專利名稱：一種核酸快速提取試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從生物樣本中快速提取DNA或RNA的試劑盒。
背景技術(shù)：
自PCR技術(shù)1985年在美國問世以來，被迅速廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，特別是近幾年，隨著個體化醫(yī)療概念的提出和在臨床的推廣，通過RT-PCR來研究患者樣本中不同基因表達(dá)水平的差異，從而找出關(guān)鍵基因或者預(yù)后基因變化趨勢，幫助醫(yī)生指導(dǎo)用藥，更使得RT-PCR進(jìn)入了臨床診療。然而，RT-PCR擴(kuò)增必須用RNA做模板才能進(jìn)行。目前經(jīng)典的RNA抽提方法是TRIZOL試劑，直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整 性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。但是因為用TRIZOL試劑抽提RNA，需用到較多有揮發(fā)性的化學(xué)試劑，對實驗者有害，因此目前也有利用吸附過柱的方法提取RNA的商業(yè)化試劑盒，因為需要蛋白酶K處理過程，一般需要經(jīng)過3-4小時的抽提過程，才能進(jìn)入后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)。隨著RT-PCR不斷在臨床推廣和應(yīng)用，人們對快速簡便的RNA純化方法的需求越來越強(qiáng)烈。RNA的完整性和純度不再是考量RNA抽提純化方法的唯一標(biāo)準(zhǔn)，只要快速、簡便，不影響后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)，都是可以接受的RNA抽提純化方法。醫(yī)院病理科存在大量各種疾病甲醒固定石臘包埋組織(formalin fixed andparaffin embedded tissues, FFPET),為分子病理研究提供了大量的信息來源。然而福爾馬林固定后的蠟塊包埋組織RNA降解嚴(yán)重，存檔FFPET組織切片取量有限，傳統(tǒng)提取RNA步驟繁雜，提取過程損失嚴(yán)重等都制約了石蠟組織在分子病理學(xué)中的研究應(yīng)用。如何高效、高質(zhì)量提取微量石蠟組織中RNA對利用石蠟組織進(jìn)行分子研究及診斷至關(guān)重要。傳統(tǒng)從石蠟組織里抽提RNA需要先用二甲苯脫蠟，然后用無水乙醇去除二甲苯，脫蠟過程繁瑣，至少需要3 4小時，而且二甲苯是有機(jī)溶劑，對實驗操作者的身體有害。脫完蠟后，標(biāo)本也需要再經(jīng)過3 4小時的抽提，才能進(jìn)入后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)。Chelex-100是一種由苯乙烯和苯二乙烯共聚體組成的螯合樹脂，其懸液在堿性環(huán)境(pHIO 11)和100°C條件下，可導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂并使DNA變性釋放出來，并且Chelex-100可高選擇性的結(jié)合多價陽離子，去除樣品和緩沖液中的多價金屬離子，避免煮沸過程中模板DNA的降解。Chelex-100提取DNA具有經(jīng)濟(jì)、簡便、高效等優(yōu)點，目前已廣泛被用于從全血或血液、精液或精斑、混合斑、毛發(fā)、培養(yǎng)細(xì)胞等提取DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供一種核酸快速提取試劑盒。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供該試劑盒的使用方法。
本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供該試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種核酸快速提取試劑盒，所述試劑盒包含研磨棒、提取液、抽提柱、微型超濾器和離心管；其中，所述提取液為含有chelex-100的DEPC水溶液。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的提取液中含有2 50g/100ml的chelex-100 和 O. 1% DEPC0本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述的chelex-100的濃度為2 30g/100ml，優(yōu)選為 3 10g/100ml。本發(fā)明還涉及該試劑盒的使用方法，所述方法包括以下步驟(I)取少量生物樣本，所述生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本 (2)將生物樣本置于chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的濃度為I 80g/100ml ；(3)80 100°C條件下加熱I 50分鐘；(4)將抽提柱放入離心管中，將步驟(3)中獲得的液體加入到抽提柱中，1000 20000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2 120秒；(5)收集離下的液體，用于PCR或RT-PCR反應(yīng)。