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A(HMG-CoA)、脂肪酸合酶、乙酰輔酶A羧化酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 1、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、 5-α還原酶和雄激素受體或管家基因組成的組的基因。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的皮膚基因表達(dá)測(cè)試的方法，其中所述基因的表達(dá)水平通過(guò) 實(shí)時(shí)PCR鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于基因測(cè)試的新的皮膚基因卡、使用該基因卡獲得DNA和RNA及進(jìn)行各種基因測(cè)試的方法及其實(shí)踐應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明人已開(kāi)發(fā)能夠簡(jiǎn)單、安全和迅速地從人皮膚、毛發(fā)或粘膜獲得樣品并能夠在室溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定存儲(chǔ)和運(yùn)送所得樣品中包括的DNA和RNA的皮膚基因卡。使用所得DNA和RNA可以進(jìn)行各種基因測(cè)試，該基因測(cè)試包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR、實(shí)時(shí)PCR、測(cè)序、雜交、DNA芯片分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變分析、啟動(dòng)子甲基化分析、基因表達(dá)分析等。該基因皮膚測(cè)試結(jié)果可用于疾病預(yù)后、營(yíng)養(yǎng)基因組測(cè)試、藥物基因組測(cè)試、法醫(yī)檢驗(yàn)如身份鑒定、基因疾病診斷、皮膚病診斷等。此外，通過(guò)客觀評(píng)價(jià)皮膚或毛發(fā)狀態(tài)，可以為美容護(hù)理、美容學(xué)、皮膚病學(xué)和臨床實(shí)踐中的實(shí)踐應(yīng)用確立個(gè)性化的化妝品和皮膚護(hù)理系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101990578SQ200880128393
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2008年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月4日
發(fā)明者文宇哲, 樸根良, 李振榮, 申貞植 申請(qǐng)人:固德基因公司