其中，優(yōu)選的，所述的抽提柱為，在抽提柱中底部有一層起物理阻擋的膜。該制備方法進(jìn)一步優(yōu)選為所述的加熱溫度為90 100°C，優(yōu)選90 95°C ;所述的加熱時間為5 30分鐘，優(yōu)選8 10分鐘；所述的離心的時間為2 120秒，優(yōu)選10 30秒；所述的離心的轉(zhuǎn)速為5000 20000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選10000 20000轉(zhuǎn)/分鐘，更優(yōu)選15000 20000轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明所述的試劑盒在用于提取病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本中的DNA或RNA的應(yīng)用。下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說明本發(fā)明的試劑盒含有研磨棒、提取液、抽提柱、微型超濾器和離心管；其中研磨棒、抽提柱、微型超濾器和離心管均為市售，抽提柱優(yōu)選為市售圓柱形柱子，離心管優(yōu)選為市售
I.5mleppendorf管，微型超濾器優(yōu)選市售截留分子量小于20000道爾頓的超濾器。當(dāng)采用組織細(xì)胞樣本提取RNA時，研磨步驟需要在冰上進(jìn)行，以減少RNA的降解。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢為I.本發(fā)明的試劑盒的使用方法簡單，時間短，且不使用有害有機(jī)溶劑。傳統(tǒng)方法中一般從石蠟包埋組織中抽提DNA或RNA需要先用二甲苯脫蠟，然后用無水乙醇去除二甲苯，所用的時間長，過程繁瑣，至少需要3 4小時才能完成，而且二甲苯是有機(jī)溶劑，對人體有害。脫完蠟后，標(biāo)本需要再經(jīng)過蛋白酶K的處理，以去除蛋白質(zhì)，這個過程也需要3 4小時，故通常方法抽提石蠟包埋組織中DNA或RNA，進(jìn)入后續(xù)PCR或RT-PCR反應(yīng)，需要6 8小時以上。本發(fā)明的方法簡便易行，不使用揮發(fā)性有害有機(jī)溶劑二甲苯，不會對實驗人員造成傷害，并且所需時間大為縮短，僅需10余分鐘即可完成；
2.本發(fā)明的試劑盒采用高溫加熱對DNA或RNA進(jìn)行提取，不僅使石蠟變成液態(tài)，而且使組織中的蛋白質(zhì)變性，從而使DNA或RNA被釋放出來，省去了需要蛋白酶K水解需要3 4個小時的過程；3.本發(fā)明的試劑盒可將液態(tài)石蠟和chelex-100截留在抽提柱的膜上，從而消除了液態(tài)石蠟和chelex-100對PCR或RT-PCR反應(yīng)的不良影響，提高了 PCR或RT-PCR反應(yīng)的
靈敏度。下面對本發(fā)明的具體實施方式
做進(jìn)一步的解釋和說明，但并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。本發(fā)明所用的試劑均為市售試劑，所用的實驗儀器均為實驗室常用儀器。
具體實施例方式實施例I
I.用兩種方法提取石蠟包埋組織切片中的DNA，每種方法抽提3個標(biāo)本，平行比較。I.用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的石蠟組織切片DNA提取試劑盒抽提石蠟包埋組織切片中的DNA:a)取2片5um的醫(yī)用石蠟(型號BX12M311398，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司生產(chǎn))包埋組織切片放入I. 5mL的離心管中。b)加入Iml 二甲苯，震蕩混勻，55°C水浴10分鐘。13000轉(zhuǎn)5分鐘，吸棄上清。c)重復(fù)第2步一到三次。d)加Iml無水乙醇，震蕩混勻。13000轉(zhuǎn)5分鐘，吸棄上清。e)重復(fù)第4步一次。f)將沉降下來的標(biāo)本烘干。g)加入 200 μ I Buffer I,混勻。h)加入25 μ I Proteinase K，震蕩混勻。55°C水浴消化過夜。i) 13000轉(zhuǎn)離心5分鐘，上清轉(zhuǎn)移到一干凈的I. 5mL離心管中。j)加入220 μ I Buffer 2，震蕩混勻。70°C水浴10分鐘k)加入220 μ I無水乙醇，混勻。I)將抽提柱放入收集管中，移入第5步的混合液體，室溫靜置3分鐘。m) 13000轉(zhuǎn)離心2分鐘，把液體重新轉(zhuǎn)入柱子，重新過柱。η) 13000轉(zhuǎn)離心2分鐘，棄液體。O)把柱子移入新的收集管內(nèi)，加入500 μ I Buffer 3。P)把柱子移入新的收集管內(nèi)，13000轉(zhuǎn)離心I分鐘，棄液體。加入600μ1 WashBuffer。(Wash Buffer按包裝預(yù)加適量無水乙醇)q) 13000 轉(zhuǎn)離心 I 分鐘，棄液體。加入 600 μ I DNA Wash Buffer。r) 13000轉(zhuǎn)離心I分鐘，棄液體。13000轉(zhuǎn)離心2分鐘，開蓋揮發(fā)4-5分鐘。s)、把柱子移入I. 5mL的帶蓋離心管中，在膜中央加入40 μ I Elution Buffer (須70°C預(yù)熱)。室溫靜置3分鐘。t) 13000轉(zhuǎn)離心I分鐘，收集液體，取5ul用于PCR反應(yīng)。2.采用本發(fā)明的試劑盒提取石蠟包埋組織切片中的DNA
a.取2片5um的醫(yī)用石蠟(型號BX12M311398，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司生產(chǎn))包埋組織切片；b.置于200ul的溶液I中，所述的溶液為10% chelex-100 (sigma公司)的水溶液；c. 90 0C條件下加熱20分鐘；d.將抽提柱放入離心管中，將步驟3中獲得的液體加入到抽提柱里，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；所述的抽提柱為e.收集離下的液體，取5ul用于PCR反應(yīng)。2. DN A鑒定方法
2. IDNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳鑒定因為石蠟切片中的D N A含量較低，用普通瓊脂糖凝膠電泳方法不能檢測到DNA的量，因此將用每種方法抽提的三個標(biāo)本基因組DNA，各取20 μ L混合，真空抽去部分水分后,加5μ L的DNA loading buffer混勻上樣,在2%的瓊脂糖凝膠中80V電泳30min,在紫外凝膠成像儀下觀察所提取DNA基因組的質(zhì)量并拍照存檔。2. 2熒光定量PCR檢測所提取DNA基因組的濃度選擇針對人β -2actin基因組DNA的引物和TaqMan突光探針，采用PrimerExpress軟件自行設(shè)計，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列見表I。表I :引物和探針的序列表
權(quán)利要求
1.一種核酸快速提取試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含研磨棒、提取液、抽提柱，微型超濾器和離心管；其中，所述提取液為含有chelex-100的DEPC水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸快速提取試劑盒，其特征在于，所述的提取液中含有2 50g/100ml 的 chelex-100 和 O. 1% DEPC0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸快速提取試劑盒，其特征在于，所述的chelex-100的濃度為 2 30g/100ml，優(yōu)選為 3 10g/100ml。
4.權(quán)利要求I所述的試劑盒的使用方法，所述方法包括以下步驟 (1)取少量生物樣本，所述生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本； (2)將生物樣本置于chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的濃度為I 80g/100ml ； (3)80 100°C條件下加熱I 50分鐘； (4)將抽提柱放入離心管中，將步驟(3)中獲得的液體加入到抽提柱中，1000 20000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2 120秒； (5)收集離下的液體，用于PCR或RT-PCR反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抽提柱為，在抽提柱底部有一層起物理阻擋的膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的加熱溫度為90 100°C，優(yōu)選90 950C ;所述的加熱時間為5 30分鐘，優(yōu)選8 10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的離心的時間為2 120秒，優(yōu)選10 30秒。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的離心的轉(zhuǎn)速為5000 20000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選10000 20000轉(zhuǎn)/分鐘，更優(yōu)選15000 20000轉(zhuǎn)/分鐘。
9.權(quán)利要求I所述的試劑盒在用于提取病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本中的DNA或RNA的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種核酸快速提取試劑盒。本發(fā)明的試劑盒中包含研磨棒、提取液、抽提柱，微型超濾器和離心管；其中，所述提取液為含有chelex-100的DEPC水溶液。本發(fā)明還涉及該試劑盒的使用方法，及在用于提取病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本中的DNA或RNA的應(yīng)用。使用該試劑盒提取的核酸，其含量和質(zhì)量能很好的滿足后續(xù)PCR、RT-PCR和測序反應(yīng)。本發(fā)明很好地克服了現(xiàn)有核酸提取繁瑣耗時的局限性，且更加安全環(huán)保。
文檔編號C12N15/10GK102807976SQ20111014324
公開日2012年12月5日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者熊慧, 謝立群, 陳嘉錚 申請人:上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司